胡蘿卜1個新4CL基因的克隆、進(jìn)化及表達(dá)分析

羅慶 鐘秀來 盧松

摘要：胡蘿卜（Daucus carota L.）在NCBI（美國國家生物信息中心）上總共公布了13個4-香豆酰-CoA連接酶（4CL）基因，而在芹菜轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)1個4CL基因，利用該基因序列設(shè)計1對克隆引物，成功得到1個新胡蘿卜4CL基因，命名為Dc4CL-1。Dc4CL-1基因長1 635 bp，編碼544個氨基酸，位于胡蘿卜基因組第2染色體上。進(jìn)化樹分析顯示，Dc4CL-1基因聚集在與木質(zhì)素合成有關(guān)的4CL Ⅰ亞族。實時熒光定量PCR轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在胡蘿卜根生長發(fā)育期間，Dc4CL-1基因在野生胡蘿卜中高表達(dá)，而在栽培胡蘿卜中低表達(dá)。推測Dc4CL-1基因與胡蘿卜木質(zhì)素合成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：胡蘿卜;4CL基因;克隆;進(jìn)化;表達(dá)

中圖分類號： S631.201 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）15-0089-06

胡蘿卜（Daucus carota L.）是一種在全世界廣泛栽培的、重要的根類蔬菜[1-2]。然而，高木質(zhì)素含量會降低胡蘿卜肉質(zhì)根的口感和質(zhì)量[3]。有研究表明，4-香豆酰-CoA連接酶（4-coumarate-CoA ligase，簡稱4CL）是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，是調(diào)控木質(zhì)素和黃酮類代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶[4-6]。在植物體上，苯丙烷類代謝途徑是一個非常重要的第2代謝途徑;而hydroxycinnamate-CoA硫酯是木質(zhì)素及其他重要苯丙烷類的前體物質(zhì)[7-8]。

目前，胡蘿卜基因組在NCBI（美國國家生物信息中心）上已公布、注釋發(fā)表了13個4CL基因[9]。但是，在芹菜（Apium graveolens L.）轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)有1個4CL基因已發(fā)表的胡蘿卜4CL基因非常不同。因芹菜與胡蘿卜同屬傘形科家族，據(jù)進(jìn)化樹分析表明，胡蘿卜與芹菜在分子水平上應(yīng)具有高度相似性。因此，推測胡蘿卜基因組中有可能存在新4CL基因。

本研究利用發(fā)現(xiàn)的芹菜4CL基因序列來設(shè)計引物，從野生胡蘿卜貴野中克隆得到1個新4CL基因，命名為Dc4CL-1基因;并構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行序列比對分析，預(yù)測其染色體定位等。實時熒光定量檢測Dc4CL-1基因在整個胡蘿卜根生長、發(fā)育過程中的表達(dá)水平。本試驗進(jìn)一步研究Dc4CL-1基因在胡蘿卜根木質(zhì)素合成中的作用，以期延伸其相關(guān)知識面及奠定相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生胡蘿卜貴野收集于貴州省貴陽市，栽培于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園藝研究所種質(zhì)資源圃，無明顯的肉質(zhì)根，且木質(zhì)素含量很高;Kuroda是一種在亞洲廣泛栽培的胡蘿卜品種，有明顯的肉質(zhì)根，且木質(zhì)素含量很低。將野生胡蘿卜貴野和栽培胡蘿卜Kuroda的種子播種于含蛭石混合物（土壤與蛭石體積比為3 ∶ 1）的塑料花盆中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)（晝、夜溫度分別為25、22 ℃，光—暗周期為12 h—12 h，光照度為 3 000 lx）。于種子發(fā)芽后第3、5、8、20、40、60、90天時，分別將野生、栽培胡蘿卜的根分離出來，立即用液氮處理，保存在-70 ℃冰箱中。

1.2 RNA提取及cDNA合成

采用RNA simple Total RNA kit試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取樣品中的總RNA，再用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的數(shù)量與質(zhì)量，采用ND-1000分光光度計（Nanodrop Technologies，Inc.）進(jìn)行總RNA的濃度測定，利用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成一鏈cDNA。將cDNA稀釋15倍，放在-20 ℃冰箱中保存，用于胡蘿卜Dc4CL-1基因的克隆及實時熒光定量分析。

1.3 胡蘿卜Dc4CL-1基因的克隆

根據(jù)芹菜Ventura轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的4CL基因序列，用Primer Primier 5軟件設(shè)計胡蘿卜Dc4CL-1基因的正反引物序列（Dc4CL-1F和Dc4CL-1R）[10]。引物序列如下：Dc4CL-1F：5′-ATGGAGAAATCAGGGTACGGGAGAG-3′;Dc4CL-1R：5′-TCAGATTTTGGCTCTGACTTGCTC-3′。擴增PCR體系均為25 μL，反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃ 變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，34個循環(huán);最后72 ℃延伸2 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，用PCR提純試劑盒提純、再回收目的片段（諾唯贊生物科技股份有限公司）?；厥蘸蟮哪康钠芜B接到pMD19-T載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Escherich coli）DH5α上，隨后進(jìn)行質(zhì)粒的酶切與鑒定，委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.4 序列比對和進(jìn)化分析

將NCBI上獲得的其他胡蘿卜4CL蛋白序列與本研究克隆得到的序列用DNAMAN軟件對所有序列進(jìn)行多重比較分析。用MEGA 5軟件分別通過鄰接法（NJ）、最大簡約法（MP）、最大似然法（ML）、最小進(jìn)化法（ME）、非加權(quán)配對平均法（UPGMA）算法對胡蘿卜4CL及其他物種的4CL蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹，并進(jìn)行進(jìn)化分析[11]。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR采用高特異性染料法定量PCR檢測試劑盒（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），按照操作說明進(jìn)行，于熒光定量PCR儀StepOnePlusTM中進(jìn)行3步法反應(yīng)程序?qū)崟r熒光定量PCR擴增，使用 2-ΔΔCT值法來分析該基因的相對表達(dá)水平。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min;95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，95 ℃延伸 10 s，40個循環(huán);熔點曲線為65～95 ℃，每 0.5 ℃ 增加1個梯度。DcActin1作為胡蘿卜內(nèi)參對照基因，其正向序列為5′-CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT-3′，反向序列為5′-CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG-3′[12-13]。根據(jù)克隆到的Dc4CL-1基因序列用Primer Primier 5軟件的設(shè)計定量引物（正向序列，5′-TCTCCCAACTCACTTCACTTCCC-3′;反向序列，5′-TTCAACATTTTCATCAAACCCCA-3′）。在非冗余蛋白序列（Nr）數(shù)據(jù)庫中，利用BLASTn搜索得到分離的Dc4CL-1基因（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。qPCR-RT數(shù)據(jù)用IBM Statistics 20.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析（ANOVA），所有數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜Dc4CL-1基因的序列分析

根據(jù)芹菜Ventura轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的4CL基因序列，設(shè)計1對正反引物序列（Dc4CL-1F和Dc4CL-1R），在野生胡蘿卜貴野中成功擴增、克隆得到1個新4CL基因片段，命名為Dc4CL-1。Dc4CL-1基因長1 635 bp，編碼544個氨基酸;而芹菜4CL基因長1 620 bp，編碼539個氨基酸（圖1、圖2）。野生胡蘿卜Dc4CL-1基因與芹菜4CL基因有89.79%的同質(zhì)性（圖1）。據(jù)胡蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，此基因位于胡蘿卜基因組第2染色體上（GenBank：LNRQ01000002.1，區(qū)域：21 933 004～21 937 748，共4 745 bp），包含5個內(nèi)含子和6個外顯子。然而，本研究得到的胡蘿卜Dc4CL-1基因的DNA全長4 749 bp，同樣包含5個內(nèi)含子和6個外顯子（圖3）[14]。結(jié)果還顯示，此基因序列中包含完整的4CL保守結(jié)構(gòu)域及AMP結(jié)合位點及CoA結(jié)合位點。此外BLASTp預(yù)測胡蘿卜基因結(jié)果顯示出，4CL蛋白是一種似4-香豆酰-CoA連接酶，同樣Dc4CL-1蛋白屬于AFD（adenylate forming domain）Ⅰ亞族（圖3）。

2.2 Dc4CL-1蛋白的進(jìn)化分析

本研究發(fā)現(xiàn)，在NCBI上共注釋、公布了13個胡蘿卜4CL基因，但是其中有2個4CL基因（GenBank：XM_01739850.1和XM_017398506.1）具有相同的開放閱讀框（ORF）和氨基酸序列（XP_017253996.1和XP_017253995.1）。因此，舍棄前者（XP_017253996.1），將其他12個胡蘿卜基因蛋白（GenBank：XP_017215228.1、XP_017215416.1、XP_017222125.1、XP_017229849.7、XP_017232211.1、XP_017234894.1、XP_017243044.1、XP_017244257.1、XP_017253062.1、XP_017253894.1、XP_017253995.1、XP_017258809.1）與芹菜及得到的胡蘿卜Dc4CL-1蛋白一起構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析。本研究運用MEGA 5軟件對此14個蛋白用不同方法進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果如圖4所示。進(jìn)化樹顯示，Dc4CL-1、Ag4CL蛋白質(zhì)及其中1個胡蘿卜4CL蛋白質(zhì)（XP_017253894.1）在5種不同進(jìn)化分析方法下均位于同一分支上（圖4，以方框標(biāo)注出）。蛋白序列比對結(jié)果顯示，Dc4CL-1蛋白質(zhì)和其他物種的4CL蛋白質(zhì)序列具有72.98%的同源性（圖4）。由此推測， Dc4CL-1是胡蘿卜4CL基因家族的新成員，其功能與其他成員具有相似性。

2.3 胡蘿卜Dc4CL-1基因的表達(dá)分析

胡蘿卜Dc4CL-1和4CL蛋白質(zhì)都屬于參與木質(zhì)素合成的AFDⅠ亞族成員;與前人在水稻[5]、煙草[15]的研究結(jié)果相一致。已有研究表明，在胡蘿卜生長、發(fā)育期間，野生胡蘿卜根中木質(zhì)素含量高于栽培品種[16-17]。本研究結(jié)果表明，在胡蘿卜生長、發(fā)育期間，Dc4CL-1基因在野生品種中表達(dá)量較高，而在栽培品種中表達(dá)水平較低。尤其在種子發(fā)芽后60、90 d，其表達(dá)水平差異極顯著（P<0.01）。野生品種在發(fā)育期間，Dc4CL-1基因相對表達(dá)水平變化沒有明顯的規(guī)律，但均較高（圖5）。

3 討論與結(jié)論

木質(zhì)素是一種自然無組織的高分子聚合物，在維管植物中起著支撐其結(jié)構(gòu)剛度和維持顏色的重要作用[18-19]。生產(chǎn)樹木中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)或含量的變化對于造紙工業(yè)和生物燃料的生產(chǎn)也具有重要性[6，20]。然而，肉質(zhì)根作為胡蘿卜可食用的器官，木質(zhì)素含量過高會降低胡蘿卜根的口感及質(zhì)量[17，21]。外源赤霉素[17]、處理加工[22]及成熟化[21]都會影響胡蘿卜根中木質(zhì)素的含量。此外，胡蘿卜木質(zhì)素含量的降低對其繁殖、栽培也有一定的影響。有研究顯示，香蕉（Masa nana）A基因組中有25個4CL基因同源序列，其中Mu4CL15在煙草中過表達(dá)能夠增加煙草植株莖稈的木質(zhì)素含量和抗倒伏能力，推測Mu4CL15極有可能提高香蕉植株假莖的抗倒伏能力。有研究表明，胡蘿卜木質(zhì)素大部分沉積在胡蘿卜木質(zhì)部導(dǎo)管的細(xì)胞壁上;在胡蘿卜發(fā)育過程中[23]，木質(zhì)素含量呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢，推測這可能與木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量降低有關(guān)[24]。本研究結(jié)果顯示，Dc4CL-1基因在野生胡蘿卜中高表達(dá)，而在栽培胡蘿卜中低表達(dá)，推測Dc4CL-1基因與胡蘿卜木質(zhì)素的合成有關(guān)。

4CL基因是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵限速酶的調(diào)控基因，且4CL與植物腺苷酸構(gòu)成酶的大亞組有關(guān)，由多拷貝基因編碼;在其他蔬菜作物中已有相關(guān)報道，如白楊、水稻和煙草[5，15]。4CL氨基酸序列的系統(tǒng)重建顯示，4CL蛋白分別劃入Ⅰ、Ⅱ 2個亞組;其中，Ⅰ亞組4CLs與木質(zhì)素及其他苯丙脂類的合成有更近的關(guān)系，而Ⅱ亞組4CLs與黃酮類有更近的關(guān)系[4-5，25]。有關(guān)于海南龍血樹（Dracaena cambodiana）的研究表明，Dc4CL1屬于ClassⅢ類4CL，血竭誘導(dǎo)劑能夠誘導(dǎo)Dc4CL1基因的表達(dá)，為進(jìn)一步闡明Dc4CL1基因在海南龍血樹中類黃酮生物合成中的功能提供幫助[26]。在水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，4CL基因家族有5位成員，其中Os4CL2屬于TypeⅡ亞組，其他4位成員屬于TypeⅠ亞組;研究還得出，Os4CL3表達(dá)量的降低顯著影響木質(zhì)素的合成且效果最好，降低植物體木質(zhì)素含量，降低植株株高[27]。這些試驗結(jié)果均表明，可以通過調(diào)節(jié)4CL基因的表達(dá)量來調(diào)控植物木質(zhì)素的含量。

本研究通過BLAST比對和系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，野生胡蘿卜中的新4CL屬于Ⅰ亞組。無論野生胡蘿卜，還是栽培胡蘿卜，Dc4CL-1基因的表達(dá)水平與胡蘿卜的總木質(zhì)素含量呈正相關(guān)關(guān)系，由此推測 Dc4CL-1基因可能參與胡蘿卜木質(zhì)素的合成。但有報道說，根據(jù)胡蘿卜基因組注釋，4CLs均屬于Ⅰ亞組。胡蘿卜木質(zhì)素的合成是一個復(fù)雜的過程，其不僅受多基因的影響，同時也受栽培環(huán)境、管理方式的影響，須要全方位深入研究。因此，須要發(fā)掘胡蘿卜其他新4CL基因，乃至與木質(zhì)素合成的相關(guān)基因都研究彼此之間的相關(guān)性及各基因的具體功能，并進(jìn)行相關(guān)深入的研究，為植物木質(zhì)素的相關(guān)研究提供更加有力的理論基礎(chǔ)。

[14]Xu Z S，Tan H W，Wang F，et al. CarrotDB：a genomic and transcriptomic database for carrot[J]. Database，2014，2014：bau096.

[15]Souza C A，Barbazuk B，Ralph S G，et al. Genome-wide analysis of a land plant-specific acyl：coenzyme A synthetase（ACS）gene family in Arabidopsis，poplar，rice and Physcomitrella[J]. New Phytologist，2008，179（4）：987-1003.

[16]Tan G F，Wang F，Ma J，et al. Identification and analysis of the characteristics of a wild petaloid male-sterile carrot Wuye-BY[J]. Plant Genet Resour，2017，18（6）：1216-1220.

[17]Wang G L，Que F，Xu Z S，et al. Exogenous gibberellin enhances secondary xylem development and lignification in carrot taproot[J]. Protoplasma，2017，254（2）：839-848.

[18]Dixon R A，Chen F，Guo D，et al. The biosynthesis of monolignols：a“metabolic grid”，or independent pathways to guaiacyl and syringyl units？[J]. Phytochemistry，2001，57（7）：1069-1084.

[19]Koskinen O. Catalytic hydrogenation and hydrogenolysis of lignin model compounds in ionic liquid environment[D]. Helsinki：University of Helsinki，2017.

[20]陳 磊，陳漢平，陸 強，等. 木質(zhì)素結(jié)構(gòu)及熱解特性[J]. 化工學(xué)報，2014，65（9）：3626-3633.

[21]Schafer J，Trierweiler B，Bunzel M. Maturation-related changes of carrot lignins[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2018，98（3）：1016-1023.

[22]Howard L R，Griffin L E. Lignin formation and surface discoloration of minimally processed carrot sticks[J]. Journal of Food Science，1993，58（5）：1065-1067.

[23]舒海燕，孫 威，魏 卿，等. 香蕉4-CL基因Mu4CL15的功能鑒定[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，36（8）：3025-3033.

[24]王廣龍. 胡蘿卜肉質(zhì)根發(fā)育過程中激素和品質(zhì)的變化規(guī)律研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[25]Hu W J，Kawaoka A，Tsai C J，et al. Compartmentalized expression of two structurally and functionally distinct 4-coumarate：CoA ligase genes in aspen （Populus tremuloides）[J]. Proceedings of the National Academy of ences，1998，95（9）：5407-5412.

[26]夏棟楠，朱家紅，李輝亮，等. 海南龍血樹4-香豆酸輔酶A連接酶基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 分子植物育種，2018，16（23）：7656-7662.

[27]Gui J S，Shen J H，Li L G. Functional characterization of evolutionarily divergent 4-coumarate：coenzyme a ligases in rice[J]. Plant Physiology，2011，157（2）：574-586.