植物灰霉病及抗性研究進(jìn)展

陳宇春 陳敏 王其剛

摘要：灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起的真菌病害之一，對(duì)農(nóng)業(yè)產(chǎn)品及園林觀賞植物均有較大危害。對(duì)植物灰霉病的癥狀、發(fā)病規(guī)律及發(fā)病條件、防治措施、抗病分子水平等方面的研究情況進(jìn)行了概述。對(duì)灰霉病的防治研究主要針對(duì)果蔬類(lèi)，而對(duì)園林觀賞植物的研究較少，這為后期對(duì)灰霉病抗性的研究提供新的研究方向。

關(guān)鍵詞：灰霉病;致病機(jī)制;防治方法;抗病基因;基因工程

中圖分類(lèi)號(hào)： S432.4+4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）15-0042-10

灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起的真菌病害之一，對(duì)農(nóng)業(yè)產(chǎn)品及園林觀賞植物均有較大危害，其侵染范圍廣泛，可危害茄科、葫蘆科、薔薇科等470多種植物[1]。一旦侵染農(nóng)作物可引起植株葉片大量脫落，果蔬腐爛，產(chǎn)品質(zhì)量下降，侵染花卉植物，如月季（Rosa hybrida），主要侵染其花，嚴(yán)重時(shí)也會(huì)對(duì)幼枝和葉片造成危害，可引起花瓣變褐色、腐爛、萎蔫，直至整個(gè)花朵褐變枯萎[2-3]，從而降低花卉觀賞價(jià)值。番茄（Lycopersicon esculentum）是全國(guó)栽培廣泛、消耗量最大的蔬菜作物之一，番茄感病后，發(fā)病部位會(huì)產(chǎn)生灰白色或灰褐色霉層，甚至爛苗、爛果，從而降低產(chǎn)量[4]。而草莓（Fragaria×ananassa）營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與其獨(dú)特的口味深受人們喜愛(ài)，但灰霉病對(duì)其侵染十分嚴(yán)重，危害草莓地上部的所有器官，包括果實(shí)、花器（包括花瓣、雄蕊、花萼）、果柄、葉片、葉柄等，其中以果實(shí)受害最重[5]。

近年來(lái)，灰霉病主要采用化學(xué)防治，如使用多菌靈、速克靈等化學(xué)藥劑。但由于使用防治的藥物在一定程度上也會(huì)抑制植物的生理活性，長(zhǎng)期使用化學(xué)試劑會(huì)降低植物對(duì)病源菌的抵御能力[6]，使防治效果大大降低，而且大量使用化學(xué)試劑不僅成本高，還會(huì)加大對(duì)環(huán)境和人體健康的危害。所以，研發(fā)新的抗病產(chǎn)品以及使用生物防治的方法是控制灰霉病的有效途徑。

1 灰霉病的概述

1.1 發(fā)病癥狀

在月季植物中，灰霉病主要侵染月季的花器，嚴(yán)重時(shí)也會(huì)侵染葉片，花的萼片易感病，發(fā)病后變褐壞死[3]。幼蕾發(fā)病時(shí)，會(huì)先在花托部位產(chǎn)生水漬狀不規(guī)則小斑，然后稍凹陷形成灰黑色病斑，最后擴(kuò)展至整個(gè)花蕾，導(dǎo)致病蕾無(wú)法開(kāi)放，變褐色腐爛枯死。葉片感病，首先在葉緣和葉尖產(chǎn)生水漬狀不規(guī)則淡褐色斑點(diǎn)，然后稍下陷變褐并腐敗。當(dāng)灰霉菌侵染芍藥時(shí)會(huì)導(dǎo)致其葉片干枯壞死，莖部凹陷折倒，花瓣褐色腐爛，甚至整個(gè)植株死亡[7]。在黃芩植物中，主要侵染葉片和莖稈，形成褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致整株葉片干枯，植株死亡[8]。侵染農(nóng)作物如番茄，葉片發(fā)病主要從葉尖開(kāi)始，剛開(kāi)始出現(xiàn)水漬狀，淺褐色邊緣不規(guī)則深淺相間的輪紋;侵染莖時(shí)也會(huì)出現(xiàn)水浸狀小點(diǎn)，后擴(kuò)展為長(zhǎng)橢圓形或長(zhǎng)條形斑，淺褐色;侵染果實(shí)會(huì)導(dǎo)致果皮呈灰白色、水漬狀，然后變軟腐爛[9]（圖1）?；颐咕秩静葺畷r(shí)，癥狀發(fā)生過(guò)程不大相同，如侵染果實(shí)時(shí)最初在果面上出現(xiàn)淺褐色水漬狀斑點(diǎn)，進(jìn)而形成褐色病斑，近圓形或不規(guī)則形;侵染花瓣和萼片染病后變褐，先是形成水漬狀小斑點(diǎn)，后擴(kuò)展為不規(guī)則病斑，嚴(yán)重時(shí)整朵花和花序枯死（圖2）。病原菌易于在草莓花藥和花瓣組織內(nèi)定殖[10-12]。根據(jù)以上可以得出，灰霉菌不管是侵染經(jīng)濟(jì)作物還是糧食作物，均會(huì)造成其產(chǎn)量及商業(yè)價(jià)值大大降低。

1.2 灰霉病病菌的分類(lèi)

灰霉病是灰葡萄孢侵染引起的真菌病害之一，是半知菌亞門(mén)葡萄孢屬，其有性態(tài)為富克爾葡萄孢盤(pán)菌（Botryotinia fuckeliana）[13]。葡萄孢屬的真菌共包括23個(gè)種，其中1個(gè)雜交種，大多數(shù)的侵染范圍較窄，只能感染1個(gè)或同1個(gè)植物屬中的一些親緣關(guān)系近的物種[14]，而灰霉菌的侵染范圍較廣，可侵染400多種植物。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)灰葡萄屬中其他具有致病能力的致病菌，例如草莓葡萄孢（B. frgariae）、卡羅萊納葡萄孢（B. caroliniana）、中華葡萄生葡萄孢（B. sinoviticola）[15]?；颐咕且粋€(gè)復(fù)合種，種內(nèi)不同菌株間的生物學(xué)特性及抗性均有較大差異，所以對(duì)灰霉菌的分類(lèi)主要從生物學(xué)性狀、致病力、抗藥性這3個(gè)方面著手。據(jù)最新研究報(bào)道，使用電子顯微技術(shù)觀察灰霉菌不同菌株之間孢子表面紋飾的異同也可作為區(qū)分灰霉菌的一項(xiàng)指標(biāo)[16]，這為深入研究灰霉菌的類(lèi)群劃分提供了理論基礎(chǔ)。

1.3 灰霉病病菌的形態(tài)

在紫皮石斛上首次報(bào)道灰霉菌的侵染，通過(guò)在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察到灰霉菌形態(tài)，初為白色，漸變?yōu)榈S色，菌落稀疏，能產(chǎn)生黑色小菌核。肉眼可見(jiàn)在菌落表面有許多小球狀物，即分生孢子梗頂端的分生孢子團(tuán)。分生孢子梗著生于菌絲上，在分生孢子?；颗c菌絲之間會(huì)產(chǎn)生橫隔膜群生或單生，（135～）270～1 500 μm×12.5～22.5 μm，不分枝或分枝，直立，有橫隔，分枝處稍有縊縮現(xiàn)象，分生孢子梗頂端細(xì)胞膨大，其上著生小梗（圖3），無(wú)色或淡色，分生孢子圓形、橢圓形、卵圓形等多種形狀油[17]（圖4）。

1.4 發(fā)病規(guī)律及發(fā)病條件

灰霉病在低溫高濕的環(huán)境下容易暴發(fā)。病害主要表現(xiàn)為病菌從萼毛、花梗的氣孔或傷口處入侵，向果梗上蔓延，果皮呈灰白色水漬狀軟腐，濕度大時(shí)果面產(chǎn)生大量灰色霉層。病菌以菌絲體和菌核形式在植株病部、病殘?bào)w或遺留在土壤中越冬，成為主要初侵染源，灰霉病菌是一種兼性寄生菌[3，18]。病菌與菌核分別在2～31、3～27 ℃下萌發(fā)，菌絲最適溫度為20～24 ℃，當(dāng)溫度達(dá)到 15 ℃、相對(duì)濕度在85%以上即會(huì)發(fā)病。若溫度在20 ℃、相對(duì)濕度在90%以上時(shí)，病害迅速發(fā)生。一般在開(kāi)花結(jié)果初期，灰霉病進(jìn)入發(fā)病高峰，在病部產(chǎn)生的霉菌又通過(guò)氣流進(jìn)行更大范圍的傳染，3—5月及10月前后是灰霉病的主要發(fā)生時(shí)期。一般在密度過(guò)大、秧苗或植株生長(zhǎng)不良、空氣相對(duì)濕度過(guò)高時(shí)容易發(fā)生病害[9]。

2 致病機(jī)制

病菌以菌核為主要的越冬方式，部分菌絲體也可以在樹(shù)皮和冬眠芽上越冬。無(wú)論是植物體還是土壤中的溫度和濕度均可使其存活。菌核和分生孢子的抗逆性都很強(qiáng)，翌春氣候條件適宜時(shí)，越冬的分生孢子及菌核即可萌發(fā)產(chǎn)生新的分生孢子，其通過(guò)氣流即可傳播到花序及幼果穗上，當(dāng)植物幼嫩部位受到外界刺激后外滲物質(zhì)極易侵染萌發(fā)生成新一代孢子，此時(shí)大量的孢子可以進(jìn)行大規(guī)模的傳播?；颐咕秩揪哂泻荛L(zhǎng)的潛伏期，并且具有低溫致病性。在溫室條件下，該病主要以分生孢子進(jìn)行初侵染和再侵染，周年發(fā)生。在菌絲入侵植物表皮細(xì)胞的初期殺死植物細(xì)胞，從植物的死細(xì)胞中吸取營(yíng)養(yǎng)，以利于菌絲的進(jìn)一步侵入[19]（圖5）。

灰霉菌是一種典型的腐生型真菌，它可以產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶和其他許多有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如毒素是植物病原菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，病菌培養(yǎng)濾液經(jīng)三氯甲烷萃取后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，可得到粗毒素，對(duì)其進(jìn)行生物活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，能在番茄葉片上能產(chǎn)生與病菌接種的病斑相似的癥狀，可以顯著抑制胚根的生長(zhǎng)，并能夠?qū)е路延酌缡?。因此，灰葡萄孢毒素?duì)番茄植株具有明顯的毒害作用[20]。

3 防治措施

3.1 化學(xué)防治

目前，對(duì)灰霉病主要采用化學(xué)防治，其化學(xué)藥劑主要有2類(lèi)，一類(lèi)是治療性殺菌劑，如苯并咪唑類(lèi)（如多菌靈、二甲酰亞胺類(lèi)）和N-苯氨基甲酸酯類(lèi)（如多霉靈）;另一類(lèi)是保護(hù)劑，如百菌清、代森錳鋅、克菌丹等，其只起到預(yù)防的作用[22]。不同化學(xué)試劑對(duì)灰霉菌的防治效果也有所差異，據(jù)報(bào)道，在速克靈、多菌靈、乙霉威、代森錳鋅等4種農(nóng)藥中，前2種農(nóng)藥對(duì)灰葡萄孢的防治效果較好，但對(duì)于來(lái)自不同寄主的灰葡萄孢菌株，4種農(nóng)藥的防治效果各有高低，防效高低順序依次為多菌靈>速克靈>乙霉威>代森錳鋅[23]。灰霉菌的侵染會(huì)引起寄主體內(nèi)酶活性的差異，如不同灰葡萄孢接種草莓葉片后其體內(nèi)過(guò)氧化物酶同工酶（peroxidase，簡(jiǎn)稱(chēng)POD）、多酚氧化酶同工酶（polyphenol oxidase，簡(jiǎn)稱(chēng)PPO）、超氧化物岐化酶同工酶（superoxidedismutase，簡(jiǎn)稱(chēng)SOD）3種酶的活性均發(fā)生了明顯變化，并且不同寄主來(lái)源的灰葡萄孢株接種草莓后產(chǎn)生的同工酶譜帶在數(shù)目和顏色上都存在差異，其中POD的差異最為明顯，SOD的差異最小。苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，簡(jiǎn)稱(chēng)PAL）是植物體重要次級(jí)代謝內(nèi)烷類(lèi)代謝途徑中的限速酶和關(guān)鍵酶，PAL被認(rèn)為是與果蔬抗病反應(yīng)密切相關(guān)的酶類(lèi)[24]。將疫霉根腐病菌接種到不同的大豆品種上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗病野生大豆的根和莖中PAL活性顯著增強(qiáng)[25]，植株的抗病性提高。

除了使用農(nóng)藥防治病菌，也有研究人員使用生物源化學(xué)物來(lái)預(yù)防。植物源殺菌是從植物中提取出來(lái)的某些活性部分或有效成分，經(jīng)過(guò)分離純化加工而成的用于防治植物病害的藥劑，使用這些藥劑能降低對(duì)環(huán)境的污染以及對(duì)人體健康的危害。如葉艷英等研究表明，通過(guò)采用植物源殺菌劑也可用于防治植物病害，包括植物源殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、病毒抑制劑和殺線蟲(chóng)劑，植物中抑菌有效成分主要有四大類(lèi)，分別是萜類(lèi)化合物及其衍生物，生物堿、酰胺及蛋白質(zhì)等含氮含硫化合物，脂肪類(lèi)化合物，芳香族化合物，其試驗(yàn)結(jié)果表明，采用植物源殺菌劑對(duì)番茄、辣椒、草莓等灰霉病起到了一定的抑制作用。酚類(lèi)是植物次生代謝形成的一系列物質(zhì)，具有抑菌、抗氧化和清除自由基能力，被認(rèn)為是植物體最普遍的抗性相關(guān)物質(zhì)，而根皮苷和阿魏酸作為重要的酚類(lèi)物質(zhì)因其生化性質(zhì)而在植物抗病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[26]。有研究者將水楊酸和紅酵母單獨(dú)使用或組合使用進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，水楊酸和紅酵母組合使用能夠有效防治草莓灰霉病[27];也有研究者發(fā)現(xiàn)，控制殼聚糖的濃度也能有效防御黃瓜灰霉病的侵染情況[28]。除此之外，水楊酸還能引起多種植物對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等產(chǎn)生抗性，如黃瓜、馬鈴薯[29-30]。王媛等利用外源水楊酸噴灑擬南芥（Arabidopsis thaliana）植株并接種灰霉菌后發(fā)現(xiàn)，PAL和POD活性的提高引起木質(zhì)素含量的增加，從而阻止灰霉菌的進(jìn)一步入侵[31]。此外，Wang等采用氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)有助于對(duì)用β-氨基丁酸（BABA）處理的葡萄漿果中的灰霉菌進(jìn)行防御，通過(guò)BABA誘導(dǎo)確定抗病特異性形式，說(shuō)明氧化還原狀態(tài)的改變參與了BABA激活的葡萄漿果的防御反應(yīng)，在 10 mmol/L BABA處理引發(fā)葡萄漿果對(duì)番茄灰霉病的浸染產(chǎn)生了有效的抗病性[32]。

此外，物理方法如熱激處理對(duì)真菌性病原體灰霉菌同樣具有抑制作用[33]。電子輻射照處理能延緩草莓的發(fā)病情況，并能提高與抗病相關(guān)酶活性和抗病物質(zhì)的含量[34];Forges等試驗(yàn)表明，將草莓植物暴露于低重復(fù)劑量的UV-C可以提高它們對(duì)灰色的抵抗力霉菌，同時(shí)避免對(duì)植物產(chǎn)生任何明顯的負(fù)面影響[35]。隨著化學(xué)試劑的大量使用，不僅加重了環(huán)境污染，還使灰霉菌的抗藥性不斷提高，而物理防治方法在生產(chǎn)上并不便利，因此研發(fā)新的抗病品種及使用生物防治極其重要。

3.2 生物防治

目前，對(duì)灰霉病具有防治效果的微生物有真菌、鏈霉菌、細(xì)菌、酵母，可以控制番茄、辣椒、草莓、蘋(píng)果和葡萄等植物灰霉病的發(fā)生和危害，其中研究與應(yīng)用較為廣泛的有木霉、酵母等[36]。Tronsmo等用擬康木霉（T. pseudokoningii）來(lái)控制灰霉引起的草莓果實(shí)腐爛[36];Dik等通過(guò)比較3種不同微生物即哈茨木霉（T. harzianum） T39、出芽短梗霉（Aureobasidium pulluans）和淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）對(duì)黃瓜和番茄灰霉病防治效果，發(fā)現(xiàn)前2種微生物能夠降低植物的死亡率[37]。除了利用木霉來(lái)防治植物灰霉病，Harman等還利用哈茨木霉（T. harzianum）代替異菌脲和農(nóng)利靈有效防治了葡萄串腐病[38]。采用放線菌鏈霉菌科鏈霉菌屬產(chǎn)生的武夷菌素、磷氮霉素、白肽霉素、變構(gòu)霉素等將灰綠鏈霉菌（Streptomy griseovirides）的1個(gè)菌株制成Mycostop（灰綠鏈霉菌劑）菌劑，室內(nèi)和田間試驗(yàn)均表明其防治效果較高[39-40]。酵母菌是灰霉病微生物防治研究中的又一類(lèi)重要真菌，纖細(xì)假絲酵母和清酒假絲酵母可使灰葡萄孢造成的蘋(píng)果傷口腐爛降低50%[41]，羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）可作為草莓采后灰霉菌合成殺菌劑替代物[42]。

在生物防治灰霉病方法中，對(duì)細(xì)菌的使用也較為廣泛，如芽孢桿菌（Bacillu）在防御灰霉菌侵染草莓、梨（Pyrus pyrifolia）[43-44]等有重要作用。目前，在防治植物灰霉病中應(yīng)用最多的芽孢桿菌、枯草芽孢桿（B. subtilis）、多黏芽孢桿菌（B. polymyxa）、短體芽孢桿菌（B. pumilus）、等近10種[45]。現(xiàn)有的研究顯示，利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌素能夠有效地抑制灰霉菌的感染?？莶菅挎邨U菌除了對(duì)灰霉病有防治作用外，對(duì)采后柑橘青霉病、油桃褐腐病、香蕉冠腐病等均有拮抗作用[46-48]。

在使用微生物防治時(shí)，真菌、細(xì)菌等在寄主體內(nèi)也產(chǎn)生了相應(yīng)的生物防護(hù)機(jī)制，如拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)等作用[49]。如de Meyer等報(bào)道銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）和哈茨木霉T39能誘導(dǎo)菜豆（Phaseolus vulgaris）產(chǎn)生水楊酸使其獲得對(duì)灰霉病的抗性[50]。Daulagala等采用L-形式的假單胞菌（P. syringae），誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶并增強(qiáng)其對(duì)灰葡萄孢的抗性大白菜感染，使灰霉病病原體灰葡萄孢的感染具有增強(qiáng)抗性[52]。

植物還可以利用自身的免疫反應(yīng)來(lái)抵抗灰霉菌的感染，如病原/損傷相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫（P/DAMP triggered immunity，簡(jiǎn)稱(chēng)PTI）是植物抗灰霉病菌免疫反應(yīng)的重要組成部分[53]。已有的研究表明，病原/損傷相關(guān)分子模式（pathogen/damage-associated molecular patterns，簡(jiǎn)稱(chēng)P/DAMP）激發(fā)的免疫反應(yīng)PTI是植物抗灰霉病菌機(jī)制的主要組成部分[54-55]。采用微生物來(lái)防治微生物病害，不僅能降低成本，而且能降低對(duì)環(huán)境的污染。

3.3 農(nóng)業(yè)防治

3.3.1 選用抗病品種 選擇適應(yīng)當(dāng)?shù)厣L(zhǎng)的抗病品種，可降低培養(yǎng)成本。例如，對(duì)101份不同葡萄品種進(jìn)行葉片抗白腐病和灰霉病鑒定，結(jié)果顯示，不同葡萄品種對(duì)白腐病與灰霉病的抗性差異明顯，其中篩選出8份高抗灰霉病材料，分別為皇冠、雙優(yōu)、金星無(wú)核、康可、秦嶺桑葉、著色香、高妻、火星無(wú)核[55];選用29個(gè)不同品種的草莓對(duì)灰霉病的抗性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高抗品種有碩豐、甜查理、全明星、津美等4個(gè)品種[56]。研究結(jié)果可作為選育抗病新品種的親本，也為生產(chǎn)栽培選擇品種提供依據(jù)。

3.3.2 栽培防治 在植物栽培過(guò)程中，除了使用相應(yīng)的農(nóng)藥進(jìn)行病害防治，還可采用適當(dāng)?shù)脑耘嗉夹g(shù)與農(nóng)藥相結(jié)合，從而大大降低病害的發(fā)生率。如在溫室栽培月季，種植密度要合理，保證植株的通風(fēng)和透光。通過(guò)采取通風(fēng)換氣、加溫和科學(xué)灌溉等措施，溫室內(nèi)的相對(duì)濕度控制在85%以下，合理修剪，保持植株旺盛生長(zhǎng)，及時(shí)清除病部，科學(xué)施肥，平衡植株的營(yíng)養(yǎng)，施足有機(jī)肥，在保證氮肥的基礎(chǔ)上，增施磷、鉀肥，提高植株的抗病力。定期噴波爾多液、甲基硫菌靈、代森錳鋅等農(nóng)藥或施放防治灰霉病的煙霧劑，預(yù)防病害發(fā)生[2]。種植黃瓜時(shí)，大棚溫度控制在18～23 ℃;當(dāng)濕度超過(guò)90%時(shí)，灰霉病就會(huì)比較嚴(yán)重，但是當(dāng)溫度高于25 ℃時(shí)，發(fā)病反而會(huì)有一定程度的減輕，溫度高于30 ℃時(shí)不會(huì)發(fā)病，因此白天要適當(dāng)提高大棚溫度，從而對(duì)灰霉病進(jìn)行有效控制，通常情況下，結(jié)瓜期的最佳溫度設(shè)置：上午 27～30 ℃，下午20～25 ℃，晚上前半夜在17～19 ℃，后半夜在12～14 ℃[57]。

4 植物抗灰霉病分子水平研究

選擇具有抗病基因和抗病相關(guān)基因是培育具有抗病特性植物的關(guān)鍵。伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)植物灰霉病抗病相關(guān)基因及抗病基因的研究不斷深入。

頂頭孢霉引發(fā)劑和枯草桿菌蛋白酶（Acremonium strictum elicitor and subtilisin，AsES）是一種新型的細(xì)胞外激發(fā)子蛋白，是由草莓真菌病原體頂頭孢霉的有毒分離株SS71產(chǎn)生的，AsES差異性地影響對(duì)水楊酸反應(yīng)受損的突變體酸：茉莉酸和乙烯，這表明AsES通過(guò)這三者觸發(fā)了擬南芥對(duì)灰霉菌的防御反應(yīng)發(fā)信號(hào)途徑[58]。雷帕霉素是一種具有抗真菌活性的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)，并具有抗真菌特性;王彥通過(guò)試驗(yàn)對(duì)雷帕霉素作用靶標(biāo)蛋白相關(guān)基因進(jìn)行克隆，獲得灰葡萄孢菌的2個(gè)cDNA序列，即BcFKBP基因和BcTOR基因;將其作為靶細(xì)胞，利用RNA干擾技術(shù)，獲得了BcTOR基因的沉默菌株，該菌株能使草莓葉片、草莓果實(shí)和番茄果實(shí)的致病能力下降[59]。從黃瓜中誘導(dǎo)Ⅲ類(lèi)幾丁質(zhì)酶基因（CHI2），然后利用CHI2培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因黃瓜，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因黃瓜對(duì)灰霉菌具有抗性[60]。Liana利用粉紅黏帚菌處理番茄，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生了2種高表達(dá)蛋白，其中atpA基因的表達(dá)最高，且對(duì)番茄灰霉病產(chǎn)生抗性[61]。在灰霉菌侵染植物體時(shí)，對(duì)灰霉菌的6個(gè)BcPG基因功能分別進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)將BcPG1和BcPG2的基因敲除會(huì)導(dǎo)致突變體致病力顯著下降，這表明其在侵入植物組織的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[62-63]。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）測(cè)序分析篩選出在菌核形成階段高表達(dá)的基因BCIG09891、BClG14375、BClG12206、BcCVNH。這4個(gè)基因在菌核形成和致病階段均有表達(dá)，BcCVNH基因在致病階段表達(dá)上調(diào)，其他3個(gè)基因在菌核形成階段表達(dá)明顯上調(diào)，但敲除BcCVNH不會(huì)影響灰葡萄孢的菌核形成、菌落形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)酸等表型，但BcCVNH敲除轉(zhuǎn)化子的致病力明顯減弱，產(chǎn)孢量降低[68]。在番茄灰霉病抗性研究中，郭林霞構(gòu)建了35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）幾丁質(zhì)酶基因EuCHIT1的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷轉(zhuǎn)化和莖尖轉(zhuǎn)化2種轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入Micro-Tom番茄中，通過(guò)篩選轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)EuCHIT1基因在番茄中的表達(dá)可以提高番茄植株中病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因番茄植株的抗病性[65]。利用PCR技術(shù)從黑曲霉中擴(kuò)增并克隆了GO基因，然后將馬鈴薯病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（Prp1-1基因啟動(dòng)子）與其融合構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMGO，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因草莓，經(jīng)灰霉菌誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因草莓的抗性明顯提高[66]。

擬南芥為重要的模式植物，對(duì)其研究也較為廣泛，被克隆出多種抗病基因，如抗霜霉病基因RPP1、RPP2[67-68]、抗白銹病基因RAC1[69-70]、抗白粉病基因RPW8[71]等抗病基因。當(dāng)然，對(duì)其抗灰霉病基因的研究也有報(bào)道。早期Mengiste等通過(guò)篩選擬南芥突變體庫(kù)，獲得接種病菌后感病癥狀明顯加重的突變體——bos1（灰霉病敏感突變體），然后分離到受病菌誘導(dǎo)BOS1（BOTRYTIS SUSCEPTIBLE1）基因，明確BOS1基因編碼R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白并與茉莉酮酸酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑交互作用[72]。2004年，Veronese等通過(guò)篩選到灰霉病敏感的突變體bos2、bos3、bos4等，確定了BOS2、BOS3、BOS4是灰霉病菌侵染必需的3個(gè)新的獨(dú)立位點(diǎn)[73]。通過(guò)前期研究者的一系列試驗(yàn)，學(xué)者利用傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）和末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA end，RACE技術(shù)）獲得一新的擬南芥抗灰葡萄孢相關(guān)基因BRG1，陳展從擬南芥SALK庫(kù)中獲得BRG1基因的T-DNA插入突變體brg1，將突變體brg1和野生型Col-0進(jìn)行灰葡萄孢接種，發(fā)現(xiàn)野生型表現(xiàn)出典型的抗病性，而突變體植株表現(xiàn)出明顯的感病癥狀，初步確定BRG1基因與擬南芥對(duì)灰葡萄孢的抗性相關(guān)，然后通過(guò)構(gòu)建AtBRG1基因的表達(dá)載體pCAMBIA1300/BRG1將其整合到brg1突變體和 Col-0生態(tài)型基因組中，進(jìn)行接種試驗(yàn)后，進(jìn)一步確定了BRG1基因在擬南芥抗灰葡萄孢侵染過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[74]。

對(duì)番茄研究也較為豐富。在1926—1931年間，MacArthur利用形態(tài)標(biāo)記繪制了第1張番茄遺傳圖譜[75]，Tanksley等于1992年構(gòu)建了第1張番茄高密度的RFLP分子遺傳連鎖圖譜，該圖譜包括1 030個(gè)分子標(biāo)記、1 276個(gè)圖譜單位[76]。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，Suliman-Pollatschek等利用來(lái)自潘那利番茄（Lycopersicon pennellii）的永久群體，還構(gòu)建了擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）及單核苷酸多態(tài)性（SNP）圖譜[77]。張孝峰等對(duì)來(lái)自抗灰霉病多毛番茄PI134417的BC1分離群體進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）分析，共發(fā)現(xiàn)2個(gè)控制番茄葉部抗灰霉病的位點(diǎn)，1個(gè)位于LG3，為抗病QTL，另1個(gè)位于LG13，為感病QTL（圖6-A、圖6-B），采用同樣的方法發(fā)現(xiàn)控制番茄果實(shí)抗灰霉病的位點(diǎn)1個(gè)，為抗病QTL（圖6-C）[75]。

目前對(duì)草莓全部基因組尚未測(cè)序出來(lái)，但根據(jù)相關(guān)的分子標(biāo)記，已經(jīng)建立了幾張關(guān)于草莓的遺傳圖譜。在已有的研究中，研究者采用分離群體分組分析（bulked segregate analysis，簡(jiǎn)稱(chēng)BSA）方法隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱(chēng)RAPD）篩選出7個(gè)與草莓抗霉病基因Rpf1連鎖的標(biāo)記，其中距離最近的為1.7 cM，以及利用BSA法選擇AFLP標(biāo)記進(jìn)行篩選，得到4個(gè)與草莓抗炭疽病基因Rca2連鎖的標(biāo)記[78-79]。曹嫻根據(jù)Sargent等構(gòu)建的關(guān)于草莓遺傳連鎖圖譜[80]，對(duì)119對(duì)引物進(jìn)行連鎖分析，最后一個(gè)與抗灰霉病基因遺傳距離為15.9 cM的標(biāo)記UFFxa01H05，該標(biāo)記在Sargent等的連鎖圖譜中位于第四連鎖群，但其具體是在哪一側(cè)還有待深入研究[11]。

葡萄為四大水果之一，是第4種完成測(cè)序的開(kāi)花植物[81]。與白粉病相關(guān)的抗病基因如RPW8（包含RPW8.1、RPW8.2等2個(gè)基因形式）在宿主細(xì)胞氧化損傷介導(dǎo)的抗白粉病機(jī)制中起重要的作用[82]。另外在代謝調(diào)節(jié)過(guò)程中，葡萄RING-H2-TYPE泛素連接酶基因VpRH2在受到白粉病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著增加，研究也發(fā)現(xiàn)，VpRH2能與VpGRP2A直接作用參與調(diào)控，VpGRP2A過(guò)量表達(dá)后能提高VpRH2的表達(dá)水平，VpRH2卻抑制VpGRP2A的表達(dá)，這表明VpRH2與VpGRP2A相互調(diào)控參與葡萄對(duì)白粉病的防御反應(yīng)[83]。將圓葉葡萄和歐洲葡萄Dzhandzhal Kara雜交培育并通過(guò)篩選得到的RUN1REN1株系，該植株對(duì)白粉病表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗性，以致于該株系成為葡萄抗病基因挖掘的新型資源[84]。在葡萄的抗灰霉病研究中，多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting protein，簡(jiǎn)稱(chēng)PGIPs）能特異性地抑制真菌內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，簡(jiǎn)稱(chēng)PG），當(dāng)植株的葉片感染灰霉病時(shí)，PGIP能有效抑制病原菌的生長(zhǎng)和病斑擴(kuò)散[85]。在閆筱筱的研究中，其利用葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定獲得葡萄類(lèi)甜蛋白（TLPs）基因家族33個(gè)成員，按照染色體的位置命名為VvTLP1～VvTLP33，接種灰霉菌后發(fā)現(xiàn)部分基因的表達(dá)量增加[86]。

研究報(bào)道，張軍輝采用室內(nèi)離體葉片菌絲塊接種法，對(duì)雜交后代進(jìn)行灰霉病抗病性鑒定，結(jié)合已經(jīng)構(gòu)建的葡萄分子遺傳連鎖圖譜和抗性表型值，運(yùn)用區(qū)間作圖法對(duì)葡萄灰霉病抗性進(jìn)行QTL定位。在定位區(qū)段內(nèi)找出有關(guān)抗性的基因，篩選出3個(gè)抗病候選基因SGT1、MYB44、ERF023，而這3種抗病候選基因可能在抗病品種和感病品種灰霉病抗性中發(fā)揮著不同程度的作用[87]。這些抗病基因和抗病相關(guān)基因的研究不僅有助于明確該基因在植物中的作用，也為開(kāi)發(fā)培養(yǎng)新抗病品種方面奠定了重要基礎(chǔ)，并為其提供了理論依據(jù)。

月季作為世界四大切花之一[88]，在云南被廣泛種植，其在園林、食用和商業(yè)方面有著巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但深受灰霉病的危害?；颐咕秩驹录竞螅滏咦訒?huì)分泌大量的細(xì)胞壁降解酶，主要發(fā)揮作用的是果膠酶，寄主細(xì)胞壁中的果膠在灰霉菌內(nèi)聚半乳糖醛酸酶類(lèi)（PGs）的作用下分解為寡聚半乳糖醛酸苷（oligogalacturonides，簡(jiǎn)稱(chēng)OGs），從而使灰霉菌成功侵入植物[89-90]。目前，對(duì)月季灰霉病的研究較少，但對(duì)黑斑病[91]、白粉病的研究較多，其中對(duì)月季白粉病的研究較為深入[92-94]。周青等分別利用SSRs、AFLPs分別建立了二倍體月季分子連鎖圖譜和四倍體月季遺傳連鎖圖譜，這為月季后期的分子研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)[95-96]。植物模式識(shí)別受體根據(jù)其胞外結(jié)構(gòu)域的不同分為3類(lèi)，其中一類(lèi)細(xì)胞壁連接的類(lèi)受體激酶（WAK）類(lèi)受體可結(jié)合植物自身細(xì)胞壁降解的長(zhǎng)鏈寡聚半乳糖醛酸（OGs）激活下游的抗性反應(yīng)，阻止灰霉菌的進(jìn)一步侵害，由此推測(cè)WAK類(lèi)受體可能參與灰霉病的抗性反應(yīng)[97-99]。也有研究者對(duì)WAXs在月季中的作用進(jìn)行了深入研究。

5 展望

灰霉病作為危害植物的主要真菌病害之一，不管是對(duì)園林植物還是農(nóng)作物均帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)種植草莓面積較大，但由于灰霉病的危害，一般會(huì)造成減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)50%以上，這對(duì)果農(nóng)造成了不可小覷的經(jīng)濟(jì)損失[6]。葡萄在貯藏過(guò)程中也常遭受灰霉病的危害，嚴(yán)重時(shí)造成的產(chǎn)后損失高達(dá)50%[100]。灰霉病作為番茄栽培的重要病害，會(huì)造成番茄減產(chǎn)20%～30%，甚至?xí)哌_(dá)50%。在園林觀賞植物中，月季在長(zhǎng)途冷藏運(yùn)輸過(guò)程中也深受其害，通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在極端條件下可造成70%以上的采后損失?？梢?jiàn)，灰霉病對(duì)植物的危害性是不可忽視的。

目前，對(duì)灰霉病的防治主要采用化學(xué)防治，在生產(chǎn)上常用的化學(xué)試劑如多菌靈、二甲酰亞胺類(lèi)、多霉靈等不僅會(huì)造成化學(xué)藥物殘留危害人體，還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。在生物防治措施中常采用木霉對(duì)其進(jìn)行防治，但也主要針對(duì)經(jīng)濟(jì)作物，如番茄、草莓、葡萄等。園林觀賞植物也為我國(guó)帶來(lái)了不可忽視的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但對(duì)園林觀賞植物的防治的研究較少，僅對(duì)紅麻、芍藥等[7，101]有所研究。所以，今后應(yīng)當(dāng)關(guān)注觀賞植物灰霉病的相關(guān)研究。針對(duì)主要花卉（如月季、菊花、百合等）灰霉病的研究，不僅能提高花卉植物的觀賞價(jià)值與產(chǎn)量，同時(shí)還能提高花農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入，并且通過(guò)研究灰霉病的抗病基因及其機(jī)制，將為研發(fā)花卉抗病新品種、減少農(nóng)藥的使用、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面帶來(lái)顯著的效果。

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