外源脯氨酸對自然干旱下白刺葉片滲透調(diào)節(jié)與抗氧化酶活性的影響

馬鵬圖，蘇世平，李毅，種培芳，后有麗，魏斌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州 730070)

水分是干旱和半干旱生態(tài)系統(tǒng)中，決定生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的重要環(huán)境因素，而干旱半干旱區(qū)降水稀少、蒸發(fā)量大，導(dǎo)致土壤水分缺失嚴重，植物遭受干旱脅迫造成的傷害[1-2]，使得植物的生理生化特征發(fā)生一系列變化，對植物的生長發(fā)育也產(chǎn)生一定影響，甚至導(dǎo)致植物死亡[3].

脯氨酸(Proline，Pro)分子量小、水溶性大、對細胞無毒副作用，是植物體內(nèi)最重要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，它能夠清除植物體內(nèi)自由基，提高抗氧化物酶保護作用[4].外源Pro可以提高逆境脅迫下植物的抗氧化能力促進植物生長，從而提高植物耐受能力[5-6].白刺(Nitrariatangutorum)，蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬(NitrarisL.)強旱生小灌木，是我國西北荒漠、半荒漠植被的重要建群種之一，主要分布于西藏東北部、甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古西部、寧夏西部、陜西北部的湖盆地區(qū)和風沙沿線以及荒漠、沙地、鹽堿地和戈壁等[7-10].因其根系發(fā)達，抗風沙能力強，在防風固沙，水土保持以及涵養(yǎng)水源中起著重要作用[11-12].目前，白刺的研究主要集中于不同干旱脅迫對其生理特性的研究[13-14]、抗旱性研究[15-16]、抗旱優(yōu)良家系選擇[17]、掃描電鏡觀察[18]以及解剖學研究[19-20]等方面，但未見外源Pro對自然干旱下白刺葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及抗氧化酶活性的研究.本研究擬通過對處在干旱脅迫中的白刺苗木噴施一定質(zhì)量濃度的外源Pro，以期改變白刺體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化物酶活性，進而緩解其干旱脅迫程度，并揭示外源脯氨酸的作用機理.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于甘肅省武威市林業(yè)綜合服務(wù)中心良種繁育基地(E 103°51′，N 38°38′)，地處甘肅省河西走廊東北部，該區(qū)屬典型的溫帶大陸性荒漠氣候，海拔1 378 m，年均氣溫7.6 ℃，年均降水量113.2 mm，年均蒸發(fā)量2 604.3 mm，據(jù)2018年武威市氣象資料顯示，5～7月氣溫較高，降水較少，干旱較為嚴重，對植物的正常生長造成了一定的傷害.

1.2 試驗材料處理

1.2.1 外源Pro處理 選擇同一家系、大小、生長基本一致的白刺苗木，在2018年4月～7月停止對試驗地的人工灌溉，讓其自然干旱，土壤水分主要依靠自然降水.于7月13日進行外源Pro處理， Pro設(shè)置5個質(zhì)量濃度梯度(P1：50 mg/L、P2：100 mg/L、P3：150 mg/L、P4：200 mg/L、P5：250 mg/L)，以噴施蒸餾水為對照(CK)，重復(fù)3次，即每個處理3株白刺[21].用噴壺于無風晴天的時候在白刺葉片噴施Pro，以噴施部位掛滿水珠下滴為止.以處理當天為第0天，在處理前先采集白刺葉片，之后以Pro處理時間為準，分別在第1天、第3天、第6天和第9天[22]相同時間采樣，采后放入液氮罐中保存待用.同時在采樣期間，用塑料薄膜遮擋，防止自然降水的影響.

1.3 測定指標與方法

可溶性糖(soluble sugar)含量采用蒽酮-乙酸乙酯比色法測定[23]，可溶性蛋白(soluble protein)含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[24]，游離Pro含量、超氧物歧化酶(superoxide)活性以及過氧化物酶(peroxidase)活性分別采用磺基水楊酸提取法、氮藍四唑法和愈創(chuàng)木酚法測定[25]，過氧化氫酶(catalase)活性采用紫外吸收法測定[26]，葉綠素(chlorophyll)含量指標采用丙酮提取法測定[27].

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理及作圖，SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Duncan法進行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Pro對白刺葉片Pro含量的影響

隨著處理天數(shù)的增加，不同處理下白刺葉片游離Pro含量總體呈現(xiàn)升高的趨勢(圖1).與處理當天相比，各質(zhì)量濃度處理下Pro含量逐漸升高，但升高的幅度不同，CK升高幅度最小，除處理后第1天葉片Pro含量較處理當天有顯著降低(P<0.05)外，其余各處理不同處理天數(shù)間差異不顯著(P>0.05)；CK處理下白刺葉片Pro含量較第0天差異不顯著(P>0.05)；與CK相比，當Pro質(zhì)量濃度大于100 mg/L時，各質(zhì)量濃度處理下Pro含量均高于CK，且隨著Pro處理質(zhì)量濃度的增加，不同處理天數(shù)下白刺葉片Pro含量總體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢.其中，P5處理升高幅度最大，不同處理天數(shù)Pro含量顯著高于處理當天(P<0.05)，在處理后第9天時Pro含量升高到最大值，較處理當天上升了83.9%，達到顯著水平(P<0.05).

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，相同字母表示不同處理間差異不顯著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分別表示處理當天、處理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.圖1 外源Pro對自然干旱下白刺葉片游離脯氨酸含量的影響Figure 1 Effect of exogenous Pro on proline content in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

2.2 外源Pro對白刺葉片Chl含量的影響

隨著處理天數(shù)的增加，白刺葉片的Chl含量呈先下降后上升的趨勢(圖2)，與處理當天相比，各處理Chl含量總體呈下降的趨勢，但下降的幅度不同，CK下降幅度較小，除處理后第3天葉片Chl含量較處理當天有顯著降低(P<0.05)外，其余各處理天數(shù)間差異不顯著(P>0.05)；與CK 比較，一定處理天數(shù)內(nèi)，Pro處理下白刺葉片Chl含量高于CK.其中在P2處理下Chl含量下降幅度最大，上升幅度也較大，處理后第3天時Chl含量達降到最小值，較第0天下降了49.9%，差異顯著(P<0.05)；與 CK 相比，各處理天數(shù)下P1、P2、P3、P4和P5處理后葉片Chl含量均低于CK，其中，在處理后第9天時，P3處理葉片Chl含量最低，較CK降低了37.2%，且達到差異顯著水平(P<0.05).

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，相同字母表示不同處理間差異不顯著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分別表示處理當天、處理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.圖2 外源Pro對自然干旱下白刺葉片葉綠素含量的影響Figure 2 Effect of exogenous Pro on chlorophyll content in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

2.3 外源Pro對白刺葉片POD活性的影響

隨著處理天數(shù)的增加，不同質(zhì)量濃度處理的白刺葉片POD活性總體呈先上升后下降的趨勢(圖3)，與處理當天相比，各處理在處理后一定天數(shù)內(nèi)葉片POD活性均上升，但上升幅度不同，CK 上升幅度較小，其余處理天數(shù)下POD活性與處理當天無顯著性差異(P>0.05)； 且與CK相比，一定處理天數(shù)內(nèi)，Pro處理白刺葉片POD活性均高于CK.在P2和P3處理下，POD活性較CK達到了差異顯著水平(P<0.05)，且P2處理下POD活性上升幅度最大，下降幅度也較大，在處理后第3天時POD活性達到最大值，較第0天上升了26.4%；P1、P4和P5處理下各天數(shù)間POD活性較第0天差異不顯著(P>0.05)；處理后第9天時，P2處理下的POD活性較CK上升幅度最大，且上升了41.4%，達到顯著水平(P<0.05).

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，相同字母表示不同處理間差異不顯著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分別表示處理當天、處理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.圖3 外源Pro對自然干旱下白刺葉片過氧化物酶活性的影響Figure 3 Effect of exogenous Pro on peroxidase activity in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

2.4 外源Pro對白刺葉片SOD活性的影響

隨著處理天數(shù)的增加，白刺葉片SOD活性呈先上升后下降的趨勢(圖4)，與處理當天相比，各處理在處理后一定天數(shù)內(nèi)葉片SOD活性均上升，但上升幅度不同，CK 上升幅度較小，下降幅度也較小，除處理1 d后葉片SOD活性較處理當天差異顯著(P<0.05)外，其余處理天數(shù)下均無顯著性差異(P>0.05)；與CK相比，一定處理天數(shù)內(nèi)，不同質(zhì)量濃度Pro處理下白刺葉片SOD活性升高，但升高的幅度不同.其中，P2處理下SOD活性下降幅度最大，在處理后第9天時SOD活性降到最小，較第0天下降了24.6%，達到顯著水平(P<0.05)；CK處理下，處理后1 d SOD活性下降，且與第0天差異顯著(P<0.05)，其余天數(shù)下均無顯著性差異(P>0.05)；在處理后第9天時，P2處理下的SOD活性與CK相比下降幅度最大，較處理當天下降了30.4%，且達到顯著水平(P<0.05).

2.5 外源Pro對白刺葉片CAT活性的影響

隨著處理天數(shù)的增加，白刺葉片CAT活性呈先上升后下降的趨勢(圖5)，與處理當天相比，各處理一定天數(shù)內(nèi)葉片CAT活性上升，但上升的幅度不同，CK 上升幅度較小，除處理第3天葉片CAT活性較處理當天差異顯著(P<0.05)外，其余處理天數(shù)下均無顯著性差異(P>0.05)；其中，P2處理下CAT活性上升幅度最大，下降幅度也較大，在處理后第3天時CAT活性達到最大，較第0天上升了45.1%，達到差異顯著水平(P<0.05)；與CK相比，各處理天數(shù)下P1、P2、P3、P4和P5處理后葉片CAT活性均低于CK，一定處理天數(shù)內(nèi)，Pro處理下白刺葉片CAT活性有所上升，但上升幅度不同.處理后第9天時，除CK和P5處理下的CAT活性較第0天差異不顯著(P>0.05)，其他不同質(zhì)量濃度Pro處理下CAT活性較第0天顯著降低(P<0.05)，分別下降了39.7%、64.9%、46.1%和30.8%.

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，相同字母表示不同處理間差異不顯著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分別表示處理當天、處理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.圖4 外源Pro對自然干旱下白刺葉片超氧物歧化酶活性的影響Figure 4 Effect of exogenous Pro on superoxide dismutase activity in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

2.6 外源Pro對白刺葉片SS含量的影響

隨著處理天數(shù)的增加，不同處理下白刺葉片SS含量總體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(圖6).與處理當天相比，各處理在處理后一定天數(shù)內(nèi)SS含量均降低，但降低幅度不同，P2處理下降低幅度最大.在CK處理下，各天的SS含量隨著外源Pro質(zhì)量濃度的增加呈先降低后升高的趨勢，不同天數(shù)下增加速度和積累能力不同.CK和P1處理下，不同天數(shù)間白刺葉片SS含量較第0天差異均不顯著(P>0.05)；在P2處理下白刺葉片SS含量降低幅度最大，各處理天數(shù)下SS含量顯著低于處理當天(P<0.05)，在處理后第3天時，SS含量達到最小值，較第0天下降了33.7%，達到顯著水平(P<0.05)；在P3處理下白刺葉片SS含量降低幅度較小，在處理第9天時差異不顯著(P>0.05)；與CK相比，不同質(zhì)量濃度處理下不同處理時間SS含量均高于CK，在處理后第9天時，P2處理SS含量較第0天顯著降低了32.2 %(P<0.05).

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，相同字母表示不同處理間差異不顯著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分別表示處理當天、處理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.圖5 外源Pro對自然干旱下白刺葉片過氧化氫酶活性的影響Figure 5 Effect of exogenous Pro on catalase activity in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，相同字母表示不同處理間差異不顯著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分別表示處理當天、處理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.圖6 外源對自然干旱下白刺葉片可溶性糖含量的影響Figure 6 Effect of exogenous Pro on soluble sugar content in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

2.7 外源Pro對白刺葉片SP含量的影響

隨著處理天數(shù)的增加，不同處理下白刺葉片SP含量總體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(圖7).與處理當天相比，各處理在處理后一定天數(shù)內(nèi)SP含量降低，但降低幅度不同，P2處理下降低幅度最大.隨著處理天數(shù)的增加，CK處理下SP含量呈先降低后升高的趨勢，SP含量僅在處理后3 d下降；與CK相比，不同天數(shù)下，不同質(zhì)量濃度處理下的SP 含量均高于CK，其中P2處理下白刺葉片SP含量降低幅度最大，且升高幅度較小，處理后第1天SP含量達到最小值，較第0天下降了69.2%，達到顯著水平(P<0.05)；P3處理下，第1天、第3天和第6天的SP含量較第0天差異顯著(P<0.05)；P4和P5處理下白刺SP含量較第0天差異不顯著(P>0.05)；在處理后第9天時，P2處理下白刺SP含量較CK上升最高，上升了37.1%.

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，相同字母表示不同處理間差異不顯著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分別表示處理當天、處理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.圖7 外源Pro對自然干旱下白刺葉片可溶性蛋白含量的影響Figure 7 Effect of exogenous Pro on soluble protein content in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

3 討論

干旱脅迫是荒漠區(qū)植物最容易遭受的環(huán)境脅迫.植物在受到干旱脅迫時，其體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)和抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮作用，應(yīng)對干旱脅迫給植物帶來的傷害[28].

滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)干旱脅迫的重要生理機制，植物可以依靠細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化來調(diào)節(jié)滲透脅迫壓力[29].Pro是植物體內(nèi)重要的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當植物在遭受逆境條件時其體內(nèi)的Pro含量會大量積累[30]，同時起到保護作用，在正常情況下游離Pro含量較低，在受到干旱脅迫時含量會明顯上升，且在植物組織中起著維持滲透調(diào)節(jié)平衡和穩(wěn)定細胞機構(gòu)等作用.在植物生理干旱時，植物體內(nèi)的Pro含量會大量積累，植物細胞內(nèi)溶質(zhì)積累，滲透勢降低，維持膨壓的平衡[31].Pro的增加有助于細胞維持水分，從而減少水分的蒸發(fā)或散失，維持細胞水分平衡[32-33].在干旱脅迫下Pro會影響植物正常的光合作用、抗氧化酶活性等一系列的生理活動，植物對養(yǎng)分的吸收也會因此受到不同程度的影響；同時，干旱脅迫會導(dǎo)致植物葉片光合作用受到抑制，抗氧化酶活性降低，影響干物質(zhì)的積累[34].本研究中，通過噴施外源Pro能夠增加自然干旱脅迫下白刺葉片的游離Pro含量，在同一處理下，白刺游離Pro含量隨著天數(shù)的增加而增加，且當 Pro質(zhì)量濃度為250 mg/L時，游離Pro含量達到最大值，這與黃燕等[35]的研究一致.武術(shù)杰等[36]研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫的加劇，SS含量和SP含量總體呈上升的趨勢，在干旱脅迫下，SS和SP可作為反映植物抗逆性的生理指標，本研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下噴施一定質(zhì)量濃度的外源Pro后，白刺SS和SP含量都有減少，表明白刺可通過此方式提高其吸保水能力，進而調(diào)節(jié)細胞滲透勢，提高植物抗旱能力，試驗也得出適當質(zhì)量濃度的Pro處理增強了這種調(diào)節(jié)機制從而減輕干旱脅迫造成的傷害的結(jié)論.當處理天數(shù)大于3 d時，SS和SP含量逐漸上升，可能是由于外源Pro作用效應(yīng)有所減弱.在質(zhì)量濃度為100 mg/L的外源Pro處理下SS和SP含量降低程度最大，且上升最慢.Chl是植物進行光合作用的主要細胞器，植物葉片的Chl含量是光合作用強弱的重要指標，同時也能夠影響植物與外界能量及環(huán)境物質(zhì)和能量的交換[37-38].有研究表明，Pro在使用過程中存在明顯的濃度效應(yīng)，適宜濃度可以有效清除植株體內(nèi)活性氧，減輕自然干旱脅迫下對Chl的破壞作用[39].本研究表明干旱脅迫下，隨著天數(shù)的增加，白刺Chl含量先呈下降趨勢，而隨著外源Pro的加入其含量逐漸增加，且當噴施時間超過3天時，白刺Chl含量增加幅度較大，這與張牡丹等[40]的研究結(jié)果不一致，這可能是因為植物體內(nèi)葉綠素的合成是一個復(fù)雜的過程，它除了受光照、稀土元素等外部環(huán)境條件調(diào)控以外，其內(nèi)在基因調(diào)控也十分重要，因此噴施外源Pro會出現(xiàn)葉綠素合成滯后的現(xiàn)象，導(dǎo)致白刺Chl含量逐漸增高.說明外源Pro的加入提高了植物對逆境脅迫的適應(yīng)性，維持了植物的正常生長.

植物在遭受干旱和高溫等環(huán)境因素脅迫時，植物為保護自身免受傷害會形成一套相應(yīng)的抗氧化保護系統(tǒng)，此時植物的抗氧化物酶活性會相互協(xié)同發(fā)揮作用，使植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除機制處于動態(tài)平衡[41-42].SOD、POD、CAT等抗氧化酶，是植物活性氧清除系統(tǒng)中重要的酶，能夠維持活性氧自由基產(chǎn)生與清除系統(tǒng)的平衡.植株在正常條件下生長，其體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于一個動態(tài)平衡，不會對植株造成傷害[43].本研究表明，噴施適宜質(zhì)量濃度的外源Pro可以有效地增加白刺葉片的POD、SOD和CAT活性，提高了白刺的抗氧化能力，減免脅迫條件對植株的傷害，有效清除植物內(nèi)自由基含量[44]，從而提高白刺的耐旱性.這與陶愛芬等[45]的研究結(jié)果一致.本研究中，適宜質(zhì)量濃度的Pro(100、150 mg/L)可以明顯地提高白刺POD、SOD和CAT活性，這說明噴施外源Pro能提高白刺POD、SOD和CAT活性，抗氧化酶之間通過協(xié)同作用來增強活性氧清除能力，以此來減輕活性氧對植物葉片的傷害，這與蘇貝貝等[46]的研究結(jié)果一致.

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，噴施一定的外源Pro能夠降低白刺葉片SS、SP和Chl含量，提高白刺葉片Pro含量以及POD、SOD和CAT活性，對干旱脅迫的傷害起到了一定的緩解作用；當Pro質(zhì)量濃度大于100 mg/L時，Pro作用會減弱.說明噴施適宜質(zhì)量濃度的Pro可以提高白刺滲透調(diào)節(jié)能力和過氧化物酶活性，在一定程度上緩解了干旱脅迫對白刺的傷害.