液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用法同時測定6種植物激素

張丹,孫萍,陳思瑾,幸華,芮仕立,牛早霞，栗孟飛

(1.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省定西市農業(yè)生態(tài)與資源保護技術推廣站，甘肅 定西 743000)

植物激素是指植物通過自身代謝產生的、在低濃度下即誘發(fā)生理效應的有機信號分子，在植物生長發(fā)育及環(huán)境響應過程中具有重要作用[1].植物激素常被分為內源激素(endogenous hormones)和外源激素(exogenous hormones)兩類.內源性植物激素是植物自身代謝產生的一類具有高度生物活性的有機小分子化合物，在植物某一部位合成，然后再轉運至其他部位發(fā)揮生物學作用；外源植物激素是人工合成的具有植物激素活性的物質，又叫植物生長調節(jié)劑.根據(jù)生理功能和化學結構的不同，可將植物激素分為：生長素(auxins)[如吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、吲哚-3-丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)、萘乙酸(Naphthylacetic acid，NAA)等]、細胞分裂素(cytokinins，CTKs)[如玉米素(Zeatin，ZT)、異戊烯基腺嘌呤(isopentenyl adenine，iPAde)、6-芐氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)等]、赤霉素(gibberellins，GAs)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、乙烯(ethylene，ETH)、油菜素甾醇(brassinosteroids，BRs)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其衍生物和水楊酸(salicylic acid，SA)等8大類[2].

由于植物激素在提高作物產量和品質方面扮演著重要角色，因此對其準確地檢測具有重要意義[3].目前，對于植物激素的檢測經典方法有：1)生物鑒定法，利用激素作用于植物組織和器官產生特異性反應進行測定；2)免疫檢測法，基于抗原和抗體的特異性結合，包括放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、熒光免疫法等；3)色譜法，利用激素在固定相和流動相上保留性質的差異實現(xiàn)分離和檢測，早期主要有紙層析和薄板層析法，現(xiàn)代最常見的方法有氣相色譜法(gas chromatography，GC)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)；4)色譜質譜(Chromatography-mass spectrometry,C-MS)聯(lián)用技術，克服了傳統(tǒng)色譜技術在植物激素定性和定量分析方面的不足，將色譜對復雜混合物的分離能力與質譜的高選擇性、高靈敏度以及能夠直接得到待測物質的結構與相對分子量等特點相結合，已在激素分析等領域得到了廣泛應用；其中，LC-MS靈敏度高，選擇性強，且可同時測定多種不同激素，是目前激素分析的主流，也是今后的發(fā)展趨勢[4-6].

基于LC-MS的優(yōu)勢，很多學者就LC-MS同時檢測植物激素的方法進行了細致研究與報道.比如，鐘冬蓮等[7]同時測定了毛竹筍中4種內源性植物激素(GA3、ABA、IAA和IBA)；郭建恒等[8]同時測定了大花羅布麻葉中5種植物激素(GA3、ABA、IAA、IBA和JA)；龔明霞等[9]同時測定了辣椒葉片中7種植物激素(GA1、GA3、GA4、ABA、IAA、ZT和JA).到目前為止，還沒有建立針對不同植物種類、同時檢測GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA等6種植物激素的LC-MS方法.

1 材料與方法

1.1 試劑

試驗所用6種植物內源激素標準品：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、赤霉素(gibberellin A3，GA3)、異戊烯基腺嘌呤(isopentenyl adenine，iPAde)、6-芐氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)和水楊酸(salicylic acid，SA)均采自上海源葉生物科技有限公司.乙腈、甲醇、甲酸、無水乙醇均為色譜級(≥98%，HPLC).

1.2 儀器

LC-MS聯(lián)用儀(Agilent 1290-6460,美國)，色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18(Rapid resolution HD 2.1 mm×150 mm，1.8 μm).

1.3 測定方法

LC條件：檢測波長290 nm，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min；流動相：B(甲醇)∶A (0.1%甲酸)，采用梯度洗脫：0～1 min 10%～40%(B)、1～2.5 min 40%～45%(B)、2.5～5 min 45%～80%(B)、5～5.1 min 80%～10%(B)、5.1～7.1 min 10%～10%(B)，進樣量5 μL.

MS條件：電噴霧電離子源(ESI)，掃描方式為負離子掃描，多反應監(jiān)測模式，離子源溫度350 ℃，干燥氣流速11 L/min，霧化器壓力35 psi，毛細管電壓4 kV，碰撞氣為高純氮氣.6種植物激素的質譜具體參數(shù)見表1.

表1 6種植物激素的質譜參數(shù)

1.4 植物內源激素的提取

植物內源激素的提取參考張玉瓊等[10]方法.具體步驟為：首先，稱取1.0 g新鮮植物(馬鈴薯、油菜和苜蓿)葉片，液氮研磨至勻漿后置于15 mL離心管，加入10 mL預冷的甲醇-甲酸溶液(99∶1)；22 ℃超聲2 min后置于4 ℃下靜置提取12 h；其次，浸提液以10 000 r/min離心10 min，吸取1.0 mL上清液，加入H2O定容至10 mL；然后，用ODS C18固相萃取柱進行上樣吸附，用10%甲醇溶液6 mL，分兩次淋洗固相萃取柱；最后，用甲醇-甲酸溶液(99∶1) 6 mL進行洗脫，收集的洗脫液經減壓濃縮至小體積，用甲醇定容至1.0 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，用于內源激素的檢測.

1.5 定性與定量分析

對分析樣品溶液進行LC-MS/MS測定，以各種激素的保留時間和特征離子對為依據(jù)進行定性，采用標準曲線進行定量.

2 結果與分析

2.1 標準品獨立檢測方法的建立

6種激素質量濃度均為10 μg/L，進樣量5 μL時，在1.3測定方法條件下，GA3出峰時間為4.42 min、峰面積為283.38(圖1-1A和1-1B)；iPAde出峰時間為4.63 min、峰面積為256.78(圖1-2A和1-2B)；6-BA出峰時間為4.84 min、峰面積為525.71(圖1-3A和1-3B)；IAA出峰時間為5.09 min、峰面積為70.41(圖1-4A和1-4B)；SA出峰時間為5.51 min、峰面積為641.50(圖1-5A和1-5B)；ABA出峰時間為5.71 min、峰面積為675.65(圖1-6A和1-6B).

2.2 標準品同時檢測方法的建立

將以上6種激素標準樣品(質量濃度10 μg/L)進行混合，進樣量5 μL，在相同的色譜條件下進行同時測定，結果見圖2.GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA之間分離度較好，各激素基線之間沒有重疊，表明該檢測方法可同時進行6種激素的檢測.

2.3 測定方法的線性范圍和檢出限

將混合的標準樣品配制成梯度濃度，在相同的色譜條件下測定其峰面積，以濃度X(μg/L)為橫坐標，色譜峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，并獲得相應的線性回歸方程及相關系數(shù).表2結果表明：6種植物激素在濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數(shù)R2均達到0.99，檢出限在1.0～100 μg/L之間，說明本研究方法對植物激素有較高的檢測靈敏度.

2.4 同時檢測方法在植物樣品中的檢測效果

利用上述建立的6種植物激素同時檢測方法，對馬鈴薯、油菜和苜蓿葉片中提取的內源激素進行檢測(圖3).3種植物葉片中6種內源激素盡管存在含量和靈敏度差異，以及提取液中其他化學組分的干擾，但是激素均有較好的出峰和分離度.這表明本研究所建立的同時檢測6種植物激素的方法可用于植物激素的快速檢測.

圖1 GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA標準品獨立測定的LC(A)-MS(B)圖譜Figure 1 Chromatograms of GA3,iPAde,6-BA,IAA,SA and ABA individually determined by LC(A)-MS(B)

圖2 GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA標準品同時測定的LC-MS圖譜Figure 2 Chromatograms of GA3,iPAde,6-BA,IAA,SA and ABA simultaneously determined by LC-MS

表2 6種植物激素的線性關系和檢出限

圖3 LC-MS同時測定方法在植物內源激素檢測中的應用Figure 3 Application of simultaneous determination by LC-MS in plant endogenous hormones

3 討論

HPLC基于高壓、高速、高效、高靈敏度和操作方便的特點，以及適宜于高沸點、熱穩(wěn)定性差和相對分子質量大的有機化合物，已廣泛的應用于自然界有機化合物的分離與分析[11]，當然也包括同時分離測定植物多種內源和外源激素，比如張玉瓊等[10]同時測定了小麥葉中5種激素(IAA、ABA、GA3、ZT和SA)，楊途熙等[12]同時測定了杏花芽中8種激素(ZT、GA3、IAA、6-BA、ABA、IBA、腺素和秋水仙素)，李華等[13]同時測定了枇杷果實中10種激素(ZT、GA3、SA、6-BA、IAA、IBA、JA、ABA、激動素和苯甲酸).盡管HPLC能借助色譜柱對有機化合物進行高效的分離，然而其對化合物的檢測器主要為紫外光度檢測器(ultraviolet photometric detector)、光電二極管陳列檢測器(photo-diode array detector)、熒光檢測器(fluorescence detector)、差示折光檢測器(differential refractive index detector)和電導檢測器(electrical conductivity detector)等光譜的檢測方面，不能從化合物結構上進行真正鑒定，而生物提取液中含有大量的化學結構相似和極性相近的化合物.

MS分析可在電噴霧大氣壓(electron spray ionization,ESI)離子源的基礎上使單體或混合物離子化，按照質荷比m/z (mass-charge ratio)進行分離，然后從分子離子峰可以準確地測定物質的相對分子質量，進而利用元素的精確質量及豐度比求算其元素組成，最終根據(jù)有機化合物的標準譜圖檢索，確立或者推測化合物的分子式[11].基于此，LC-MS聯(lián)用不僅可以使得化合物在LC的條件下進行較好的分離和含量的檢測，而且還可以在后續(xù)MS的條件下對分離的化合物進行結構的鑒定，最終實現(xiàn)對生物體內提取所得化合物的含量和種類進行同時檢測.

本研究通過對LC-MS/MS測定過程中流動相、流速、柱溫等的優(yōu)化，最終建立了可針對不同植物，同時測定6種植物激素(GA3、iPAde、6-BA、IAA、SA和ABA)的高效與便捷檢測方法，這將對深入研究植物生長與發(fā)育過程、揭示植物響應生物與非生物環(huán)境機制、提高植物產量和品質以及鑒定殘留激素等方面具有重要的實際應用與參考價值.