海拔對(duì)貫葉連翹揮發(fā)性化合物積累的影響

蘇紅彥,李美玲,堅(jiān)乃丹,張曉娜,楊虎林,栗孟飛,

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅百草中藥材種植有限公司，甘肅 蘭州 730102；3.榆中縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，甘肅 蘭州 730100)

貫葉連翹(HypericumperforatumL.)為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，又名圣約翰草，主要分布于我國(guó)甘肅、四川和江蘇等低海拔區(qū)域[1-2]，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，具有抗菌消炎、收斂止血、消腫止痛等功效[3-4].其地上部分富含多種具有生物活性的化學(xué)成分，主要有苯并二蒽酮類(lèi)化合物(如金絲桃素、偽金絲桃素和異金絲桃素等)、黃酮類(lèi)化合物(如兒茶素、蘆丁和金絲桃苷等)、酚類(lèi)化合物(如綠原酸、咖啡酸和肉桂?？崴岬?、VOCs (主要為烷類(lèi)、烯類(lèi)和醇類(lèi)，如γ-雪松烯、α-姜黃烯和β-反-金合歡烯等)、以及氨基酸類(lèi)化合物[5-7].現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，貫葉連翹提取物在抗菌、抗病毒、抗氧化等方面具有顯著的生物學(xué)活性，尤其對(duì)輕度至中度抑郁癥治療效果顯著[8-10].因其獨(dú)特的藥理作用，目前已成為全球研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)草藥之一[5].

為了提高貫葉連翹的產(chǎn)量和品質(zhì)，很多學(xué)者就種質(zhì)資源[11]、生長(zhǎng)環(huán)境(如光照、溫度、水分、土壤元素)[12-15]、收獲期[16]等因素下活性物質(zhì)(如金絲桃素、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、揮發(fā)性化合物)積累等方面做了大量研究.而對(duì)海拔影響貫葉連翹VOCs積累方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道.因此，本研究以3個(gè)不同海拔(1 000、2 300和2 800 m)同一遺傳背景、兩年生的貫葉連翹為試驗(yàn)材料，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography- mass spectrometer,GC-MS)對(duì)地上部分乙酸乙酯和正丁醇萃取液進(jìn)行分離鑒定，旨在探明海拔對(duì)地上部分非極性和極性VOCs及其積累的影響，結(jié)果將為貫葉連翹高海拔種植栽培與推廣、VOCs開(kāi)發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

3個(gè)海拔兩年生貫葉連翹地上部分于2018年7、8、9月份花蕾期時(shí)分別采自康縣(海拔1 000 m，N 33°16′20″,E 105°31′50″)、渭源(海拔2 300 m，N 34°58′10″,E 104°05′22″)、甘南藏族自治州(海拔2 800 m，N 35°5′52″,E 102°53′27″)，陰干后備用.

1.2 萃取液的制備

取陰干的材料研碎后過(guò)0.18 mm篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g粉末置于25 mL無(wú)水乙醇，28 ℃、120 r/min振蕩提取24 h，20 ℃、2 000 r/min離心20 min后收集上清液，連續(xù)提取3次.上清液在70 ℃、500 Mb、150 r/min減壓濃縮至小體積，用dH2O溶解并定容至100 mL，用乙酸乙酯(體積比=1∶1)連續(xù)萃取3次；萃取液在65 ℃、400 Mb、140 r/min再次減壓濃縮至小體積，用色譜純無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL.萃余相用正丁醇(體積比=1∶1)連續(xù)萃取3次，然后在70℃、100 Mb、120 r/min減壓濃縮至小體積，用色譜純無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL.乙酸乙酯和正丁醇萃取液分別置于4 ℃冰箱中保存，用于VOCs的GC-MS分離鑒定.

1.3 GC-MS分離鑒定

色譜條件：Agilent 7890B-7000D (美國(guó) Agilent Technologies Inc.)，非極性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱溫50 ℃；升溫程序：5 ℃/min，升溫至200 ℃，然后以10 ℃/min的速率升溫至300 ℃并保持6 min；載氣為氦氣，流量1 mL/min；進(jìn)樣量2 μL，不分流.

質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度230 ℃，進(jìn)樣口溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV，質(zhì)子掃描范圍35～400 m/z；發(fā)射電流100 μA，電壓1.4 kV.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent 7000D質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，Agilent MassHunter Qualitative Analysis軟件解析質(zhì)譜圖，NIST MS Search Program軟件進(jìn)行化合物檢索.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔貫葉連翹乙酸乙酯萃取液GC-MS分離鑒定

不同海拔貫葉連翹地上部分乙酸乙酯萃取液GC-MS分離與鑒定結(jié)果如圖1和表1所示.3個(gè)海拔共分離鑒定100個(gè)化合物，其中1 000、2 300和2 800 m分別鑒定出55、52和47個(gè)化合物.前人研究結(jié)果表明，這100個(gè)化合物中有36個(gè)已在貫葉連翹中被分離鑒定.

圖1 不同海拔貫葉連翹地上部分乙酸乙酯萃取液GC-MS色譜圖Figure 1 Chromatography of ethyl acetate extracts from aerial parts of H.perforatum at different elevations by GC-MS

如表1所示，3個(gè)海拔共同擁有16個(gè)化合物，分別為：No.15、No.24、No.32、No.43、No.46、No.58、No.60、No.61、No.65、No.70、No.71、No.74、No.87、No.90、No.92和No.96.在1 000 m海拔，含量較高的5個(gè)化合物依次為No.58 (15.99%)、No.79 (13.83%)、No.96 (9.66%)、No.36(5.61%)和No.60 (5.52%)；在2 300 m海拔，含量較高的5個(gè)化合物依次為No.96 (16.46%)、No.58 (10.60%)、No.77 (6.68%)、No.92 (4.82%)和No.72 (3.88%)；在2 800 m海拔下，含量較高的5個(gè)化合物依次為No.96 (12.43%)、No.78 (8.11%)、No.15 (7.94%)、No.58 (5.00%)和No.67 (4.94%).通過(guò)對(duì)3個(gè)海拔化合物的差異進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有25個(gè)化合物僅存在2 800 m或相對(duì)含量隨著海拔升高而增加，分別為No.78、No.15、No.67、No.95和No.89等.

表1 不同海拔貫葉連翹地上部分乙酸乙酯萃取液的GC-MS分離鑒定

2.2 不同海拔貫葉連翹正丁醇萃取液GC-MS分離鑒定

不同海拔貫葉連翹地上部分正丁醇萃取液GC-MS分離鑒定結(jié)果如圖2和表2所示，3個(gè)海拔共分離出59個(gè)化合物，其中，1 000、2 300和2 800 m分別鑒定出27、22和35個(gè)化合物.前人研究結(jié)果顯示，這59個(gè)化合物中有25個(gè)已在貫葉連翹中被分離鑒定.

由表2可知，3個(gè)海拔共同擁有8個(gè)化合物，分別為No.4、No.5、No.13、No.19、No.30、No.38、No.45和No.58.在1 000 m海拔，含量較高的5個(gè)化合物依次為No.5 (41.19%)、No.46 (12.47%)、No.30 (11.45%)、No.58 (6.23%)和No.2(4.51%)；在2 300 m海拔，含量較高的5個(gè)化合物依次為No.5 (54.96%)、No.1 (16.37%)、No.55 (3.72%)、No.58 (2.92%)和No.29 (2.53%)；在2 800 m海拔，含量較高的5個(gè)化合物依次為：No.5 (27.55%)、No.48 (12.29%)、No.58 (10.69%)、 No.2 (5.20%)和No.43 (5.05%).通過(guò)對(duì)3個(gè)海拔之間化合物的差異進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有20個(gè)化合物僅存在2 800 m或相對(duì)含量隨著海拔升高而增加，分別為No.48、No.43、No.45、No.36和No.26等.

圖2 不同海拔貫葉連翹地上部分正丁醇萃取液GC-MS色譜圖Figure 2 Chromatography of n-butanol extracts from aerial parts of H.perforatum at different elevations by GC-MS

表2 不同海拔貫葉連翹地上部分正丁醇萃取液的GC-MS分離鑒定

續(xù)表2 Continued table 2

2.3 不同海拔貫葉連翹乙酸乙酯和正丁醇萃取液VOCs種類(lèi)相對(duì)含量的比較

通過(guò)對(duì)表1和表2中3個(gè)海拔分離鑒定化合物種類(lèi)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)地上部分共分離鑒定出127個(gè)化合物，32個(gè)共同化合物；對(duì)2種萃取液中化合物相對(duì)含量計(jì)算與分析后表明，海拔對(duì)地上部分揮發(fā)性化合物的積累具有顯著影響；其中，乙酸乙酯萃取液中揮發(fā)性化合物的總相對(duì)含量隨海拔升高而降低，2 800 m相對(duì)2 300和1 000 m分別降低1.25和1.31倍；然而正丁醇萃取液中揮發(fā)性化合物的總相對(duì)含量在2 300 m最低，均約為1 000、2 800 m的1/2.2種溶劑萃取液中總VOCs的相對(duì)含量也在2 300 m最低，分別較1 000、2 800 m降低1.4和1.2倍(圖3).

3 討論

很多研究已表明，海拔顯著影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育及其代謝產(chǎn)物的合成與積累[25-27].研究發(fā)現(xiàn)，海拔平均每上升100 m溫度降低0.6 ℃，光照強(qiáng)度增加4.5%,直接輻射增大5.6%，無(wú)霜期縮短[28-29].李永升等[30]報(bào)道稱(chēng)，貫葉連翹喜陽(yáng)光充足、溫和涼爽的氣候，生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)(耐寒、耐旱和耐濕)，野生植株在海拔800～2 100 m的區(qū)域均有發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)山東、河北、陜西、四川、甘肅等地區(qū)均有分布與種植栽培.

圖3 不同海拔貫葉連翹地上部分乙酸乙酯和正丁醇萃取液揮發(fā)性化合物總相對(duì)含量比較Figure 3 VOCs total relative content of ethyl acetate and n-butanol extracts from aerial parts of H.perforatum at different elevations

研究表明，環(huán)境因素對(duì)貫葉連翹地上部分次生代謝產(chǎn)物的合成與積累具有顯著影響.Brunáková等[31]和Yao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，適宜的低溫(-4～15 ℃)相對(duì)高溫(25～30 ℃)有利于主要活性組分金絲桃素和偽金絲桃素的積累；Bruni等[32]和Saeb等[33]研究發(fā)現(xiàn)紫外輻射或增強(qiáng)光照有利于主要活性組分金絲桃素、偽金絲桃素和金絲桃苷以及揮發(fā)性化合物(α-Pinene、Myrcene、Cineol、Tridecane和Phytol)的積累；Bruni等[32]通過(guò)增加土壤含水量提高了地上部分金絲桃素的積累量.在海拔影響次生代謝產(chǎn)物積累研究方面，Tocci等[34]研究發(fā)現(xiàn)，高海拔(453 m)相對(duì)于低海拔(68 m)有利于主要活性組分槲皮甙的積累，然而不利于金絲桃甙的生物合成；李云等[35]通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地海拔貫葉連翹中金絲桃素積累量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)金絲桃素的干重含量隨海拔升高(980～1 450 m)呈下降趨勢(shì).

本研究在3個(gè)海拔(1 000、2 300、2 800 m)貫葉連翹地上部分共分離鑒定127個(gè)化合物，發(fā)現(xiàn)海拔對(duì)非極性和極性化合物種類(lèi)和相對(duì)含量具有顯著影響，在乙酸乙酯和正丁醇萃取液分別鑒定出的100和59個(gè)揮發(fā)性化合物中，分別有發(fā)現(xiàn)有25和20個(gè)化合物僅存在2 800 m或相對(duì)含量隨著海拔升高而增加.很多學(xué)者已研究發(fā)現(xiàn)，海拔對(duì)其它植物中揮發(fā)性化合物種類(lèi)和含量也具有顯著的影響，比如，烤煙在不同海拔(200～1 000 m)范圍內(nèi)揮發(fā)性香氣化合物種類(lèi)與相對(duì)含量受海拔顯著影響，總體表現(xiàn)為提高種植海拔有利于煙葉燃吸品質(zhì)的提升[36]；當(dāng)歸不同海拔(1 400～2 850 m)根莖中有11個(gè)揮發(fā)性成分存在較大差異，其中7個(gè)被鑒定為差異特征性化合物[37]；圓柏在5個(gè)不同海拔高度(2 800～3 200 m)葉中揮發(fā)性成分也存在較大差異，其中，單萜及其含氧化合物含量隨海拔升高而降低，而倍半萜及其含氧衍生物含量則隨海拔上升呈升高趨勢(shì)[38].眾多研究表明，海拔對(duì)植物代謝產(chǎn)物的合成與積累是綜合因素(如物種差異、光、溫、水等)影響的結(jié)果[25,26,27].對(duì)于本研究海拔影響貫葉連翹中揮發(fā)性化合物合成與積累的機(jī)制，還需要通過(guò)基因組和代謝組學(xué)等技術(shù)進(jìn)行深入的研究與分析.

4 結(jié)論

本研究在3個(gè)海拔(1 000、2 300、2 800 m)貫葉連翹地上部分共分離鑒定127個(gè)化合物，發(fā)現(xiàn)海拔對(duì)非極性和極性化合物種類(lèi)和相對(duì)含量具有顯著影響.