鱘源海豚鏈球菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

麻強(qiáng)生，焦世璋，張小麗，李世瑛，馬小軍，劉倩

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省永靖縣農(nóng)牧局，甘肅 永靖 731600)

海豚鏈球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性的β-溶血類鏈球菌，1976年從亞馬遜淡水海豚中首次分離出[1].海豚鏈球菌能夠引起人魚共患病，主要引起人的蜂窩組織炎[2]，目前有血清Ⅰ型和Ⅱ型兩種，魚類感染血清Ⅰ型表現(xiàn)為神經(jīng)突變，感染血清Ⅱ型產(chǎn)生敗血癥病理特征[3].海豚鏈球菌的致病性和毒力基因密切相關(guān)[4]，毒力基因包括simA，simB，sagA，scpI，pdi，cpsD和cfi，其中simA或simB基因編碼SiM蛋白能夠促進(jìn)海豚鏈球菌對(duì)魚體上皮細(xì)胞的粘附和抗吞噬[5]；sagA基因編碼細(xì)胞溶血素從而破壞宿主紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，還可促進(jìn)腦血管創(chuàng)傷；scpI基因編碼的C5a肽酶是一種表面蛋白，水解補(bǔ)體因子C5a并破壞宿主的抗侵襲能力；pdi基因編碼的多氧脫乙酰基酶能夠促進(jìn)菌體粘附、侵襲宿主細(xì)胞和抵抗溶菌酶的作用，使得細(xì)菌能夠逃避宿主的體液免疫[6]；cpsD基因編碼的莢膜多糖能夠保護(hù)細(xì)菌不受宿主的吞噬[7]；pgmA基因編碼的葡萄糖磷酸變位酶參與維持細(xì)菌形態(tài)、莢膜表達(dá)和抗先天免疫[8]；cfi基因編碼的CAMP因子是一種穿孔毒性蛋白，通過結(jié)合免疫球蛋白Fc片段來(lái)增強(qiáng)致病性[9].

海豚鏈球菌感染多種淡水養(yǎng)殖魚、野生淡水魚和海水養(yǎng)殖魚，如鱘魚、虹鱒魚、大馬哈魚和鱸魚等[10].我國(guó)已發(fā)現(xiàn)有羅非魚、卵形鯧鲹、鱘魚和斑點(diǎn)叉尾鮰感染海豚鏈球菌，給我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[11].近年來(lái)每至7、8月，甘肅省永靖縣劉家峽雜交鱘常大規(guī)模發(fā)病，病征以體表潰爛內(nèi)臟出血或充血為主.調(diào)查表明，在該養(yǎng)殖場(chǎng)空氣溫度28 ℃、表層水溫25 ℃的環(huán)境下，40～50日齡、體質(zhì)量約1 kg的雜交鱘開始發(fā)病，發(fā)病率為40%～50%，死亡率接近70%，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.為探究劉家峽水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)鱘魚發(fā)病的病因，本研究采集病魚的肝、腎和心等內(nèi)臟器官，進(jìn)行了病原菌的分離、鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，并對(duì)其毒力基因進(jìn)行分析，以期能為劉家峽鱘魚養(yǎng)殖中疫病的有效防控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

具有典型病征并處于瀕死期及死亡雜交鱘(Acipenserschrenckii♀×Acipenserbaeri♂)30尾，分別采自甘肅省劉家峽6家鱘魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖場(chǎng)；40～50日齡健康雜交鱘(Acipenserschrenckii♀×Acipenserbaeri♂)60尾，購(gòu)自蘭州浙東水產(chǎn)有限公司，體質(zhì)量(1 000±5)g.

BHI瓊脂和BHI肉湯購(gòu)自青島海博生物公司；無(wú)菌脫纖維家兔血液購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；細(xì)菌生化鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，2000 DNAMarker及PCR試劑均購(gòu)自諾唯贊(南京)公司；藥敏紙片購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；各種基因擴(kuò)增引物均由金唯志(天津)公司合成.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海豚鏈球菌的分離純化及鑒定

1.2.1.1 細(xì)菌的分離純化 無(wú)菌剖檢具有典型病征或?yàn)l死的雜交鱘，分別取肝臟、腎臟和心臟置于滅菌培養(yǎng)皿中，用滅菌手術(shù)剪剪開上述組織，用其橫斷面在BHI瓊脂平板劃線接種，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h.挑取可疑單個(gè)菌落在家兔鮮血平板上反復(fù)劃線分離，30 ℃培養(yǎng)，直至得到純化的單一菌落.

表1 本試驗(yàn)中各類基因PCR擴(kuò)增引物

1.2.1.2 分離菌株培養(yǎng)特性、染色特性及生化特性的觀察 觀察分離菌株的培養(yǎng)特性及其溶血性，并對(duì)分離菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察其染色特性.采用微量生化鑒定管，參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，并按照細(xì)菌生化鑒定管的說(shuō)明進(jìn)行分離菌株的微量生化試驗(yàn)，初步鑒定分離菌株[12].

1.2.1.3 16S rRNA基因及海豚鏈球菌特異性基因lctO 的PCR擴(kuò)增及序列分析

挑取初步鑒定分離菌株的單個(gè)菌落接種BHI肉湯，30 ℃，220 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)12 h后，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行分離菌株基因組DNA的提取.以提取的分離菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因及海豚鏈球菌lctO基因[13](引物序列見表1)，16S rRNA基因PCR反應(yīng)體系為：25 μL mix，上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，ddH2O補(bǔ)足至50 μL；特異性基因lctO PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至金唯智(天津)公司進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序結(jié)果在NCBI上BLAST比對(duì)分析，確定該分離菌株的種類.

1.2.1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 根據(jù)測(cè)定分離菌株所得的16S rRNA基因序列與相關(guān)屬種16S rRNA基因序列,利用MEGA 5.0軟件以N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，各個(gè)分支的bootstrap值選擇2000[14]，確定分離菌株的進(jìn)化位置.

1.2.2 人工感染試驗(yàn)

1.2.2.1 菌懸液的制備 挑取分離單個(gè)菌株接種于BHI肉湯，30 ℃，220 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)12 h后，用無(wú)菌槍頭吸取0.5 mL菌液添加到4.5 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻制備成10-1稀釋濃度的菌懸液；無(wú)菌槍頭吸取0.5 mL 10-1稀釋濃度的菌懸液添加到4.5 mL的無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻制成10-2稀釋濃度的菌懸液；按照上述操作順序，制備10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋濃度的菌懸液備用.

選取10-5、10-6、10-7稀釋濃度的菌懸液用無(wú)菌槍頭各吸取0.2 mL，滴加到無(wú)菌BHI瓊脂平板，用無(wú)菌三角棒充分混勻(上述每一稀釋濃度重復(fù)3次)，平板在30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[15].菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為1.25×109CFU/mL，將30 ℃，220 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)12 h后的菌液用無(wú)菌槍頭吸取1 mL添加到4 mL無(wú)菌生理鹽水中充分混勻制備成2.5×108CFU/mL的菌懸液，將濃度為2.5×108CFU/mL的菌懸液按照10倍比依次稀釋為2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104CFU/mL的菌懸液備用.

1.2.2.2 人工感染 將60尾健康鱘魚隨機(jī)分為6個(gè)組，每組10尾，分別飼養(yǎng)在6個(gè)水箱中(試驗(yàn)用水箱為玻璃材質(zhì)，規(guī)格為1.5 m×1.0 m×1.0 m，水深0.5 m)，飼喂觀察7 d確認(rèn)健康后進(jìn)行分離菌株的人工感染試驗(yàn).試驗(yàn)期間，所有水箱的水溫均由電子溫控儀控制在(25±1) ℃，各水箱中的水每天更換總水量的70%，利用增氧機(jī)保證各水箱溶氧量一致.受試的6組鱘魚分別進(jìn)行如下處理：第1組作為對(duì)照組，每尾腹腔注射無(wú)菌生理鹽水0.4 mL；第2～6組為分離菌株人工感染組，每組分別以2.5×104、2.5×105、2.5×106、2.5×107、2.5×108CFU/mL濃度的菌懸液進(jìn)行腹腔注射，每尾0.4 mL.注射完畢，觀察記錄6組鱘魚7 d內(nèi)的變化情況，及時(shí)記錄病死數(shù)，用寇氏法計(jì)算7 d半數(shù)致死量(LD50)[16,19].剖檢死亡鱘魚，觀察病理剖檢變化，無(wú)菌摘取病變組織，以劃線分離的方式再次進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定.

1.2.3 海豚鏈球菌藥物敏感性試驗(yàn) 將分離鑒定的病原菌接種于BHI瓊脂，參照NCCLS抗生素敏感試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行紙片擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)，并參照NCCLS的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定[17].

1.2.4 海豚鏈球菌血清型分析(RAPD分型)和毒力基因檢測(cè)

1.2.4.1 海豚鏈球菌的血清型分析(RAPD分型) 以LP為引物(5′-GATCAAGTCC-3′)[18]，提取的海豚鏈球菌基因組DNA為模板進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD).PCR反應(yīng)體系：25 μL mix；引物2 μL；2 μL模板DNA；ddH2O補(bǔ)足至50 μL.PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min：94 ℃ 45 s；40 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 90 s；72 ℃ 5 min.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增結(jié)果.

1.2.4.2 海豚鏈球菌毒力基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中海豚鏈球菌毒力基因序列，參考Baums等[2]方法設(shè)計(jì)、合成擴(kuò)增海豚鏈球菌的主要毒力基因scpI、pdi、cpsD、pgmA和cfi的引物(表1).以提取的海豚鏈球菌基因組DNA為模板，進(jìn)行海豚鏈球菌5種毒力基因的擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系：25 μL mix；上下游引物各1 μL；1 μL模板DNA；ddH2O補(bǔ)足至50 μL.PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；59 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果后送至金唯智(天津)公司進(jìn)行測(cè)序.

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌培養(yǎng)特性及染色特性、生化反應(yīng)結(jié)果

從具有典型病征并處于瀕死期及死亡的30尾雜交鱘的肝臟、腎臟和心臟中共分離出5株疑似海豚鏈球菌菌株.5株疑似菌株均在BHI瓊脂平板上形成圓形、白色、邊緣齊整、表面光滑、直徑約為0.5～1.0 mm大小的菌落，在家兔鮮血瓊脂平板上呈β溶血，在光學(xué)顯微鏡下均呈革蘭氏陽(yáng)性鏈狀排列的球菌(圖1).5株分離株生化反應(yīng)結(jié)果均一致，與海豚鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29178[19]生化反應(yīng)基本一致，因此初步確定此5株分離菌株均為海豚鏈球菌(表2).

圖1 分離株革蘭氏染色形態(tài)(×1000)Figure 1 Isolated strain Gram staining morphology(×1000)

2.2 分離菌株16S rRNA基因及海豚鏈球菌特異性基因lct O擴(kuò)增及序列分析

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，5株分離菌株16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的大小均約為1 400 bp，與預(yù)期的目的片段大小相符(圖2)，序列分析結(jié)果表明其大小均為1 411 bp(圖3)，各分離菌株的16S rRNA基因序列均相同，在NCBI網(wǎng)站BLAST結(jié)果與海豚鏈球菌相似性達(dá)99%；分離菌株的海豚鏈球菌特異性基因lctO擴(kuò)增結(jié)果表明，5株分離菌株均在750 bp和1 000 bp的之間出現(xiàn)了目的條帶，與預(yù)期的大小(870 bp)一致(圖5)，測(cè)序結(jié)果表明其與已公布海豚鏈球菌特異性基因lctO基因(GenBank:EF126045.1)的同源性為99%.說(shuō)明分離菌株均為海豚鏈球菌，隨機(jī)挑選一株命名為海豚鏈球菌LJX.

圖2 分離株16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物Figure 2 Isolated strain16S rRNA gene amplification products

表2 分離菌株與海豚鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株生化反應(yīng)結(jié)果

圖3 分離株序列分析結(jié)果Figure 3 Sequence analysis results of isolated strain

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分離菌株LJX與海豚鏈球菌聚為一支(圖4)，且與海豚鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29178(NR_025148.1)的親緣關(guān)系最近,結(jié)合擴(kuò)增出海豚鏈球菌特異性基因lctO，可將分離菌株LJX進(jìn)一步確定為海豚鏈球菌.

2.4 海豚鏈球菌LJX人工感染試驗(yàn)

將海豚鏈球菌LJX進(jìn)行健康雜交鱘的人工感染試驗(yàn)，結(jié)果表明其死亡率與細(xì)菌活菌數(shù)目具有一定相關(guān)性(表3).死亡魚體表潰爛，剖檢后可見內(nèi)臟出血或充血，這與自然發(fā)病癥狀相似，并從以無(wú)菌環(huán)境采取的死亡鱘魚內(nèi)臟組織分離得到了與分離菌株海豚鏈球菌LJX在培養(yǎng)特性和生化特性一致的細(xì)菌.說(shuō)明此次分離的海豚鏈球菌LJX對(duì)健康鱘魚具有致病作用.運(yùn)用寇氏法計(jì)算出分離菌株海豚鏈球菌LJX對(duì)雜交鱘的LD50為3.15×106CFU/mL.

表3 海豚鏈球菌LJX人工感染試驗(yàn)死亡率

2.5 海豚鏈球菌LJX藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果：海豚鏈球菌LJX對(duì)卡那霉素、強(qiáng)力霉素、依諾沙星、紅霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林等敏感；對(duì)鏈霉素、大觀霉素、阿米卡星、慶大霉素、諾氟沙星、氨曲南等耐藥(表4).

圖4 分離株LJX16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree constructed by isolates of the LJX16S rRNA gene sequence

表4 海豚鏈球菌LJX藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 海豚鏈球菌LJX血清型分析

已知海豚鏈球菌血清型有Ⅰ型和Ⅱ型兩種.I型在LP引物的作用下可以擴(kuò)增出750 bp大小的條帶，而II型擴(kuò)增后無(wú)結(jié)果；I型與核糖和精氨酸反應(yīng)是陽(yáng)性結(jié)果，而II型是陰性結(jié)果.將本試驗(yàn)分離的海豚鏈球菌LJX在LP引物作用下的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示未擴(kuò)增出750 bp的條帶(圖5)，說(shuō)明從劉家峽鱘魚分離出的海豚鏈球菌LJX是血清型II型，這與生化試驗(yàn)的結(jié)果一致.

2.7 海豚鏈球菌LJX毒力基因擴(kuò)增結(jié)果

海豚鏈球菌LJX的毒力基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，試驗(yàn)分離的海豚鏈球菌LJX擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果大小相似的條帶(圖5).測(cè)序結(jié)果BLAST后，分離菌株LJX的毒力基因與已發(fā)布的海豚鏈球菌毒力基因scpI(GenBank:EU693239.1),pdi(GenBank:FJ664396.1),cpsD(GenBank:JX164238.1),pgmA(GenBank:JF795256.1)和cfi(GenBank:KC132870.1) 5種毒力基因相似度均為99%，是一株毒力較強(qiáng)的菌株.

圖5 海豚鏈球菌LJX毒力基因、特異性基因lct O及血清型擴(kuò)增結(jié)果Figure 5 Streptococcus iniae LJX virulence gene,specific gene lct O and serotype amplification results

3 討論

海豚鏈球菌是一種世界性分布的魚類致病菌，宿主廣范，傳染性強(qiáng)，死亡率高，危害嚴(yán)重，近年來(lái)海豚鏈球菌病對(duì)我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[20].由于傳統(tǒng)的生理生化鑒定并不能準(zhǔn)確鑒定出海豚鏈球菌，市售的鏈球菌生化鑒定試劑盒常常會(huì)將海豚鏈球菌鑒定為乳房鏈球菌或停乳鏈球菌[21]，因此淡水養(yǎng)殖業(yè)防治海豚鏈球菌病的首要前提是將其準(zhǔn)確的分離鑒定.本研究采用擴(kuò)增分離菌LJX 16S rRNA 基因及海豚鏈球菌特異lctO基因(乳酸鹽氧化酶基因)，通過測(cè)序分析，確定了分離株為海豚鏈球菌.有研究結(jié)果表明，海豚鏈球菌目前至少存在 2 種不同血清型，Bachrach等[18]通過對(duì)海豚鏈球菌血清型與基因多態(tài)性進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)以色列1997～2000年分離到的海豚鏈球菌較之前分離菌株具有不同的基因多態(tài)性，并且 2 種基因多態(tài)性對(duì)應(yīng)2種血清型，即進(jìn)行RAPD分型時(shí)擴(kuò)增出750 bp條帶的菌株對(duì)應(yīng)血清型Ⅰ型海豚鏈球菌，未擴(kuò)增出750 bp條帶的菌株對(duì)應(yīng)血清型Ⅱ型海豚鏈球菌.本研究根據(jù)Bachrach等方法利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)對(duì)分離的5株海豚鏈球菌進(jìn)行基因多態(tài)性分析，結(jié)果表明此5株分離菌株均為海豚鏈球菌血清型II型.

人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)海豚鏈球菌LJX對(duì)健康雜交鱘半數(shù)致死量是3.15×106CFU/mL，腹腔感染劑量不低于2.5×107CFU/尾時(shí)，試驗(yàn)魚7 d內(nèi)的死亡率高達(dá)100%，表明海豚鏈球菌LJX致病性較強(qiáng)，這與分離株LJX含有5種毒力基因(scpI,pdi,cpsD,pgmA,cfi)相印證.人工感染試驗(yàn)中死亡魚的癥狀與劉家峽養(yǎng)殖場(chǎng)死亡雜交鱘癥狀一致，皆為體表潰爛，剖檢內(nèi)臟出血或充血，這是海豚鏈球菌血清II型感染的典型癥狀，此外從人工腹腔感染發(fā)病死亡的24尾雜交鱘體內(nèi)再次分離病原菌，得到與分離海豚鏈球菌LJX相同的菌株，進(jìn)一步說(shuō)明分離株海豚鏈球菌LJX為引發(fā)劉家峽鱘魚死亡的主要病原菌.藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離株海豚鏈球菌LJX對(duì)卡那霉素、強(qiáng)力霉素、依諾沙星、紅霉素、鏈霉素、大觀霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林等敏感；對(duì)卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素、諾氟沙星、氨曲南等耐藥，本研究結(jié)果可為甘肅劉家峽雜交鱘海豚鏈球菌病防治和疫苗研制提供理論依據(jù).

4 結(jié)論

此次劉家峽養(yǎng)殖雜交鱘在自然情況下大規(guī)模發(fā)病是由毒力較強(qiáng)的血清Ⅱ型海豚鏈球菌引起的.