甘肅省永昌縣舍飼綿羊乳房炎源大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

王加冕，馬小軍，張小麗，時(shí)帥峰

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

動(dòng)物乳房炎是世界各地養(yǎng)殖業(yè)的常見疾病，全球奶牛乳房炎平均發(fā)病率約為50.00%，我國奶牛乳房炎的陽性檢出率高于全球平均水平，達(dá)到46.40%～85.70%[1].乳房炎會(huì)使母畜泌乳量下降、奶汁品質(zhì)降低、最終導(dǎo)致淘汰率上升、治療費(fèi)用增加等，影響?zhàn)B殖場經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)對人類食品安全造成嚴(yán)重威脅[2].奶牛乳房炎的眾多致病因素中，病原微生物侵入導(dǎo)致乳房炎的發(fā)生最為常見[2]，臨床上引起乳房炎的主要病原菌包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及鏈球菌，這3種病原菌占乳房炎病原菌總數(shù)的90%～95%[3-4].

大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，具有多種毒力因子，如內(nèi)毒素、外毒素和黏附素等，其中內(nèi)毒素是大腸桿菌主要的致病毒力因子，能夠引發(fā)動(dòng)物機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[5]，所以當(dāng)母畜發(fā)生大腸桿菌性乳房炎時(shí)，多為急性炎癥過程.一方面，在炎癥反應(yīng)中，乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生損傷、脫落，使乳腺組織受到損傷，大大降低產(chǎn)奶量，嚴(yán)重者誘發(fā)敗血癥，導(dǎo)致動(dòng)物的急性死亡，且大腸桿菌屬于環(huán)境性致病菌，可在動(dòng)物糞便中生長、繁殖，導(dǎo)致群體中乳房炎的傳播，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益.另一方面，大腸桿菌可通過患病羊的乳汁傳播，人類攝入消毒不當(dāng)?shù)牟⊙蛉橹?，可患腹瀉及敗血癥，嚴(yán)重影響人類健康.故查明大腸桿菌在乳房炎中的感染情況及耐藥性，可有效控制乳房炎發(fā)生.

近年來，甘肅省大力推進(jìn)生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)的建設(shè)，舍飼養(yǎng)殖業(yè)已成為農(nóng)民重要的收入來源[6].目前由于基礎(chǔ)設(shè)施不夠完善、舍飼條件管理有限、農(nóng)民養(yǎng)殖知識(shí)薄弱等不可避免因素的影響，綿羊乳房炎成為當(dāng)?shù)刈畛Ｒ姷募膊≈?，一直困擾著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[7-8].為了查明大腸桿菌在舍飼綿羊乳腺組織中的感染情況及其耐藥性，本試驗(yàn)采集甘肅省永昌縣臨床型乳房炎患羊乳樣進(jìn)行病原菌的分離鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)，研究結(jié)果可為該地區(qū)乳房炎的預(yù)防治療提供參考和依據(jù).

1 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 培養(yǎng)基、試劑及試驗(yàn)動(dòng)物 麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基(北京奧博星)；鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(自制).細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、16s rRNA通用引物(南京諾唯贊)；抗菌藥物藥敏紙片(北京天壇)；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(上?；?.SPF小白鼠(體質(zhì)量18～20 g/只)，購于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

2.1.2 儀器設(shè)備 電子分析天平(瑞士 METTLER TOLEDO)、光學(xué)顯微鏡(日本尼康)、高速離心機(jī)(德國 Eppendorf)、超凈工作臺(tái)(上海智城)、臥式恒溫振蕩器(美國 CRYSTAL)、恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn))、PCR擴(kuò)增儀及凝膠成像分析儀(美國 BIO-RAD)、電泳儀(北京六一)、常規(guī)儀器設(shè)備等.

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 乳樣來源 采自甘肅省永昌縣某舍飼綿羊養(yǎng)殖場的16份臨床型乳房炎患羊乳樣.

2.2.2 分離培養(yǎng) 充分搖勻無菌采集的乳樣，接種于50 mL/L的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，觀察細(xì)菌生長情況.根據(jù)菌落的形態(tài)特點(diǎn)，挑取多個(gè)典型單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢.根據(jù)細(xì)菌生長情況、菌落形態(tài)特征及染色特性，選擇革蘭氏陰性、無芽孢桿菌接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，進(jìn)一步觀察培養(yǎng)特性及染色特性，反復(fù)操作，直至純化為單一菌株后移至斜面保存[9].同時(shí)接種于鮮血瓊脂平板，觀察其溶血現(xiàn)象.

2.2.3 生化鑒定 生化鑒定采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管進(jìn)行，生化培養(yǎng)參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊進(jìn)行，將分離菌株接種至不同的細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h或更長時(shí)間后觀察試驗(yàn)結(jié)果.

2.2.4 16s rRNA序列分析

2.2.4.1 細(xì)菌模板DNA的提取 利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的DNA，-20 ℃保存.

2.2.4.2 PCR擴(kuò)增 以提取的細(xì)菌DNA為模板，用細(xì)菌16s rRNA通用引物進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增[10]，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：GreenTaqMix(dNTP、Taq、核酸染料)12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 0.5～1 μL，DD水10 μL，加至管底，震蕩均勻，離心后進(jìn)行擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30～60 s；褪火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，90 s；終止72 ℃，7 min；保存16 ℃.變性、退火和延伸重復(fù)30～35個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存.

2.2.4.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 取4 μL PCR產(chǎn)物，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析.

2.2.4.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析 PCR產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果提交NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)進(jìn)行BLAST序列比對分析[11].

2.2.5 動(dòng)物試驗(yàn) 將分離鑒定的大腸桿菌純培養(yǎng)物接種于血清肉湯，37 ℃培養(yǎng)24 h.對照組小白鼠腹腔注射生理鹽水；試驗(yàn)組每只小鼠注射菌懸液0.5 mL(OD600=1)，注射3只小白鼠.注射后各組小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察小鼠的發(fā)病和死亡情況并做記錄.死亡小鼠及時(shí)剖檢、觀察病變組織的病理學(xué)變化，同時(shí)從發(fā)病或死亡小白鼠的肝臟或脾臟無菌采集標(biāo)本，進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定.

2.2.6 大腸桿菌的藥敏試驗(yàn) 挑取已鑒定過的菌株于普通肉湯中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)8 h，選取與0.5號麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管濁度相同的菌液進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)[12].吸取200 μL菌液，滴加于瓊脂固體培養(yǎng)基表面，平板涂布均勻，靜置片刻.鑷子夾取藥敏紙片，按一定距離平放于平板上，紙片貼后靜置15 min，培養(yǎng)皿倒置37 ℃培養(yǎng)16～18 h.培養(yǎng)完成后用游標(biāo)卡尺測量藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑并做好記錄，參考世界臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的紙片擴(kuò)散標(biāo)準(zhǔn)[13]，判定細(xì)菌對藥物的耐受程度.

3 結(jié)果與分析

3.1 分離菌株培養(yǎng)及染色特性

在16份臨床型乳房炎患羊乳樣中，分離得到2株疑似大腸桿菌的菌株，2株分離菌株均不溶血，它們在麥康凱瓊脂平板上形成粉紅色的菌落(圖1-A)，在伊紅美蘭瓊脂平板表面形成有金屬光澤的墨綠色菌落(圖1-B).

對疑似菌株進(jìn)行涂片、染色，顯微鏡觀察的結(jié)果表明2株疑似菌株均為兩端鈍圓、中等大小、單在的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，如圖2所示.

圖1 疑似菌株在選擇培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)Figure 1 Growth of suspected strains on selective media

圖2 疑似菌株的染色特性Figure 2 Staining characteristics of suspected strains

3.2 分離菌株的生化鑒定結(jié)果

根據(jù)分離菌株的染色和培養(yǎng)特性，設(shè)計(jì)相關(guān)生化試驗(yàn)進(jìn)行初步鑒定，生化反應(yīng)結(jié)果見表1.結(jié)合形態(tài)學(xué)特性、培養(yǎng)特性及相關(guān)生化試驗(yàn)結(jié)果，初步判定分離菌株1、2均為大腸桿菌.

3.3 分離菌株16s rRNA序列分析結(jié)果

3.3.1 分離菌株16s rRNA基因片段PCR擴(kuò)增 以提取的分離菌株基因組DNA為模板，用特異性引物對2株分離菌的16s rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，2株分離菌均在約370 bp處出現(xiàn)一條特異條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段的大小一致，說明擴(kuò)增成功(圖3).

3.3.2 分離菌株16S rRNA序列分析 將測得序列提交NCBI進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果如圖4所示，2株分離菌的16s rRNA的基因序列與大腸桿菌的同源性達(dá)到99.9%，證實(shí)該菌為大腸桿菌.

3.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

選一株鑒定過的大腸桿菌進(jìn)行小白鼠的人工感染試驗(yàn)，結(jié)果表明感染大腸桿菌的小白鼠在18～24 h內(nèi)全部死亡，剖檢見十二指腸膨脹，呈半透明狀，腸壁變薄，腸內(nèi)充滿黃色稀薄的內(nèi)容物，其余內(nèi)臟器官未見明顯病變(圖5)；對照組小白鼠均正常.從小白鼠的臟器組織分離得到了與已鑒定菌株一致的大腸桿菌.說明此次分離的大腸桿菌具有很強(qiáng)的致病性，揭示大腸桿菌也是引起永昌縣舍飼綿羊臨床型乳房炎的重要病原菌.

表1 疑似菌株的生化反應(yīng)結(jié)果

3.5 大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選用紅霉素、鏈霉素等抗菌藥物對分離的大腸桿菌做藥敏試驗(yàn)，18 h后測量其抑菌圈直徑，圖6為大腸桿菌對環(huán)丙沙星、氨芐西林、鏈霉素、諾氟沙星的藥敏試驗(yàn)結(jié)果.

大腸桿菌對不同抗菌素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2.永昌縣舍飼羊場分離得到的大腸桿菌對卡那霉素、新霉素、阿米卡星、氯霉素和慶大霉素高度敏感，對萬古霉素、青霉素G和氨芐西林低度敏感甚至不敏感.

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6：分離菌株16s rRNA基因片段.M：DNA molecular quality standard；1～6：Isolate 16s rRNA gene fragment of strain.圖3 分離菌株16SrRNA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 3 The result of PCR amplications of isolates 16s rRNA genes

圖4 分離菌株序列比對結(jié)果Figure 4 Results of sequence alignment of isolates

4 討論

據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，引起奶牛乳房炎的病原微生物種類繁多，臨床上以鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染引起的乳房炎最為常見，其中大腸桿菌通過侵入動(dòng)物乳房引發(fā)大腸桿菌性乳房炎，主要發(fā)生在宿主免疫受到抑制時(shí)的圍產(chǎn)期和泌乳早期.

近年來，關(guān)于從畜群乳房炎中分離出大腸桿菌的文獻(xiàn)報(bào)道很多.張磊等[14]對河北省某奶牛場中采集患羊乳汁，分離到的大腸桿菌對卡那霉素、菌必治敏感，對莫能菌素、林可霉素、氨芐青霉素、鏈霉素、苯唑青霉素、阿奇霉素表現(xiàn)出耐藥性；馬曉媛等[15]在吉林地區(qū)乳房炎中分離到的大腸桿菌對阿奇霉素、頭孢噻呋、阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素、磺胺異噁唑、萘啶酸等完全耐藥，且不同奶牛場和不同標(biāo)本中分離的大腸桿菌對常用抗菌藥物的耐藥性有著不同的特點(diǎn)；廖智慧等[16]對河北衡水地區(qū)奶牛乳房炎源大腸桿菌進(jìn)行了耐藥性分析，結(jié)果表明分離株僅對頭孢克肟、恩諾沙星、丁胺卡那、強(qiáng)力霉素4種藥物敏感；武軍元等[17]從新疆阿克蘇地區(qū)奶牛乳房炎分離的大腸桿菌對氨芐西林的耐藥性最高，多西環(huán)素、四環(huán)素和鏈霉素的耐藥性次之；石潤佳等[18]在華北地區(qū)乳房炎奶樣中分離到的大腸桿菌對青霉素、苯唑西林、林可霉素耐藥率高達(dá)100%；張金寶等[19]在寧夏地區(qū)檢測到乳房炎源大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率最高；本研究從甘肅省永昌縣16份臨床型乳房炎患羊的乳樣中共分離、鑒定得到2株大腸桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明2株大腸桿菌均對卡那霉素、新霉素、阿米卡星、氯霉素和慶大霉素高度敏感，對萬古霉素、青霉素G和氨芐西林低度敏感甚至不敏感，與其他地區(qū)對比大腸桿菌的耐藥性有所不同，這可能與不同地區(qū)、季節(jié)、泌乳期、飼養(yǎng)管理水平、衛(wèi)生狀況、個(gè)體抗病能力以及常用抗菌藥物等原因的影響有關(guān).

圖5 大腸桿菌致死小鼠Figure 5 E.coli infection killed mice

圖6 大腸桿菌的藥物敏感試驗(yàn)Figure 6 Antibiotic sensitivity tests of E.coil

表2 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

目前國內(nèi)對于乳房炎以預(yù)防指導(dǎo)、改善飼養(yǎng)條件和抗生素治療為主，這些方法對于降低乳房炎的發(fā)病率和減輕乳房炎的嚴(yán)重程度都十分有限，并且由于治療人員缺乏醫(yī)療知識(shí)與用藥指導(dǎo)，出現(xiàn)了抗生素濫用、亂用以及大劑量使用的現(xiàn)象，致使致病菌產(chǎn)生了越來越強(qiáng)的耐藥性，為乳房炎的有效治療增加了難度[20-21].在綿羊養(yǎng)殖過程中，應(yīng)堅(jiān)持預(yù)防重于治療，并合理規(guī)范化的進(jìn)行飼養(yǎng)管理，提高羊群的免疫力，從源頭解決乳房炎發(fā)病率高的問題.另外，我們要加強(qiáng)對隱形乳房炎的監(jiān)控檢測，早發(fā)現(xiàn)早治療，對于患病動(dòng)物應(yīng)及時(shí)隔離，避免傳染給其他動(dòng)物.只有防治結(jié)合，才能有效地控制乳房炎的發(fā)生，才能為養(yǎng)殖業(yè)的良好發(fā)展打下夯實(shí)的基礎(chǔ).

5 結(jié)論

大腸桿菌是引起甘肅省永昌縣舍飼綿羊養(yǎng)殖場臨床型乳房炎的致病菌之一，由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，永昌縣所有分離菌株均對卡那霉素、新霉素、阿卡米星和慶大霉素高度敏感，對萬古霉素、青霉素、氨芐西林不敏感，甚至完全耐藥.對比其他地區(qū)，分離得到的大腸桿菌耐藥性的不同可能是由于用藥方式、地域特點(diǎn)、光照、溫度、海拔、飼養(yǎng)方式和濕度等因素造成的.