酶比色法測定乳粉中膽堿的方法改進

李秀明,夏秀輝,姜承光,楊仕霞,王冰冰

（圣元營養(yǎng)食品有限公司，青島266400）

0 引 言

膽堿可以促進大腦的發(fā)育，改善大腦的代謝，促進神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞，增強視力、改善鈣代謝，是嬰幼兒乳粉中重要的營養(yǎng)食品添加劑[1-3]?，F(xiàn)行的食品安全國家標準中膽堿的檢測方法為酶比色法和雷氏鹽分光光度法。酶比色法操作簡單、重復性好、檢出限低、對試驗人員相對安全，但成本較高。雷氏鹽分光光度法操作繁瑣、試劑有一定毒性，但是成本較低[3]。二者各有優(yōu)缺點，在實際操作中，兩種檢測方法均被廣泛采用。企業(yè)在檢驗過程中發(fā)現(xiàn)：采用酶比色法和雷氏鹽分光光度法對同一嬰幼兒乳粉中膽堿進行檢測，檢測結(jié)果存在一定差異。設(shè)計并完成相關(guān)試驗，結(jié)果表明抗壞血酸（后文簡稱VC）對酶法測膽堿的檢測結(jié)果有顯著影響，VC 含量越高，膽堿檢測結(jié)果越低。加入活性碳粉將VC 進行氧化可以消除影響。而雷氏鹽分光光度法不受VC 添加量的影響。膽堿和VC 都是嬰幼兒乳粉重要的食品添加劑，這一驗證結(jié)論對企業(yè)的檢測方法選擇和方法改進具有一定的指導意義。

1 實 驗

1.1 試劑及儀器

99.5% 酒石酸氫膽堿、過氧化物酶（美國SIGMA）、膽堿氧化酶（美國 SIGMA）、磷脂酶（美國SIGMA）、4- 氨基安替吡啉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、苯酚、弗羅里硅土（100～200 目，650 ℃活化）、甲醇、三氯甲烷、氫氧化鋇、冰乙酸、乙酸甲酯、丙酮、雷納克銨鹽、活性炭。所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682中規(guī)定的三級水。

紫外可見分光光度計（UV1800），島津；電子天平（Toledo XS105DU），Mettler；熱恒溫水浴鍋（DK-98-ⅡA），天津泰斯特；pH 計（PHS-3C），雷磁。

1.2 標準溶液配制、樣品處理及測定

酶比色法和雷氏鹽分光光度法均按照GB5413.20-2013進行操作[4]。

1.2.1 酶比色法

（1）標準系列配制：分別取 250 μg/mL 膽堿標準使用溶液 2、4、6、8 mL 于 10 mL 容量瓶，用水定容至刻度，配制成 50、100、150、200 μg/mL 的標準工作液。各取 0.100 mL 標準工作液、0.100 mL 水于 25 mL 比色管，加入3 mL發(fā)色劑。

（2）樣品處理：稱取5 g 試樣于100 mL 錐形瓶中，加入30 mL 鹽酸溶液。將裝有試樣的容器放在70 ℃水浴中，水解3 h，冷卻。用氫氧化鈉溶液調(diào)pH 為3.5～4.0，轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，過濾。各取待分析濾液0.100 mL 于試管B、試管C兩個管中，試管B 中加入蒸餾水 3.00 mL，試管 C 中加入發(fā)色劑3.00 mL，用密封保護膜蓋住試管，混勻。

（3）測定：于37 ℃水浴中保溫反應(yīng)15 min 后取出，冷卻至室溫。在波長505 nm 處，用蒸餾水做空白，測定吸光值。以膽堿標準溶液的濃度為橫坐標，以標準溶液的吸光值減去試劑空白的吸光值為縱坐標，制作標準曲線。在標準曲線上查出樣品凈吸光值的位置，按照GB5413.20-2013 中第一法的公式對結(jié)果進行計算。

1.2.2 雷氏鹽分光光度法

（1）標準系列配制：分別吸取膽堿標準溶液(1 g/L)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 注入層析柱中。

（2）樣品處理：稱取固體試樣10 g(精確到0.01 g)，加入50 mL 氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷提取液?；旌暇鶆蚝蠼尤牖亓餮b置，于80 ℃的水浴鍋內(nèi)水解抽提4 h。每隔1 h 震蕩一次，以避免試樣結(jié)塊。水解抽提結(jié)束后，取出錐形瓶冷卻至室溫，過濾。濾渣用冰乙酸甲醇混合液洗滌3 次～4 次，洗液一并收集于100 mL容量瓶中。用甲醇定容至刻度，混勻。吸取10 mL 試樣水解液（12.1）于層析柱中。當溶液完全進入柱床后，依次用 5 mL 和10 mL 甲醇，20 mL 乙酸甲酯洗滌層析柱。再加入5 mL 雷納克銨鹽溶液，用適量的冰乙酸洗去過量的雷納克銨鹽，直至層析柱上無雷納克銨鹽附著處呈現(xiàn)硅土原有的白色。

（3）測定：用丙酮洗脫粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，收集于10 mL 的容量瓶中，用丙酮定容（如果洗脫液混濁需過0.45 μm 的濾膜）。在波長526 nm 處測定溶液的吸光值。以膽堿標準溶液的濃度為橫坐標，以標準溶液的吸光值為縱坐標，制作標準曲線。在標準曲線上查出樣品吸光值的位置，按照GB5413.20-2013中第二法的公式對結(jié)果進行計算。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 不同檢測方法對結(jié)果的影響

分別用酶比色法和雷氏鹽分光光度法對某一未添加VC 的樣品（命名為樣品1）和某一添加VC 的樣品（命名為樣品2）分別進行檢測，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，驗證兩種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著差異。

1.3.2 VC 對酶法檢測結(jié)果的影響

在樣品1（經(jīng)檢測VC 本底值為7.8 mg/100g）中加入不同含量的VC，按照酶比色法的操作步驟進行處理和檢測，同時對處理后的VC 含量進行檢測。驗證VC 對酶法檢測結(jié)果的影響。

1.3.3 酶法測膽堿的方法改進

設(shè)計如下兩個實驗，從兩個方面對酶法檢測方法進行改進。

實驗1：在樣品1 中加入不同含量的VC，按照酶比色法的操作步驟進行處理和檢測，同時取另一組將膽堿氧化酶和過氧化物酶進行加倍處理。增加酶法中的膽堿氧化酶和過氧化物酶使用量，驗證酶量的增加是否可以消除VC 對酶的抑制作用。

實驗2：在樣品1 中加入不同含量的VC，在前處理時加入2 g 活性碳粉（酶比色法中規(guī)定的樣品稱樣量為5 g，活性碳粉使用量參照GB5009. 86 -2016）[5]將VC 氧化，按照酶比色法的操作步驟進行處理和檢測，同時對處理后的VC 含量進行檢測。驗證樣品中VC 經(jīng)氧化后是否可以消除對酶法檢測結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同檢測方法對結(jié)果的影響

表1 結(jié)果顯示，樣品1 采用兩種方法分別進行檢測的檢測結(jié)果無顯著差異，但樣品2 的檢測結(jié)果存在顯著差異。這表明樣品是否添加VC 對雷氏鹽法的測定結(jié)果無影響，而對酶比色法的測定結(jié)果有顯著影響，分析原因可能是VC 本身的強還原性對酶法中的膽堿氧化酶和過氧化物酶產(chǎn)生了抑制作用，影響了酶作用的發(fā)揮。

2.2 VC 對酶法檢測結(jié)果的影響

表2 及圖1 結(jié)果表明：樣品經(jīng)70 ℃消化處理后VC 會有一定量的損失，但是膽堿檢測結(jié)果與消化前后樣品中VC 含量都呈明顯相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.9981 和0.9995，說明VC 對酶比色法的檢測結(jié)果存在直接影響。一定范圍內(nèi)，VC 含量越高，膽堿檢測結(jié)果越低，而且消化過程中VC 的損耗不會消除這種抑制作用。

2.3 酶法測膽堿的方法改進

表3 結(jié)果顯示，正常酶量與雙倍酶量的檢測結(jié)果符合檢測平行樣之間的誤差要求，表明增加酶的使用量不會消除VC 對酶的抑制作用。

表4 結(jié)果顯示，加入碳粉的樣品經(jīng)70 ℃消化處理后VC 損耗率很高，殘余VC 含量很低，說明加入碳粉再消化，樣液中含量300 mg/100g 以內(nèi)的VC 基本可以被氧化完全。將本次膽堿檢測結(jié)果與未強化VC 時的雷氏鹽檢測結(jié)果（參見表1 中樣品1 檢測結(jié)果）進行雙樣本等方差t 檢驗：t-stat 值為0.7933，t-雙尾臨界值為2.2622，t-stat

表1 酶法和雷氏鹽法的檢測結(jié)果

表2 樣品1添加不同含量VC后的酶法檢測結(jié)果

圖1 樣品消化前后VC含量與膽堿檢測結(jié)果相關(guān)性

表3 樣品1添加不同酶量膽堿檢測結(jié)果

3 結(jié) 論

（1）VC 對酶法測膽堿的檢測結(jié)果有直接影響，在添加量300 mg/100g 范圍內(nèi)，VC 含量越高，膽堿檢測結(jié)果越低，但雷氏鹽法檢測結(jié)果不受VC 含量影響。分析原因可能是VC 的強還原性對酶法中的膽堿氧化酶和過氧化物酶產(chǎn)生了抑制作用，影響了酶作用的發(fā)揮。

（2）樣品前處理時，在5 g 樣品中加入2 g 活性炭粉可以通過將VC 氧化消除對酶法檢測結(jié)果的影響。

酶比色法是國家標準中的第一法，一般被視為仲裁法，檢測結(jié)果的準確性非常重要?；钚蕴糠墼跇悠废凹尤?，后期樣品過濾過程中可以被完全去除，添加后除了氧化VC，不會對酶法的檢測原理和檢測步驟產(chǎn)生較大影響，在實驗室內(nèi)具有較強的可操作性。