乳酸菌素原料中有機酸的測定分析

馬曉娟謝有發(fā)劉文君喬培鐘地長李詒光余銀芳

（江中藥業(yè)股份有限公司，南昌，330096）

0 引 言

乳酸是乳酸菌發(fā)酵中的主要代謝產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)式為CH3CHOHCOOH，由于分子內(nèi)含有一個不對稱碳原子，因此具有旋光異構(gòu)現(xiàn)象，可區(qū)分為L-乳酸和D-乳酸，當兩者以等比例混合時，即成為內(nèi)消旋的DL-乳酸。由于人體只含有L-乳酸脫氫酶，從而能分解自體產(chǎn)生的或攝入的L-乳酸，不能代謝D-乳酸[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）明確規(guī)定，人體每天攝取D-乳酸的量限定在100 mg/kg 體重以下，而對L-乳酸不加限制[2]。目前研究食品與藥品中的L-乳酸、D-乳酸的報道較多，食品中多為發(fā)酵制品，如白酒[3]、酸奶[4-5]、乳酸飲料[5]、泡菜[6]等，藥品中有醋酸奧曲肽注射劑[7]、左氧氟沙星[8]、乳酸菌素原料制劑[9]等，關于L-乳酸、D-乳酸的測定，已經(jīng)建立的分析方法主要有4種:滴定法、旋光法、UV 酶法分析、酶電極法和液相色譜法[10]。

短鏈脂肪酸通常是指碳鏈中碳原子數(shù)少于6 的有機脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸等[11]。短鏈脂肪酸是乳酸發(fā)酵的代謝物之一，能改善一些金屬離子如鈣、鐵、鎂的代謝和吸收，對胃黏膜有一定的保護作用，也能改善乳制品的風味[12-13]。短鏈脂肪酸被吸收后，在各種器官中被利用，在調(diào)節(jié)內(nèi)源性代謝方面起重要作用[14]。目前，氣質(zhì)聯(lián)用法用于檢測短鏈脂肪酸較為廣泛，曾鱗粞[15]用GC-MS 分別對生物組織、糞便、血液等對短鏈脂肪酸進行了分析，龐錦偉等[16]用GC-MS 對酵素產(chǎn)品中的5種短鏈脂肪酸進行了測定。乳酸菌素原料是由嗜酸乳桿菌發(fā)酵脫脂奶粉而成的粉末，其中乳酸及短鏈脂肪酸是主要代謝產(chǎn)物?，F(xiàn)行質(zhì)量標準水平較低，質(zhì)量控制方法簡單，其中總酸量通過酸堿滴定法測定，沒有較為詳細的指標性成分。本實驗參考白璧煒的檢測方法[9]及國標方法[17],采用高效液相色譜法對乳酸菌素原料中的L-乳酸、D-乳酸進行分離與測定，采用氣質(zhì)聯(lián)用法[18-20]對原料中的7 種短鏈脂肪酸進行測定，用較為先進的技術(shù)對原料進行質(zhì)量分析，為選擇原料提供科學的參考依據(jù)。

1 材料與設備

1.1 樣品與試劑

乳酸菌素原料，分別由A、B、C 原料廠家提供；L-乳酸對照品（≥98%）、D-乳酸對照品（≥90%），德國默克生命科學有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸（均為色譜純），上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Agilent 7890A-7000D 氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；sartorius MS204S/01 電子天平，德國Sartorius 賽多利斯公司；sartorius MS6.6S-CE 電子天平，德國Sartorius賽多利斯公司；IQ 7000 超純水儀，廈門精益興業(yè)科技有限公司；KQ-1000KDE 超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；GL-20G-II 低溫高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

2 方法與測定

2.1 L-乳酸與D-乳酸的測定

2.1.1 標準品溶液的制備

精密稱取L-乳酸對照品26.540 mg，D-乳酸對照品25.060 mg，加流動相溶解并定容到25 mL，經(jīng)稀釋并折算制成系列濃度的標準溶液，L-乳酸的對照品濃度分別為0.212、0.425、0.637、0.849、1.062 mg/mL，D-乳酸對照品濃度分別為 0.200、0.401、0.601、0.802、1.002 mg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取乳酸菌素原料粉末約0.6 g，精密稱定，置于100 mL 容量瓶中，加入少量流動相溶解，超聲處理15 min, 放冷，加溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：手性柱Chirex 3126 (D)-penicillamine（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃ ；流動相：2 mmol/L 硫酸銅溶液（溶劑為5%異丙醇）；流速：1.000 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

2.1.4 定性與定量

將相同色譜條件下的樣品色譜圖與乳酸標準液色譜圖進行對照，根據(jù)保留時間對樣品中的L-乳酸、D-乳酸進行定性。用外標法定量，計算出樣品中L-乳酸和D-乳酸的含量。

2.2 短鏈脂肪酸的測定

2.2.1 標準品溶液的制備

先配制高濃度混標，逐級稀釋成9.5、8、2、1、0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.02、0.005 μg/mL,然后加入內(nèi)標。

2.2.2 供試品溶液的制備

（1）稱取樣本 20 mg 于 2 mL EP 管中，加入 1 mL磷酸（0.5% v/v）溶液渦旋10 min混勻，超聲5 min。

（2）取0.1 mL 上述樣品勻液加入到1.5 mL 離心管中，加入0.5 mL MTBE（含內(nèi)標）溶液，渦旋3 min，超聲5 min；

（3）12 000 r/min、4℃條件下離心10 min，離心后吸取上層清液0.2 mL于進樣瓶，待GC-MS/MS分析；

2.2.3 色譜條件

色譜柱:DB-FFAP (30m×0.25mm×0.25 μm)；進樣量：3 μL；載氣：氦氣；柱流速：1.2mL/min；分流模式：2∶1；升溫程序：95 ℃保持1min，以25 ℃/min 的速度升至 100 ℃ ，以 17 ℃/min 的速度升至 130 ℃ ，保持0.4 min，以 25 ℃/min 的速度升至 200 ℃ ，保持0.5 min；掃描模式：MRM；四級桿溫度：150° C；前進樣口溫度：200 °C；傳輸線溫度：230 °C；離子源溫度：230 °C；電離電壓：70eV。

3 結(jié)果與討論

3.1 L-乳酸與D-乳酸檢測的方法學驗證

3.1.1 線性與范圍

取“2.1.1”項下不同濃度的L-乳酸對照品溶液、D-乳酸對照品溶液，分別精密量取10 μL 注入液相色譜儀峰面積，以對照品峰面積為橫坐標(X)，進樣濃度為縱坐標（Y）進行線性回歸，得到回歸方程。

L-乳酸：y=0.0146x+0.0135(R2=0.9998)；線性范圍0.2123～1.0616 mg/mL

D-乳酸：y=0.0147x-0.0036(R2=0.9997)；線性范圍0.2005～1.0024 mg/mL

3.1.2 重復性試驗

精密稱取乳酸菌素原料的同一批樣品6 份，每份約0.6 g，按“2.1.2”項下制備供試品方法平行制備，通過進樣檢測，根據(jù)峰面積與回歸方程計算含量。

L-乳酸的平均含量為44.2359 mg/g，RSD 值為1.48；D-乳酸的平均含量為 35.5082 mg/g，RSD 值為0.73。

圖1 L-乳酸、D-乳酸的重復性色譜圖

3.1.3 穩(wěn)定性試驗

精密吸取乳酸菌素原料的同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、12、16、24 h 進樣檢測，根據(jù)峰面積考察樣品穩(wěn)定性。L-乳酸的RSD 值為1.32%，D-乳酸的RSD 值為1.21%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 L-乳酸、D-乳酸的穩(wěn)定性色譜圖

3.1.4 加樣回收試驗

精密稱取乳酸菌素原料的同一批樣品6 份，每份稱約0.10 g，至于25 mL 容量瓶中，同時各移取10 mL同一濃度的對照品溶液（L-乳酸0.8043 mg/mL、D-乳酸0.7172 mg/mL）至容量瓶中，按“2.1.2”項下供試品制備方法平行制備，通過進樣檢測，根據(jù)峰面積與回歸方程計算其含量。

L-乳酸的平均回收率為98.90%，D-乳酸的平均回收率為100.26%，RSD 值分別為1.89、1.44。

3.2 不同廠家乳酸菌素原料中L-乳酸、D-乳酸的含量測定

按“2.1.2”項下供試品制備方法平行制備，對3 個不同廠家乳酸菌素原料中L-乳酸、D-乳酸的含量進行檢測。

表1 不同廠家乳酸菌素原料中L-乳酸、D-乳酸的含量 mg/g

由表中結(jié)果可知，不同廠家的乳酸菌素原料中，L-乳酸與D-乳酸的含量有明顯差別，兩者比值均大于1。其中廠家C 的L-乳酸含量最高，廠家B 的居中,而廠家A 的含量最低,就L-乳酸含量進行排序為C＞B＞A。

3.3 短鏈脂肪酸標準品的測定

3.3.1 短鏈脂肪酸混標總離子流圖

7 種短鏈脂肪酸混合標液GC-MS 總離子流色譜如圖3。

表2 7種短鏈脂肪酸的出峰時間及線性關系結(jié)果

圖3 7種短鏈脂肪酸混合標液GC-MS總離子流色譜圖

3.3.2 短鏈脂肪酸線性關系

7種短鏈脂肪酸線性關系如表2。

3.4 不同廠家乳酸菌素原料中短鏈脂肪酸的含量測定

按“2.2.2”項下供試品制備方法制備樣品，對3 個不同廠家乳酸菌素原料中7 種短鏈脂肪酸的含量進行檢測。

表3 不同廠家乳酸菌素原料中短鏈脂肪酸的含量 μg/g

3.5 不同廠家乳酸菌素原料中短鏈脂肪酸主成分分析

采用SPSS 21.0 軟件，將三個廠家乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、7 種短鏈脂肪酸總量等8 個指標轉(zhuǎn)換成2 個主成分，這2 個主成分提供了100%的信息，且是綜合的，相互獨立的指標，因此可用這2 個主成分對各樣品進行綜合評價，結(jié)果如表4 所示，前2 個主成分的累積貢獻率為達100%，因此選定前2個主成分來概括樣品信息。

表4 特征值、方差貢獻及累積貢獻率

表5 是描述各因素對主成分貢獻的主成分系數(shù)向量，對主成分1 貢獻最大的是異戊酸、丙酸、戊酸、異丁酸、丁酸，對主成分2 貢獻最大的是7 種有機酸總量、乙酸、己酸、丁酸、異丁酸。

以 2 個主成分 F1、F2與其貢獻率構(gòu)建出三個廠家短鏈脂肪酸的綜合評價模型 F，F(xiàn) 是主成分 F1、F2的線性組合，即：F=72.047F1+27.953F2。

利用數(shù)學模型對三個廠家短鏈脂肪酸進行綜合評價，結(jié)果見表6。排名為C＞B＞A。

4 討 論

本研究參考高效液相色譜法[9、12]及氣質(zhì)聯(lián)用法[13-15]分別對乳酸菌素原料中的L-乳酸與D-乳酸及乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸等7 種短鏈脂肪酸進行了含量測定，并對短鏈脂肪酸結(jié)果進行了主成分分析。最終結(jié)合L-乳酸、7 種短鏈脂肪酸含量，判定三個廠家乳酸菌素原料質(zhì)量為C＞B＞A。實驗結(jié)果表明，本研究所用方法準確、可靠，可作為乳酸菌素原料質(zhì)量控制的方法之一。

表5 主成分系數(shù)向量

表6 3個廠家樣品的主成分得分值排序結(jié)果

不同廠家9 種有機酸的含量不同，可能是由脫脂奶粉的發(fā)酵工藝不同造成的，如發(fā)酵菌劑的活力、發(fā)酵時間或發(fā)酵溫度的差異等。在此基礎上，嘗試建立乳酸菌素原料品質(zhì)更全面更科學的評價體系，加入有機酸含量和比例的控制，可為進一步提高原料的品質(zhì)、改善發(fā)酵工藝提供科學依據(jù)。