慢性牙周炎患者外周血單核細(xì)胞Notch1 mRNA的表達(dá)及與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性

付海標(biāo)，閆俊杰

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，浙江 杭州 310053；2.麗水市人民醫(yī)院 口腔科，浙江 麗水 323000）

慢性牙周炎為常見的口腔疾病，可導(dǎo)致牙槽骨、牙骨質(zhì)、牙周膜和牙齦等牙周組織發(fā)炎，為一種長期感染性疾病。細(xì)菌菌斑在牙周的定殖可引起牙周慢性炎癥，導(dǎo)致牙槽骨和結(jié)締組織破壞，最終造成牙齒脫落。牙齦卟啉單胞菌、厭氧鏈球菌、中間型小球藻等厭氧菌為常見致病菌。慢性牙周炎的典型表現(xiàn)為免疫炎癥反應(yīng)。慢性牙周炎患者牙菌斑中的厭氧菌等致病菌可引起宿主發(fā)生免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，造成牙周組織的破壞；這些免疫炎癥反應(yīng)釋放的炎癥細(xì)胞因子進(jìn)入外周血，對(duì)全身各系統(tǒng)產(chǎn)生一定影響，可導(dǎo)致糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心?。┑燃膊?。輔助性T 細(xì)胞17（helper T cells 17,Th17）在慢性牙周炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1]。Th17 在健康人群外周血中也存在，主要參與維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，協(xié)助機(jī)體清除異物抗原，且不損傷人體自身組織。在牙菌斑的作用下，Th17 等T 細(xì)胞水平升高，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答為主的多種致炎因子水平升高，參與慢性牙周炎的發(fā)生[2]。白細(xì)胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）由Th17 細(xì)胞產(chǎn)生，具有非常強(qiáng)的致炎作用。在牙周炎時(shí)，輔助性T 細(xì)胞在牙周組織破壞階段通過誘導(dǎo)Th17 等細(xì)胞釋放IL-17 等致炎因子參與炎癥反應(yīng)過程[3]。IL-17 作為一種強(qiáng)大的致炎因子，參與牙周組織的炎癥反應(yīng)過程，且隨著炎癥程度的加重，IL-17 水平升高，IL-17 水平在一定程度上可反映慢性牙周炎的嚴(yán)重程度[4]。有研究發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者齦溝液和血漿中輔助性T 細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17 水平升高，認(rèn)為Th17 在牙周炎的發(fā)病過程中可能發(fā)揮促炎作用[5-6]。Th17 細(xì)胞的分化受多種信號(hào)通路調(diào)控，其中Notch 信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞分化的重要通路[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)Notch 信號(hào)通路在Th17 細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要作用[9]。但Notch 在慢性牙周炎患者外周血中的表達(dá)水平及其是否對(duì)Th17 細(xì)胞分化具有調(diào)控作用尚不清楚。本文對(duì)慢性牙周炎患者外周血單核細(xì)胞Notch1 mRNA 表達(dá)與Th17 細(xì)胞和疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系進(jìn)行研究，闡明其在慢性牙周炎中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月—2018年12月麗水市人民醫(yī)院口腔科收治的慢性牙周炎患者150 例作為觀察組，另取同期本院150 例健康體檢者作為對(duì)照組。觀察組根據(jù)病情嚴(yán)重程度[10]分為輕度組54 例，中度組51 例， 重度組45 例。觀察組男性77 例，女性73 例；年齡24 ～53 歲，平均（43.25±7.34）歲；體重指數(shù)（2.42±0.23）kg/m2。對(duì)照組男性75 例，女性75 例；年齡25 ～54 歲，平均（44.12±7.18）歲；體重指數(shù)（2.37±0.21）kg/m2。兩組年齡、性別、體重指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20 ～60 歲，臨床數(shù)據(jù)和資料完整，簽署知情同意書，依從性好，接受正規(guī)治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)： 吸煙；妊娠期或哺乳期女性；糖尿病、高血壓、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等其他疾病；侵襲性牙周炎；急慢性感染性疾?。幻庖呦到y(tǒng)疾?。挥绊慛otch1 水平的其他口腔疾?。唤佑|放射線；服用抗菌藥物、激素類藥物、免疫制劑。

1.2 方法

1.2.1 慢性牙周炎患者治療方法采用牙周基礎(chǔ)治療，包括口腔衛(wèi)生指導(dǎo)、口腔潔治、齦下刮治，治療后6 周復(fù)查。

1.2.2 標(biāo)本采集采集慢性牙周炎患者治療前后外周靜脈血，以及健康體檢者體檢當(dāng)天外周靜 脈血。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）測(cè)定外周血Notch1 mRNA采用Ficoll 密度分離法分離兩組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，參照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件： 94℃預(yù)變性60 s，94℃變性10 s、56℃退火10 s、72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔct法計(jì)算Notch1 mRNA。Notch1正向引物： 5'-GTCAACGCCGTAGATGACC-3'，反向引物： 5'-TTGTTAGCCCCGTTCTTCAG-3'， 長 度101 bp。qRT-PCR 試劑購自日本TaKaRa 公司。

1.2.4 外周血Th17 細(xì)胞、IL-17 水平測(cè)定采用流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血Th17 細(xì)胞水平，采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）測(cè)定外周血IL-17 水平。ELISA 試劑盒購自美國Sigma 公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血Notch1 mRNA 表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平比較

兩組外周血Notch1 mRNA表達(dá)及Th17細(xì)胞、IL-17水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組高于對(duì)照組（見表1）。Notch1 mRNA 擴(kuò)增曲線和熔解曲線見圖1、2。兩組外周血Th17 細(xì)胞流式細(xì)胞圖見圖3。

表1 兩組外周血Notch1 mRNA 表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平比較 （n =150，±s）

表1 兩組外周血Notch1 mRNA 表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平比較 （n =150，±s）

組別 Notch1 mRNA Th17 細(xì)胞/% IL-17/（pg/ml）對(duì)照組 1.00±0.06 0.51±0.11 0.61±0.13觀察組 1.56±0.08 1.14±0.15 0.75±0.12 t 值 68.586 41.481 9.692 P 值 0.000 0.000 0.000

圖1 Notch1 mRNA 擴(kuò)增曲線

圖2 Notch1 mRNA 熔解曲線

圖3 兩組外周血Th17 細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

2.2 不同嚴(yán)重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA 表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平比較

不同嚴(yán)重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA 表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中度組和重度組高于輕度組（P＜0.05），重度組高于中度組（P＜0.05）。見表2。

表2 不同嚴(yán)重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平比較 （±s）

表2 不同嚴(yán)重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平比較 （±s）

注： ①與輕度組比較，P ＜0.05；②與中度組比較，P ＜0.05。

組別 n Notch1 mRNA Th17 細(xì)胞/% IL-17/（pg/ml）輕度組 54 1.27±0.07 0.87±0.14 0.68±0.11中度組 51 1.53±0.08① 1.11±0.15① 0.77±0.12①重度組 45 1.72±0.09①② 1.24±0.16①② 0.87±0.10①②F 值 398.394 78.944 36.174 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 治療前后外周血Notch1 mRNA 表達(dá)及Th17細(xì)胞、IL-17 水平比較

慢性牙周炎患者治療前后外周血Notch1 mRNA 表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平比較，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療后低于治療前。見表3。

表3 治療前后外周血Notch1 mRNA 表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平比較 （n =150，±s）

表3 治療前后外周血Notch1 mRNA 表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平比較 （n =150，±s）

時(shí)間 Notch1 mRNA Th17 細(xì)胞/% IL-17/（pg/ml）治療前 1.56±0.08 1.14±0.15 0.75±0.12治療后 1.12±0.09 0.63±0.13 0.64±0.11 t 值 58.876 93.081 67.361 P 值 0.000 0.000 0.000

2.4 慢性牙周炎患者治療前外周血Notch1 mRNA表達(dá)與Th17 細(xì)胞、IL-17 水平的相關(guān)性

慢性牙周炎患者治療前外周血Notch1 mRNA 表達(dá)與Th17 細(xì)胞、IL-17 水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表4。

表4 慢性牙周炎患者治療前外周血Notch1 mRNA 表達(dá)與Th17 細(xì)胞、IL-17 水平的相關(guān)性

3 討論

慢性牙周炎是牙周組織破壞的主要原因，為牙周軟組織的炎癥狀態(tài)及對(duì)牙齒菌斑的直接免疫反應(yīng)[11]。慢性牙周炎為難治性疾病，是導(dǎo)致成人牙齒缺失的主要原因。慢性牙周炎也增加冠心病、低出生體重兒等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)人類健康造成危害。隨著免疫學(xué)的發(fā)展，大量研究證實(shí)慢性牙周炎是一種由T 細(xì)胞介導(dǎo)的、細(xì)胞免疫應(yīng)答為主的、多種致炎因子共同參與的慢性炎癥性疾病[2]。

本研究結(jié)果表明，慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA 表達(dá)及Th17 細(xì)胞、IL-17 水平升高，外周血Notch1 mRNA 表達(dá)與Th17 細(xì)胞、IL-17 水平呈正相關(guān)。Notch 家族為一種十分保守的跨膜蛋白，在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中廣泛存在[12]，在胚胎形成、免疫細(xì)胞分化及功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作 用[13-14]。Notch 家族可通過Notch1 在Th17 細(xì)胞分化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、過敏性哮喘等常見自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[15-16]，如呼吸道合胞病毒通過激活Notch1 促進(jìn)氣道微環(huán)境中Th17 細(xì)胞的分化[17]；Notch1 信號(hào)可促進(jìn)銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞分化[18]。張黎等[19]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Notch1信號(hào)通路在慢性牙周炎大鼠的免疫平衡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。結(jié)合本研究結(jié)果及既往研究分析，Notch1 mRNA 可能通過促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，參與慢性牙周炎的發(fā)病過程。

本研究中隨著慢性牙周炎嚴(yán)重程度增加，外周血Notch1 mRNA 表達(dá)升高，治療后隨著牙周炎的控制，外周血Notch1 mRNA 表達(dá)降低，表明其在一定程度上可反映慢性牙周炎的病情嚴(yán)重程度，病情越嚴(yán)重，免疫炎癥反應(yīng)越顯著，Notch1 mRNA 表達(dá)越高，通過調(diào)控Th17 細(xì)胞分化，導(dǎo)致IL-17 等促炎細(xì)胞因子水平升高，進(jìn)一步加重病情發(fā)展。

Notch1 mRNA 可促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化，但其機(jī)制尚不清楚，探討Notch1 mRNA 促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化的機(jī)制將是下一步需要研究的內(nèi)容。