MicroRNA-92a對大鼠脊髓損傷后運動功能恢復(fù)的影響

黃偉，錢錦鋒，蔡執(zhí)中，姜葉飛

（武警海警總隊醫(yī)院 骨四科，浙江 嘉興 314000）

脊髓損傷是一種毀滅性的疾病，通常導致患者終身殘疾[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球約有250 萬人受脊髓損傷的影響[2]。脊髓損傷后，脊髓回路下行通路斷開，導致其失去運動相關(guān)突觸輸入[3]，嚴重影響患者對運動的控制[4]。目前，脊髓損傷的治療仍是臨床和基礎(chǔ)科學研究的最大挑戰(zhàn)之一[5]，迫切需要開發(fā)新療法。MicroRNA（miRNA）在多種疾病中起重要調(diào)控作用，已有多項研究證實其在脊髓損傷中的表達及功能[6]。WANG 等[7]研究表明，miR-21-5p 介導脊髓損傷后纖維瘢痕的形成，促進脊髓損傷恢復(fù)。YANG 等[8]研究表明，少突膠質(zhì)細胞前體細胞移植可促進大鼠脊髓損傷后的功能恢復(fù)，進一步檢測發(fā)現(xiàn)其功能恢復(fù)與miR-375-3p、miR-1-3p、miR-363-3p等表達水平改變有關(guān)。ZHAO 等[9]研究表明，miR-124 促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)源性細胞，加速脊髓損傷恢復(fù)。miRNA的異常表達被認為與大鼠脊髓損傷功能恢復(fù)相關(guān)，miR-92a、miR-202、miR-132、miR-451、miR-27b、miR-208、miR-17、miR-128、miR-107、miR-223等被報道在大鼠脊髓損傷組織中表達異常[2，5-6，10-12]。 然而，miRNA 在脊髓損傷后運動功能恢復(fù)中的作用報道較少。

本研究復(fù)制大鼠脊髓損傷模型，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）在大鼠脊髓損傷組織中篩選出目標miRNA，進一步研究該miRNA 在大鼠脊髓損傷后運動功能恢復(fù)中可能的分子機制，為脊髓損傷的精準治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物6 周齡清潔級雄性Spregue-Dawley大鼠84 只，體重200 ～250 g，動物許可證號： SCXK（京）2011-0001，由昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供。所有實驗程序獲昆明醫(yī)科大學動物保護與使用委員會批準。24℃恒溫環(huán)境飼養(yǎng)，12 h 明暗交替，自由飲水進食。按照隨機對照動物實驗方法，將84 只實驗大鼠隨機分為2 批，第一批30 只分為假手術(shù)組和脊髓損傷組，每組15 只；第二批54 只分為假手術(shù)組、對照組（脊髓損傷+miR-92a mimics negative control）和實驗組（脊髓損傷+miR-92a mimics），每組18 只。本實驗2017年4月—2018年7月在昆明醫(yī)科大學科研實驗中心完成。

1.1.2 實驗細胞大鼠小膠質(zhì)細胞BV-2（貨號： RAT-CELL-0077）購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。將細胞置于添加10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，37℃、5%二氧化碳條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.3 主要儀器及試劑倒置顯微鏡（日本Olympus公司），qRT-PCR 儀（美國賽默飛世爾公司）。多聚甲醇（美國Hyclone 公司），Triton（美國遠慕生物公司），TUNEL 染色混合液（瑞士Roche 公司），RIPA 裂解液、BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PTEN抗體、Caspase-3 抗體、Bax 抗體、Bcl-2 抗體和β-actin抗體（英國Abcam 公司），Trizol（日本TaKaRa 公司），水合氯醛、TaqMan ? MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司），miR-92a mimics、miR-92a mimics negative control（廣州銳博生物科技有限公司），Lipofectamine?2000、雙熒光素酶報告基因試劑盒（美國賽默飛世爾公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)制大鼠脊髓損傷模型第一批大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉后，脊髓損傷組在T9～T10水平進行椎板切除手術(shù)，在不破壞硬腦膜的情況下暴露脊髓，隨后夾緊T8和T11的棘突以穩(wěn)定脊柱，使用紐約大學沖擊器[5]對暴露在外的脊髓背側(cè)表面進行挫傷損傷（10 g×25 mm）；假手術(shù)組大鼠采用T10椎板切除術(shù)，未出現(xiàn)體重下降。

1.2.2 miR-92a mimics 干預(yù)第二批實驗組大鼠在脊髓損傷后立即髓鞘內(nèi)注射miR-92a mimics（1μl/h，20 nmol/ml），持續(xù)3 d；對照組大鼠脊髓損傷后鞘內(nèi)注射等量miR-92a mimics negative control，方法同實驗組。

1.2.3 BBB 評分評估大鼠術(shù)后行為在脊髓損傷后第1、3、7、14、21 和28 天，采用BBB 評分評估大鼠后肢運動功能。評分采用雙盲法，由3 位經(jīng)驗豐富的評分人獨立完成，最終取3 人評分的均值。

1.2.4 TUNEL 染色檢測細胞凋亡情況取脊髓組織切片于室溫下固定20 min，PBS 清洗30 min，隨后4℃、0.1% Triton X-100 透化2 min。PBS 清洗2 次，加入TUNEL 染色混合液，37℃條件下避光孵育1 h，加入1μg/ml DAPI，室溫下避光孵育10 min。清洗后甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blotting 檢測PTEN 和凋亡相關(guān)蛋白術(shù)后第28 天取脊髓，截取包含損傷中心的1 cm 脊髓段，使用RIPA 裂解液提取脊髓組織或BV-2 細胞中總蛋白。采用BCA 法測定蛋白濃度，配制12%分離凝膠，每個泳道加入30μg 蛋白樣品。電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，室溫封閉2 h。加入一抗： PTEN 抗體（1∶1 000）、Caspase-3 抗體（1∶1 000）、Bax 抗體（1∶1 000）、Bcl-2 抗體（1∶1 000）、β-actin 抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜。次日，加入抗大鼠IgG 辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗（1∶2 000），4℃孵育90 min。使用UVP 凝膠成像系統(tǒng)成像、Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，實驗重復(fù)3 次。

1.2.6 qRT-PCR檢測miRNAs 和PTEN mRNA術(shù)后第28 天取脊髓，使用Trizol 提取脊髓損傷組織總RNA 并確定總RNA 的純度和濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNAs 和PTEN mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取適量cDNA 配置PCR 反應(yīng)體系，miRNAs 以U6 為內(nèi)參，PTEN mRNA 以GAPDH 為內(nèi)參，引物序列見表1。實驗重復(fù)3 次，采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因驗證miR-92a 與PTEN的靶向關(guān)系構(gòu)建包含miR-92a 和PTEN-3' UTR 結(jié)合位點的PTEN-3' UTR（PTEN-WT），以及不含該結(jié)合位點的PTEN-3' UTR（PTEN-MUT）載體質(zhì)粒。將BV-2 細胞接種于24 孔板中（2×105個/孔），使用Lipofectamine 2000 試劑共轉(zhuǎn)染，分為對照組（載體質(zhì)粒+miR-92a mimics negative control）和實驗組（載體質(zhì)粒+miR-92a mimics）。轉(zhuǎn)染48 h 后測定熒光素酶活性，實驗重復(fù)3 次。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗或單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，方差分析的兩兩比較用LSD-t檢驗；相關(guān)性分析用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓損傷模型評估

脊髓損傷組與假手術(shù)組大鼠第1、3、7、14、21、28 天BBB 評分比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果： ①不同時間點的BBB 評分有差異（F=103.273，P=0.000）；②假手術(shù)組與脊髓損傷組的BBB 評分有差異（F=93.474，P=0.000），假手術(shù)組BBB 評分較高；③兩組BBB 評分變化趨勢有差異（F=59.057，P=0.000）。見表2。

脊髓損傷組與假手術(shù)組大鼠細胞凋亡率比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3和圖1。

脊髓損傷組與假手術(shù)組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2 相對表達量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3和圖2。

表2 兩組大鼠各時間點BBB 評分比較 （n =15，±s）

表2 兩組大鼠各時間點BBB 評分比較 （n =15，±s）

組別 第1 天 第3 天 第7 天 第14 天 第21 天 第28 天脊髓損傷組 1.07±0.33 3.95±1.35 6.23±1.97 11.41±4.02 12.28±4.27 12.87±4.55假手術(shù)組 20.32±6.65 17.04±5.61 24.18±7.89 16.73±5.17 18.86±6.28 18.32±5.98

表3 兩組大鼠細胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Bcl-2 表達水平比較 （n =15，±s）

表3 兩組大鼠細胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Bcl-2 表達水平比較 （n =15，±s）

組別 細胞凋亡率/% Caspase-3 Bax Bcl-2脊髓損傷組 29.37±4.42 2.86±0.72 2.25±0.56 2.04±0.52假手術(shù)組 16.18±3.07 1.94±0.51 1.62±0.41 3.85±0.97 t 值 9.493 4.038 3.516 6.369 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 兩組大鼠脊髓組織中細胞凋亡情況（TUNEL 染色×200）

2.2 大鼠脊髓組織中miRNAs 的異常表達

脊髓損傷組與假手術(shù)組大鼠miR-92a、miR-132、miR-128、miR-107、miR-17、miR-202、miR-451表達水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；miR-27b、miR-208、miR-223 表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4和圖3。

圖2 兩組凋亡相關(guān)蛋白相對表達量比較 （n =15，±s）

表4 兩組大鼠脊髓組織中miRNAs 的表達水平比較 （n =15，±s）

表4 兩組大鼠脊髓組織中miRNAs 的表達水平比較 （n =15，±s）

組別 miR-92a miR-132 miR-128 miR-107 miR-27b miR-17 miR-208 miR-223 miR-202 miR-451脊髓損傷組-4.03±1.12 -3.25±1.08 -2.84±1.02 -2.21±1.02 -1.06±0.34 1.79±0.98 1.11±0.36 1.14±0.37 3.39±1.24 4.12±1.55假手術(shù)組 -1.04±0.32 -1.02±0.31 -1.03±0.32 -1.03±0.31 -1.03±0.33 1.09±0.37 1.09±0.35 1.10±0.35 1.08±0.35 1.10±0.37 t 值 9.942 7.687 6.558 4.287 0.245 2.366 0.154 0.304 6.944 7.340 P 值 0.000 0.000 0.000 0.001 0.808 0.030 0.879 0.763 0.000 0.000

圖3 兩組大鼠脊髓組織中miRNAs 表達水平比較 （n =15，±s）

2.3 miR-92a 促進大鼠脊髓損傷運動功能恢復(fù)并抑制細胞凋亡

假手術(shù)組、對照組、實驗組大鼠第1、7、14 和28 天的miR-92a 表達水平比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果： ①不同時間點的miR-92a 表達水平有差異（F=78.341，P=0.000）；②3 組miR-92a 表達水平有差異（F=53.409，P=0.000），實驗組miR-92a表達水平最高（P＜0.05）；③3 組miR-92a 表達水平變化趨勢有差異（F=31.351，P=0.000）。見表5。

假手術(shù)組、對照組、實驗組大鼠第1、3、7、14、21 和28 天的BBB 評分比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果： ①不同時間點的BBB 評分有差異（F=44.751，P=0.000）；②3 組BBB 評分有差異（F=76.832，P=0.000），假手術(shù)組BBB 評分最高（P＜0.05）；③3 組BBB 評分變化趨勢有差異（F=52.059，P=0.000）。見表6。

表5 3 組大鼠各時間點miR-92a 表達水平比較 （n =18，±s）

表5 3 組大鼠各時間點miR-92a 表達水平比較 （n =18，±s）

組別 第1 天 第7 天 第14 天 第28 天假手術(shù)組 0.96±0.31 0.83±0.24 0.92±0.29 0.77±0.23對照組 0.95±0.31 0.96±0.31 0.95±0.32 0.96±0.33實驗組 0.97±0.32 1.94±0.65 3.94±1.31 2.86±0.98

表6 3 組大鼠各時間點BBB 評分比較 （n =18，±s）

表6 3 組大鼠各時間點BBB 評分比較 （n =18，±s）

組別 第1 天 第3 天 第7 天 第14 天 第21 天 第28 天假手術(shù)組 20.32±6.65 17.04±5.61 24.18±7.89 16.73±5.17 18.86±6.28 18.32±5.98對照組 0.96±0.32 2.58±0.86 4.18±1.36 7.32±2.37 9.25±3.08 10.84±3.62實驗組 0.95±0.31 3.04±1.01 7.13±2.34 11.43±3.84 12.84±4.28 14.27±4.35

3 組大鼠細胞凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=23.015，P=0.000）；對照組高于假手術(shù)組和實驗組。見表7和圖4。

3 組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=26.909、33.417 和29.053，均P=0.000）；對照組Caspase-3、Bax 高于假手術(shù)組和實驗組，Bcl-2 低于假手術(shù)組和實驗組。見表7和圖5。

表7 3 組大鼠細胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Bcl-2 表達水平比較 （n =18，±s）

表7 3 組大鼠細胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Bcl-2 表達水平比較 （n =18，±s）

組別 細胞凋亡率/% Caspase-3 Bax Bcl-2假手術(shù)組 16.18±3.07 1.94±0.51 1.62±0.41 3.66±0.91對照組 64.91±9.77 3.49±0.87 3.68±0.92 1.37±0.39實驗組 21.38±7.14 2.17±0.54 1.64±0.41 2.04±0.52 F 值 23.015 26.909 33.417 29.053 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 3 組大鼠脊髓組織中細胞凋亡情況 （TUNEL 染色×200）

圖5 3 組大鼠凋亡相關(guān)蛋白相對表達量比較 （n =18，±s）

2.4 PTEN 是miR-92a 的靶基因

對照組與實驗組大鼠PTEN-WT 熒光活性比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.816，P=0.000），實驗組低于對照組；兩組PTEN-MUT 熒光活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.173，P=0.864）。見表8。

對照組與實驗組大鼠PTEN mRNA 和蛋白相對表達量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.654和3.058，P=0.000 和0.004），實驗組低于對照組（見表8和圖6）。PTEN 與miR-92a 表達水平呈負相關(guān)（r=-0.876，P=0.000）（見圖7）。

表8 兩組大鼠PTEN-WT 和PTEN-MUT 熒光活性以及PTEN mRNA 和蛋白相對表達量比較 （n =18，±s）

表8 兩組大鼠PTEN-WT 和PTEN-MUT 熒光活性以及PTEN mRNA 和蛋白相對表達量比較 （n =18，±s）

組別 PTEN-WT 熒光活性 PTEN-MUT 熒光活性 PTEN mRNA PTEN 蛋白對照組 1.09±0.52 1.11±0.53 3.02±0.54 1.36±0.51實驗組 0.43±0.26 1.08±0.51 2.10±0.43 0.91±0.36 t 值 4.816 0.173 5.654 3.058 P 值 0.000 0.864 0.000 0.004

圖6 兩組大鼠PTEN 蛋白相對表達量比較 （n =18，±s）

3 討論

脊髓損傷常導致患者運動功能受損，嚴重時可導致殘疾、癱瘓甚至死亡[13]。然而，目前尚未有一種療法可以有效地阻止脊髓損傷的發(fā)展進程[14]。近年來，對miRNAs 的研究提示其可能在脊髓損傷恢復(fù)中扮演著重要角色[15]，為脊髓損傷恢復(fù)的分子機制研究提供了新思路。YU 等[16]研究表明，miR-133b 在成年斑馬魚脊髓損傷組織中高表達，對其脊髓損傷后的功能恢復(fù)至關(guān)重要。miR-133b 靶向軸突生長抑制劑RhoA，使用嗎啉反義寡核苷酸抑制miR-133b 的表達，導致脊髓損傷的成年斑馬魚運動功能恢復(fù)，NMLF、SRF和IMRF 神經(jīng)元軸突減少。YI 等[17]研究表明，miR-155 缺乏會抑制Th17 細胞分化，促進脊髓損傷后的運動功能恢復(fù)。BHALALA 等[18]研究表明，小鼠脊髓損傷后，miR-21 呈時間依賴性升高，病變區(qū)域的星形膠質(zhì)細胞表達高水平miR-21。敲除miR-21 可促進脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成，從而促進脊髓損傷恢復(fù)。WANG 等[19]研究表明，cAMP 是3 條參與坐骨神經(jīng)損傷調(diào)節(jié)、促進神經(jīng)突觸生長的信號通路的上游調(diào)控因子。miR-142-3p 可通過AC9 誘導cAMP 升高，促進神經(jīng)突生長，有助于脊髓損傷后的感覺功能恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-92a 在大鼠脊髓損傷組織中低表達，過表達miR-92a 有助于脊髓損傷大鼠運動功能恢復(fù)并抑制細胞凋亡。

PTEN 作為一個脊髓損傷后負調(diào)節(jié)因子，可抑制脊髓損傷后的神經(jīng)新生[20]和軸突再生[21]，同時PTEN在細胞增殖、凋亡和神經(jīng)元分化方面也發(fā)揮重要作用。YAN 等[22]研究表明，PTEN通過激活Wnt/β-catenin通路，抑制胰腺炎細胞增殖和遷移。MATSUDA 等[23]報道，過表達PTEN 通過抑制PI3K/Akt 信號通路，抑制細胞凋亡。LEE 等[24]研究表明，PTEN 可通過抑制ERK 信號與S6K 信號的相互作用，促進神經(jīng)元分化。有研究表明，PTEN 在脊髓損傷組織中高表達[25]，敲除PTEN可促進脊髓損傷大鼠的運動功能恢復(fù)[26-27]。HU等[28]研究表明，miR-21 靶向PTEN 抑制脊髓損傷大鼠細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN是miR-92a 的一個靶基因，在大鼠脊髓損傷組織中表達上調(diào)。大鼠脊髓損傷組織中，PTEN 與miR-92a 表達水平呈負相關(guān)。

綜上所述，miR-92a 可能通過調(diào)節(jié)PTEN 促進大鼠脊髓損傷后的運動功能恢復(fù)。PTEN是miR-92a的靶基因，miR-92a 可能通過調(diào)節(jié)PTEN 從而促進大鼠脊髓損傷后運動功能恢復(fù)。受實驗設(shè)備、研究時長等因素影響，本研究有不足之處，后期將進一步 完善。