維生素B2在胃癌中的作用及機(jī)制研究

周儉，唐朝亮，胡文軍△，田添

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，2017 年我國(guó)胃癌發(fā)病率僅次于肺癌而居第2 位（39.78/10萬(wàn)），死亡率居第3 位（25.16/10 萬(wàn)）［1］。盡管外科手術(shù)、化療和靶向藥物等治療手段在胃癌的治療方面取得了一定的進(jìn)展，但進(jìn)展期患者的5 年生存率不足50%［2-3］。維生素B2（Vit B2）又稱核黃素，屬B 族維生素，是體內(nèi)黃酶類輔基的重要組成部分。Vit B2積極參與了核苷酸的合成、DNA 甲基化和修復(fù)等生化過(guò)程，與食管癌［4-5］、結(jié)直腸癌［6］、宮頸癌［7］和乳腺癌［8］等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。有研究顯示，血清高Vit B2 水平可降低胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［9］。阿帕替尼是我國(guó)自主研發(fā)的抗腫瘤藥物，廣泛用于胃癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的治療［10］。目前臨床上已將阿帕替尼與其他藥物或治療方法進(jìn)行同步聯(lián)合，得到較單藥更好的治療效果［10-11］，但阿帕替尼與Vit B2聯(lián)合用藥對(duì)胃癌的抗腫瘤效應(yīng)尚少見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究對(duì)Vit B2水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，并探討Vit B2 協(xié)同阿帕替尼對(duì)胃癌MGC-803 細(xì)胞增殖活性和凋亡的影響，以期為胃癌的精準(zhǔn)治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018 年1 月—2019 年4 月阜陽(yáng)市人民醫(yī)院腫瘤科收治的胃癌患者（胃癌組）39例，其中男25例，女14例；年齡35～79歲，平均（51.4±15.8）歲，所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胃癌，且未接受手術(shù)或放化療等治療。另?yè)裎以后w檢中心同期健康體檢者40例為對(duì)照組，其中男21例，女19 例，年齡 36～71 歲，平均（49.2±13.2）歲；2 組性別（χ2=1.093）、年齡（t=0.671）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。收集胃癌患者的臨床資料，包括病理類型、組織學(xué)分型、手術(shù)情況和既往病史等。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且獲所有研究對(duì)象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 人胃癌MGC-803細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Vit B2購(gòu)自美國(guó)Sigam 公司；阿帕替尼購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；CCK-8 試劑盒、TRIzol 液和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自瑞士Roche 公司；凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司；乳酸、葡萄糖和琥珀酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。細(xì)胞培養(yǎng)箱、分光光度計(jì)和高速低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)儀購(gòu)自瑞士Roche公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集與檢測(cè) 所有研究對(duì)象均于清晨空腹抽取靜脈血3 mL，送安徽華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行檢測(cè)。操作步驟如下：低溫高速離心機(jī)3 000×g離心20 min，吸取血清樣本，加入Vit B2樣品處理液后置于LVK3000維生素檢測(cè)儀中，嚴(yán)格按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)血清Vit B2水平。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和氧化磷酸化水平檢測(cè) 將液氮保存的人胃癌MGC-803細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，接種于IMDM培養(yǎng)基并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，采用0.25%胰酶消化、傳代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板中，實(shí)驗(yàn)設(shè)5 個(gè)不同濃度（0、10、25、50和100 μmol/L）Vit B2組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。經(jīng)不同濃度Vit B2處理24 h后，檢測(cè)乳酸、葡萄糖、琥珀酸脫氫酶含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3.3 qPCR檢測(cè)細(xì)胞調(diào)節(jié)糖酵解途徑關(guān)鍵酶及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1（GLUT1）mRNA表達(dá) 藥物處理24 h后收集細(xì)胞，PBS清洗 3 次。按 500 μL/孔加入 TRIzol 裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用SYBR Green 試劑進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 10 s，59～62 ℃退火30 s，72 ℃延長(zhǎng)30 s，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）、丙酮酸激酶M2（PKM2）和GLUT1mRNA 表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

Tab.1 The information of qPCR primers表1 qPCR引物序列

1.3.4 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，更換為含有不同藥物的培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為4 組，分別為對(duì)照組、Vit B2 組（加入50 μmol/L Vit B2）、阿帕替尼組（1 μmol/L阿帕替尼）和聯(lián)合用藥組（加入50 μmol/L Vit B2 和1 μmol/L阿帕替尼），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別于0、12、24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱溫育1 h，采用酶標(biāo)儀（EL-10C，Biobase 公司）于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各組光密度（OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 藥物處理24 h 后棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，加入適量胰酶消化細(xì)胞。吸除胰酶，加入預(yù)冷的PBS以重懸細(xì)胞，離心后棄去上清，加入500 μL 的1×結(jié)合緩沖液，制備單細(xì)胞懸液。分別加入5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI 染色液，混勻后避光孵育 15 min。將離心管置于流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur，美國(guó)BD Bioscience公司）中，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)；不同時(shí)點(diǎn)多組間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組與對(duì)照組血清Vit B2水平比較 胃癌組患者血清Vit B2 水平（207.85±39.71）μg/L 顯著低于對(duì)照組（246.07±45.43）μg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.978，P＜0.05）。

2.2 血清Vit B2 與胃癌患者臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 血清Vit B2 水平與TNM 分期和分化程度有關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、吸煙史和飲酒史無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of serum vitamin B2 between the different clinicopathological characteristics表2 不同臨床病理特征患者血液Vit B2水平比較（n=39）

2.3 不同濃度Vit B2組氧化磷酸化水平比較 除0 μmol/L 與10 μmol/L Vit B2 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，25、50、100 μmol/L Vit B2 組葡萄糖消耗量和乳酸生成量均低于0 μmol/L Vit B2組（均P＜0.05），琥珀酸脫氫酶含量均高于0 μmol/L Vit B2 組（均P＜0.05）；50 μmol/L Vit B2組葡萄糖消耗量和乳酸生成量最低，見(jiàn)表3。

Tab.3 Comparison of activities of mitochondrial respiratory chain complex between five groups表3 各Vit B2組細(xì)胞氧化磷酸化指標(biāo)的比較（n=5，）

Tab.3 Comparison of activities of mitochondrial respiratory chain complex between five groups表3 各Vit B2組細(xì)胞氧化磷酸化指標(biāo)的比較（n=5，）

＊P＜0.05；a 與 0 μmol/L 組比較，b 與 10 μmol/L 組比較，c 與 25 μmol/L組比較，d與50 μmol/L組比較，P＜0.05

組別0 μmol/L組10 μmol/L組25 μmol/L組50 μmol/L組100 μmol/L組F葡萄糖消耗量（mmol/mg蛋白）10.17±0.84 9.86±0.71 8.74±0.78a 6.83±0.62abc 8.28±0.72abd 16.433＊乳酸生成量（mmol/mg蛋白）3.21±0.33 3.06±0.23 2.58±0.22a 2.22±0.24ab 2.78±0.32ad 10.414＊琥珀酸脫氫酶（U/mgprot）5.56±0.34 5.92±0.41 6.37±0.34a 7.53±0.44abc 6.82±0.46ab 18.516＊

2.4 不同濃度Vit B2 組細(xì)胞HKⅡ、PKM2和GLUT1mRNA水平比較 除0 μmol/L與10 μmol/L Vit B2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，25、50、100 μmol/L Vit B2組細(xì)胞HKⅡ、PKM2和GLUT1mRNA 水平均低于0 μmol/L Vit B2 組（均P＜0.05），且50 μmol/L Vit B2組GLUT1mRNA水平最低，見(jiàn)表4。

Tab.4 Comparison of relative mRNA expressions between five groups表4 各Vit B2組細(xì)胞糖酵解mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（n=5，）

Tab.4 Comparison of relative mRNA expressions between five groups表4 各Vit B2組細(xì)胞糖酵解mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（n=5，）

＊P＜0.05；a 與 0 μmol/L 組比較，b 與 10 μmol/L 組比較，c 與 25 μmol/L組比較，d與50 μmol/L組比較，P＜0.05

組別0 μmol/L組10 μmol/L組25 μmol/L組50 μmol/L組100 μmol/L組F HKⅡ1.00±0.11 0.93±0.07 0.75±0.07ab 0.56±0.06abc 0.69±0.05ab 28.603＊PKM2 1.00±0.12 0.96±0.09 0.71±0.06ab 0.51±0.06abc 0.61±0.04ab 36.965＊GLUT1 1.00±0.10 0.89±0.05 0.66±0.07ab 0.43±0.04abc 0.59±0.05abd 61.558＊

2.5 各組細(xì)胞增殖活性比較 各組細(xì)胞增殖活性均隨時(shí)間基本呈增高趨勢(shì)。0 h 和12 h 時(shí)各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；24、48 和72 h 時(shí)，對(duì)照組、Vit B2組、阿帕替尼組和聯(lián)合用藥組胃癌細(xì)胞增殖活性依次降低，組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。

2.6 各組胃癌細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組、Vit B2組、阿帕替尼組和聯(lián)合用藥組胃癌細(xì)胞凋亡率依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1、2。

Tab.5 Comparison of cell proliferation activities between four groups表5 各組細(xì)胞增殖活性的比較 （n=5，OD值，）

Tab.5 Comparison of cell proliferation activities between four groups表5 各組細(xì)胞增殖活性的比較 （n=5，OD值，）

＊P＜0.05；F組間=93.270，F(xiàn)時(shí)間=335.300，F(xiàn)交互=14.590，均P＜0.05；組間比較：a與對(duì)照組比較，b與Vit B2組比較，c與阿帕替尼組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與0 h比較，B與12 h比較，C與24 h比較，D與48 h比較，P＜0.05

組別對(duì)照組Vit B2組阿帕替尼組聯(lián)合用藥組F 0 h 0.33±0.03 0.35±0.03 0.31±0.03 0.31±0.03 2.037 12 h 0.42±0.04A 0.40±0.04 0.40±0.03A 0.39±0.03A 0.633 24 h 0.59±0.04AB 0.58±0.04aAB 0.55±0.04abAB 0.44±0.04abcA 15.213＊48 h 0.78±0.05ABC 0.71±0.05aABC 0.59±0.04abAB 0.48±0.04abcAB 42.765＊72 h 0.89±0.05ABCD 0.78±0.05aABC 0.68±0.04abABC 0.52±0.04abcABC 60.228＊F 160.512＊96.794＊82.086＊25.271＊

Fig.1 The apoptosis detected by flow cytometry圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

Fig.2 Comparison of apoptosis rate between four groups of cells圖2 4組細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的微生物可合成少量Vit B2，但機(jī)體所需的大部分Vit B2 仍需要從食物中獲得。在體內(nèi)，Vit B2 主要有黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸2 種形式，為細(xì)胞氧化磷酸化反應(yīng)鏈中重要的輔因子，與細(xì)胞代謝和能量供應(yīng)密切相關(guān)。流行病學(xué)研究顯示，在食管癌高發(fā)地區(qū)，居民膳食Vit B2 攝入量顯著低于正常水平，且通過(guò)補(bǔ)充Vit B2 可顯著降低該地食管癌的發(fā)生率，提高患者的生存率［5］。此外，有研究指出，高Vit B2攝入可將胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低65%［12］。上述研究表明，Vit B2 具有潛在的抗腫瘤效應(yīng)。但Vit B2在胃癌致病過(guò)程中的具體作用尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，胃癌患者血清Vit B2 水平顯著低于對(duì)照組，且血清Vit B2 水平與胃癌患者的TNM 分期和分化程度相關(guān)，提示Vit B2可能在胃癌的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

正常細(xì)胞的能量供應(yīng)主要以消耗葡萄糖進(jìn)行有氧氧化磷酸化為主，這種方式效率高，幾乎不產(chǎn)生乳酸。而腫瘤細(xì)胞則明顯不同，主要以消耗葡萄糖進(jìn)行糖酵解為主，同時(shí)產(chǎn)生大量的乳酸［13-14］。研究表明，腫瘤細(xì)胞糖酵解顯著增強(qiáng)，而氧化磷酸化功能則明顯降低［14-15］。HKⅡ和PKM2是腫瘤細(xì)胞的糖酵解代謝的主要限速酶，GLUT1 也是將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵酶［16-17］。琥珀酸脫氫酶是連接氧化磷酸化和線粒體呼吸鏈的樞紐之一，可作為評(píng)價(jià)氧化磷酸化的指標(biāo)。研究表明，Vit B2 缺乏可以降低肝癌HepG2 細(xì)胞氧化磷酸化水平，通過(guò)加快葡萄糖消耗和產(chǎn)生大量乳酸，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖活性［18］。本研究結(jié)果顯示，25、50、100 μmol/L Vit B2 組葡萄糖消耗量和乳酸生成量均低于0 μmol/L Vit B2 組，琥珀酸脫氫酶含量均高于0 μmol/L Vit B2組；另外，25、50、100 μmol/L Vit B2 組細(xì)胞HKⅡ、PKM2和GLUT1mRNA 水平均低于 0 μmol/L Vit B2 組。提示補(bǔ)充Vit B2 可上調(diào)琥珀酸脫氫酶的活性，降低葡萄糖消耗量和乳酸生成量；且其作用機(jī)制可能與下調(diào)胃癌細(xì)胞HKⅡ、PKM2和GLUT1的表達(dá)水平有關(guān)。另外，50 μmol/L Vit B2組葡萄糖消耗量和乳酸生成量最低，且50 μmol/L Vit B2組GLUT1mRNA水平最低。故選擇50 μmol/L 維生素這一濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

阿帕替尼通過(guò)抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［10，19］。2014 年，阿帕替尼獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)上市，主要用于晚期胃癌的治療。但是，單一用藥可提高機(jī)體產(chǎn)生抗藥性的概率，削弱藥物的療效，而合理的聯(lián)合用藥可以提高抗腫瘤的療效或減輕不良反應(yīng)。目前臨床已將阿帕替尼與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，并得到較好的治療效果［10-11，20］。本研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用Vit B2 雖可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，但效果不及阿帕替尼。此外，Vit B2 和阿帕替尼聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其抗腫瘤效果優(yōu)于單獨(dú)使用Vit B2或阿帕替尼。

綜上所述，胃癌患者血Vit B2水平降低，且與胃癌的TNM 分期和分化程度密切相關(guān)；Vit B2 與阿帕替尼聯(lián)合用藥可提高其對(duì)胃癌的抗腫瘤效果。