茵陳蒿湯調(diào)節(jié)膽汁酸代謝并干預(yù)阻塞性黃疸大鼠肝細(xì)胞線粒體DNA損傷的研究

劉軍艦，李忠廉，尚海濤

阻塞性黃疸是臨床常見病、多發(fā)病，多因膽結(jié)石、膽道閉塞、腫瘤壓迫等膽管機(jī)械性梗阻導(dǎo)致膽汁淤積所致，可引起肝組織、膽管等全身系統(tǒng)的一系列病理變化［1］。膽汁排泄受阻引起膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)淤積，疏水性膽汁酸淤積可以通過炎癥反應(yīng)機(jī)制、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、死亡受體途徑等損傷肝細(xì)胞［2］。如何有效地減少病理?xiàng)l件下疏水性膽汁酸對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用是一個(gè)亟需解決的問題。中醫(yī)治療黃疸歷史悠久，臨床以茵陳蒿湯隨證加減，已廣泛用于肝膽系統(tǒng)疾病及藥物所致的肝臟損害，特別是對(duì)各種熱郁于里，濕無出路，濕熱蘊(yùn)結(jié)所致黃疸的治療，顯示出良好的療效。但茵陳蒿湯對(duì)于阻塞性黃疸疾病的多靶點(diǎn)、多途徑、多效應(yīng)的作用機(jī)制尚未十分明確。筆者對(duì)阻塞性黃疸大鼠肝細(xì)胞線粒體DNA（mtDNA）的損傷情況進(jìn)行了定量研究，旨在探討其變化與膽汁酸代謝的相互關(guān)系，以及中藥茵陳蒿湯對(duì)其調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 提取試劑：基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型，TIANGEN生物公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒：Super Real Premix（SYBR Green）試劑盒（TIANGEN生物公司）。電泳儀（北京六一儀器廠）；電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；凝膠成像儀（培清科技JS-680B凝膠成像儀）；分光光度計(jì)：NANODROP 1000（Thermo 公司）；qPCR儀：ABI7500（ABI 公司）；生化分析儀：新銳全自動(dòng)生化分析儀XR220PLUS（中山市新銳醫(yī)療設(shè)備科技有限公司）；小動(dòng)物專用吸入麻醉機(jī)：VIP 3000（美國(guó)Matrx）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年SD大鼠54只，體質(zhì)量200～230 g，雄性，SPF級(jí)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK 京2014-0004；動(dòng)物倫理委員會(huì)通過編號(hào)：NKYY-DWLL-2019-081），委托天津市急腹癥器官損傷與中西醫(yī)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)管理嚴(yán)格按照本中心制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心操作規(guī)程（SOP）進(jìn)行。

1.3 中藥方劑 依據(jù)《傷寒論》中茵陳蒿湯劑量組成折合：茵陳180 g，桅子150 g，大黃60 g，共計(jì)390 g［3］。中藥購(gòu)于天津市南開醫(yī)院中藥制劑室，先用冷水浸泡30 min，煎煮2次，第1次45 min，第2次30 min，取2次煎煮液濃縮至390 mL，每mL含生藥量1 g。

1.4 動(dòng)物分組、造模及給藥方法 應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、茵陳蒿湯組，每組18 只。造模方法為：術(shù)前12 h禁食水，2.5%維持濃度的異氟烷吸入麻醉后消毒，上腹正中切口入腹。以幽門部為標(biāo)準(zhǔn)，翻轉(zhuǎn)引出十二指腸乳頭部，再追蹤膽總管，在肝門處分離出膽總管；模型組和茵陳蒿湯組于膽總管中上1/3 行雙重結(jié)扎，手術(shù)24 h 后觀察大鼠小便顏色變黃即說明膽道梗阻性黃疸模型建立成功。假手術(shù)組游離上段膽總管后關(guān)腹。大鼠自建模后第3天起茵陳蒿湯組每日給予茵陳蒿湯劑（相當(dāng)于生藥1 g/mL）3.6 mL/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組每日給予等量生理鹽水灌胃。觀察時(shí)點(diǎn)為梗阻建模后第1、3、8天。

1.5 標(biāo)本留取及檢測(cè)指標(biāo) 每時(shí)點(diǎn)各組處死大鼠6只，留取肝組織以備qPCR檢測(cè)。建模后第8天用代謝籠留取6 h尿，記錄尿量變化情況，留取血液標(biāo)本，檢測(cè)血總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、血清總膽汁酸（TSBA），尿總膽汁酸（TUBA）。

1.6 大鼠肝組織mtDNA 相對(duì)量檢測(cè) 取大鼠肝組織1 g，將其剪成細(xì)小碎粒狀，放入Eppendorf管中，應(yīng)用堿裂解法裂解組織細(xì)胞，離心后取上清液，應(yīng)用氯仿異戊醇直接提取mtDNA。因ND1 基因片段為mtDNA 高保守序列，故其可以反映DNA 模板中mtDNA 的總量，以β-actin 基因作為管家基因。運(yùn)用Premier 5.0 和Oligo 6 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。ND1 引物序列 ：上 游 5′-GGCTACATACAATTACGCAAG-3′，下 游 5′-TAGAATGGAGTAGACCGAAAGG-3′，產(chǎn)物大小 267 bp；βactin 引物序列：上游 5′-ATCCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下 游 5′-GGCTACAACTACAGGGCTGACCAC-3′，產(chǎn)物大小177 bp。PCR 體系為SYBR GreenⅠ體系，DNA 模板2 μL（約100 μg），上下游引物各0.4 μL（終濃度0.2 μmol/L），H2O 7.2 μL，總反應(yīng)體積10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 20 s，退火 55 ℃，20 s，延伸 72 ℃ 30 s，32 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)梯度稀釋的PCR 產(chǎn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用Sequence Detector System Version 1.3.1 軟件（Applied Biosystems）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS Statistics 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT、GGT 水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組TBIL、DBIL、ALT、GGT升高；與模型組比較，茵陳蒿湯組TBIL、DBIL、ALT、GGT均有所改善，見表1。

Tab.1 The serum contents of TBIL,DBIL,ALT and GGT in three groups of rats表1 3組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和GGT含量（n=6，）

Tab.1 The serum contents of TBIL,DBIL,ALT and GGT in three groups of rats表1 3組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和GGT含量（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05；表2同

組別假手術(shù)組模型組茵陳蒿湯組F TBIL（μmol/L）1.55±0.12 174.04±27.23a 135.67±16.79ab 150.288＊＊DBIL（μmol/L）0.65±0.14 141.30±12.77a 110.50±10.96ab 344.534＊＊ALT（U/L）63.53±11.41 422.26±56.78a 284.15±39.84ab 126.096＊＊GGT（U/L）1.02±0.06 42.30±6.75a 27.05±3.89ab 123.930＊＊

2.2 3 組大鼠血、尿中TBA 與尿量的比較 與假手術(shù)組比較，模型組血、尿TBA均升高，尿量下降；與模型組比較，茵陳蒿湯組血TBA 下降，而尿TBA 及尿量升高，見表2。

Tab.2 The serum and urine contents of TBA and urine volumes in three groups of rats表2 3組大鼠血、尿中TBA、尿量比較 （n=6，）

Tab.2 The serum and urine contents of TBA and urine volumes in three groups of rats表2 3組大鼠血、尿中TBA、尿量比較 （n=6，）

組別假手術(shù)組模型組茵陳蒿湯組F血TBA（μmol/L）21.43±2.01 334.04±41.08a 223.66±31.55ab 160.289＊＊尿TBA（μmol/L）1.21±0.32 281.56±43.00a 389.59±65.79ab 118.626＊＊尿量（mL）8.92±0.93 3.49±1.45a 6.01±1.77ab 22.759＊＊

2.3 3 組大鼠肝細(xì)胞mtDNA 相對(duì)表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組與茵陳蒿湯組mtDNA相對(duì)表達(dá)量于各時(shí)間點(diǎn)均減少；模型組mtDNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行性減少；茵陳蒿湯組mtDNA 的相對(duì)表達(dá)量第8天較第3天回升，見表3。

Tab.3 The relative quantity of mtDNA in three groups表3 3組大鼠mtDNA相對(duì)表達(dá)量 （n=6，）

Tab.3 The relative quantity of mtDNA in three groups表3 3組大鼠mtDNA相對(duì)表達(dá)量 （n=6，）

＊＊P＜0.01；A 與前一時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.05；a 與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組茵陳蒿湯組F第1天1.03±0.12 0.68±0.10a 0.64±0.09a 23.388＊＊第3天1.08±0.11 0.39±0.08Aa 0.35±0.07Aa 135.362＊＊第8天1.09±0.16 0.27±0.06Aa 0.73±0.11Aab 75.959＊＊F 0.439 41.922＊＊27.408＊＊

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為黃疸形成的關(guān)鍵是濕、熱二邪，病位上，黃疸的病位主要在脾胃肝膽，黃疸病證基本病機(jī)是濕熱瘀濁阻滯，膽液不循常道外溢而發(fā)黃。針對(duì)濕熱內(nèi)阻致黃的病機(jī)，張仲景提出“諸病黃家，但利其小便”的治療原則。清熱利濕之茵陳蒿湯為退黃代表方劑之一，其服用方法中提到“分溫三服，小便當(dāng)利，尿如皂角汁狀，色正赤。一宿腹減，黃從小便去也”。筆者認(rèn)為茵陳蒿治療黃疸治法上運(yùn)用“利其小便”之法，起到疏肝利膽、清熱利濕的功效，使“黃從小便去”。本研究顯示，膽道阻塞發(fā)生后，模型組TBIL、DBIL、ALT、GGT 升高，茵陳蒿湯組大鼠的上述指標(biāo)較模型組均改善，提示茵陳蒿湯對(duì)阻塞性黃疸大鼠肝功能及黃疸指標(biāo)有改善作用。

阻塞性黃疸發(fā)生后，疏水性膽汁酸淤積在肝損害中扮演重要角色，是導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、凋亡或壞死的主要因素之一［4］。正常情況下，僅有少量膽汁酸可從肝細(xì)胞中逃逸，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)由腎過濾到尿液中［5］。阻塞性黃疸發(fā)生時(shí)，正常的膽汁肝-腸循環(huán)遭到阻斷，此時(shí)腎臟對(duì)膽汁酸的“替代性途徑”排泄作用尤為重要［6］。本研究顯示，模型組大鼠血TBA 升高，同時(shí)尿TBA含量也升高，提示腎臟的排泄可能成為此時(shí)膽汁酸的主要消除途徑，這與Krones 等［7］的研究結(jié)果一致。茵陳蒿湯復(fù)方中含有與膽汁酸代謝有關(guān)的多種活性成分，如β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山萘酚以及異鼠李素等［8］。Cai 等［9］認(rèn)為這些生物活性成分可以調(diào)節(jié)膽汁酸的合成及代謝途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，給予茵陳蒿湯治療的大鼠，循環(huán)血膽汁酸含量下降，尿量及尿膽汁酸含量均增加。因此筆者認(rèn)為，茵陳蒿湯可以通過替代性途徑來增強(qiáng)膽汁酸的排泄，增加膽汁酸的尿液排泄，降低循環(huán)血總膽汁酸。但本研究并未檢測(cè)茵陳蒿湯調(diào)節(jié)膽汁酸代謝的調(diào)控因子表達(dá)情況，相關(guān)通路具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

線粒體是阻塞性黃疸時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)最先受損害的細(xì)胞器，而線粒體功能是決定肝細(xì)胞功能的重要因素［10］。Arab等［2］認(rèn)為疏水性膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)淤積對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能有明顯損害作用。ND1DNA定位于mtDNA（堿基序列3307～4263），相對(duì)保守的特點(diǎn)使研究者可以通過檢測(cè)ND1 DNA 量的變化來反映mtDNA的變化情況。本研究顯示，模型組肝組織mtDNA的量隨膽道阻塞時(shí)間延長(zhǎng)而進(jìn)行性減少，茵陳蒿湯組在給與茵陳蒿湯治療后mtDNA 的量逐漸回升，提示茵陳蒿湯對(duì)阻塞性黃疸大鼠肝細(xì)胞mtDNA起保護(hù)作用。

綜上所述，筆者認(rèn)為茵陳蒿湯可以通過替代性途徑來增強(qiáng)膽汁酸的排泄，增加膽汁酸的尿液排泄，降低循環(huán)血總膽汁酸，茵陳蒿湯可能通過肝-腎軸途徑調(diào)節(jié)膽汁酸代謝以減少肝細(xì)胞mtDNA損傷，進(jìn)而改善阻塞性黃疸大鼠肝功能。