加味大柴胡湯對梗阻性黃疸大鼠肝損傷及JNK、Bcl-2表達的影響

肖黃滿，尚海濤，張靜宇，郝成飛，劉軍艦，陳帥，張景虹，李忠廉△

梗阻性黃疸（obstructive jaundice，OJ）是由多種原因（如結石、腫瘤等）引起的膽管阻塞，出現(xiàn)皮膚、鞏膜進行性黃染伴小便發(fā)黃，可導致肝臟以及全身各系統(tǒng)一系列病理改變［1］。OJ可誘發(fā)膽汁淤積性肝損害，炎性細胞因子和游離氧自由基釋放，加劇肝損傷［2］。c-Jun氨基末端激酶（JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族的關鍵成員。研究表明，JNK信號蛋白與細胞凋亡過程密切相關［3］。Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成員，可在凋亡的線粒體途徑中發(fā)揮重要作用。內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）常在細胞凋亡時發(fā)生，其影響下游包括C/EBP同源蛋白（CHOP）、細胞凋亡信號調節(jié)激酶1（ASK1）、JNK和Bcl-2等蛋白的表達，參與調控細胞凋亡。加味大柴胡湯（MMDB）是在經(jīng)典方劑大柴胡湯（柴胡、黃芩、大黃、枳實、白芍、半夏、生姜）的基礎上加入茵陳、金錢草而成，已被證實能減輕OJ 大鼠中內毒素所造成的肝損傷，下調瞬時受體電位通道（TRPC1）蛋白的表達，減輕鈣超載［4］。但加味大柴胡湯對肝細胞凋亡中內質網(wǎng)應激機制是否有影響，特別是與JNK、Bcl-2信號蛋白的關系尚不明確。本研究通過加味大柴胡湯對OJ大鼠的干預，觀察大鼠肝功能及JNK、Bcl-2 信號蛋白的變化，進一步探討加味大柴胡湯對OJ 大鼠的影響，以期為OJ 肝損傷圍手術期的治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康SPF級雄性SD大鼠90只，體質量220～260 g，購于解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，飼養(yǎng)于干燥、通風環(huán)境下，自由進食、飲水。中藥飲片購于天津市南開醫(yī)院中藥房，具體如下：柴胡15 g、黃芩10 g、大黃8 g、枳實10 g、白芍10 g、半夏10 g、生姜10 g、大棗10 g、茵陳25 g、金錢草15 g，每日1 劑，水煎 100 mL，所得 MMDB 含生藥量1 g/mL。丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）和血清總膽紅素（TBIL）試劑盒購自國藥生物化學研究所；兔源JNK、Bcl-2和β-actin一抗購于天津博誠科技公司；辣根過氧化酶（HRP）標記的羊抗兔IgG 二抗購于美國Sigma 公司；其余常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純級別。TG16KR型低溫離心機購于長沙東旺實驗儀器有限公司；倒置相差顯微鏡購于日本Olympus 公司；JS-680D 型電泳、電轉、成像系統(tǒng)購于南京創(chuàng)睿儀器公司；VeritiFAST 型熒光定量PCR儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型建立及分組 將90 只健康成年SPF 級雄性大鼠編號，按照隨機數(shù)字表法分為假手術組（S 組）、OJ組（O組）和干預組（M組），每組30只。O組和M組均采用膽總管雙重結扎及離斷建立大鼠OJ 模型，實驗大鼠術前12 h禁食水，采取異氟烷吸入麻醉，經(jīng)腹正中沿劍突下切口進腹，牽拉十二指腸分離出膽總管，雙重結扎后離斷。S 組僅從相同部位入腹探查，游離膽總管并不予以結扎。S 組和O 組每日定時給予生理鹽水（10 μL/g）灌胃，M組在上述相同時間點給予加味大柴胡湯（10 μL/g）每日1次連續(xù)灌胃。于術后3 d、7 d、10 d，每組每次分別隨機取10只大鼠，采取異氟烷吸入麻醉，沿腹部正中進入腹腔，使用5 mL 注射器抽取腹主動脈血，離心后備用；充分顯露肝臟，剪開鐮狀韌帶至下腔靜脈前方，擠出大鼠肝臟。根據(jù)自然肝裂，取部分右肝下葉組織置于EP管中備用。

1.2.2 血清學分析 從大鼠腹主動脈血收集血液標本靜置30 min 后3 000 r/min 離心10 min，用相應試劑盒檢測AST、ALT、TBIL水平。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測肝組織中JNK、Bcl-2mRNA水平 以TRIzol一步法提取各組大鼠肝臟組織中的總RNA，除雜質后反轉錄為 cDNA，37 ℃ 50 min，85 ℃ 6 min，4 ℃ 6 min，-20 ℃保存。qPCR反應體系為：SYBR Green Mix 10 μL，上游及下游引物各1 μL，ROXⅡ校準液0.4 μL，ddH2O 6.6 μL，cDNA 模板 1 μL，總體積為 20 μL。qPCR 條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，共50個循環(huán)。每組設置3個復孔。本實驗重復3次，以2-ΔΔCt法計算各目的基因的表達量，擴展引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence of real time PCR表1 實時定量PCR引物序列

1.2.4 免疫印跡法（Western blot）檢測肝組織中JNK、Bcl-2蛋白的表達 液氮研磨-80 ℃下保存的肝組織50 mg，加入1 mL RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），置于冰上裂解25 min，13 000 r/min離心30 min，吸上清液，測定樣品蛋白濃度，加入SDS-loading buffer，100 ℃金屬浴10 min，每孔上樣20 μg，進行電泳分析，轉膜，封閉，加入JNK（1∶800）、Bcl-2（1∶2 000）和β-actin（1∶10 000）一抗4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗（1∶8 000）孵育1 h，洗膜，顯色液孵育2 min，成像儀上進行信號檢測，分析條帶。數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白陽性表達情況，計算比較各組蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 S組大鼠術后第2天大致恢復自主活動及飲食，反應迅捷，耳朵、皮膚、尿液顏色正常；術后第3天解剖，可見大鼠腹腔手術區(qū)域輕度粘連，肝臟質地軟，表面光滑；與術后7 d、10 d 解剖情況相比，未見明顯差異。O組大鼠術后第2天出現(xiàn)尾尖及耳緣黃染，精神狀態(tài)恢復較S組慢，活動能力差；可見大鼠尿液顏色變黃，食量及活動差；術后第3 天解剖大鼠見腹腔粘連較重，肝臟黃染明顯伴輕度腫大，結扎處近上部可見膽總管呈半透明囊狀擴張。M組大鼠術后第3天出現(xiàn)尾尖及耳緣輕度黃染，精神狀態(tài)恢復較慢，尿液顏色加深，食量及活動稍差；術后第3天解剖大鼠見腹腔粘連，肝臟黃染明顯伴輕度腫大，被膜緊張，膽總管擴張，與術后7 d、10 d解剖情況相比，上述現(xiàn)象加重。

2.2 各組大鼠血清AST、ALT、TBIL 水平比較 與S組同期比較，O 組及 M 組大鼠血清 AST、ALT、TBIL水平均升高（P＜0.05）；與O 組同期比較，M 組AST、ALT、TBIL水平均降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Serum AST,ALT and TBIL contents in three groups of rats表2 各組大鼠血清AST、ALT、TBIL水平 （n=10，）

Tab.2 Serum AST,ALT and TBIL contents in three groups of rats表2 各組大鼠血清AST、ALT、TBIL水平 （n=10，）

＊＊P＜0.01；a與S組比較，b與O組比較，P＜0.05

組別S組O組M組F AST（U/L）3 d 64.33±2.47 156.50±8.66a 118.64±10.50ab 333.823＊＊7 d 66.55±2.93 229.54±11.67a 163.13±13.63ab 609.740＊＊10 d 67.43±2.97 317.47±13.28a 208.32±12.28ab 1 405.108＊＊組別S組O組M組F ALT(U/L）3 d 30.64±2.92 95.87±6.38a 57.81±6.55ab 354.193＊＊7 d 32.37±3.48 153.51±6.49a 84.92±8.68ab 922.538＊＊10 d 33.66±2.84 237.52±8.89a 157.16±10.38ab 1 572.942＊＊組別S組O組M組F TBIL(μmol/L）3 d 10.57±1.41 48.73±3.31a 29.56±3.66ab 421.508＊＊7 d 11.27±1.38 78.51±4.48a 44.45±3.34ab 967.427＊＊10 d 12.88±1.57 97.71±5.01a 62.54±2.98ab 1 508.621＊＊

2.3 各組肝組織中JNK、Bcl-2mRNA 水平比較 O組、M組JNKmRNA水平均高于同期S組（P＜0.05）；M組JNKmRNA水平在同期均低于O組（P＜0.05）；O組、M組Bcl-2mRNA水平均低于S組（P＜0.05）；M組Bcl-2mRNA水平在同期均高于O組（P＜0.05），見圖1。

2.4 各組肝組織中JNK、Bcl-2 蛋白的表達水平比較 O 組、M 組JNK 蛋白表達水平在各時間點均高于S 組（P＜0.05）；M 組JNK 蛋白表達水平在各時間點均低于O 組（P＜0.05）；O 組、M 組Bcl-2 蛋白表達水平在各時間點均低于S 組（P＜0.05）；M 組Bcl-2蛋白表達水平在各時間點均高于O 組（P＜0.05）,見圖2、3。

Fig.1 The mRNA expressions of JNK and Bcl-2 in liver tissue of rats in each group圖1 各組大鼠肝組織JNK、Bcl-2 mRNA表達水平

Fig.2 The protein expressions of JNK and Bcl-2 in liver tissue of rats in each group圖2 各組大鼠肝組織JNK、Bcl-2蛋白表達水平

Fig.3 The expression levels of JNK and Bcl-2 in each group圖3 各組大鼠肝組織JNK、Bcl-2蛋白表達水平

3 討論

大柴胡湯是臨床上常用方劑之一，由柴胡、黃芩、大黃、枳實、白芍、半夏、生姜、大棗八味藥組成。在大柴胡湯中加味茵陳及金錢草，增加了利濕退黃的功效，既可疏利肝膽之氣滯，又可蕩滌腸胃之實熱［5］。黃疸病名首見于《黃帝內經(jīng)》：“面色微黃，齒垢黃，爪甲上黃，黃疸也”［6］。其病因病機為：飲食無節(jié)或過量飲酒，或嗜食肥甘厚味，脾胃受損，脾健運功能減弱，化生無力，輸布水谷精微失調，濕濁而生，氣機受阻，郁而化熱，薰蒸肝膽，膽汁外溢乃發(fā)黃疸。OJ 是造成肝功能損害的主要原因，因膽道阻塞，膽汁流出受阻，膽汁聚集肝內，引起肝細胞損傷和凋亡。AST、ALT、TBIL 等是較為敏感的肝細胞損傷指標［7］。謝毅等［8］證實，精氨酸聯(lián)合加味大柴胡湯可能通過下調Toll樣受體4來降低內毒素水平，從而減輕急性膽管炎大鼠的肝臟損害。陳念平等［9］發(fā)現(xiàn)大黃素能降低阻塞性黃疸時的腸道細菌移位率，對肝功能有明顯保護作用，可有效減輕OJ 時的肝纖維化。本研究結果顯示，O 組血清AST、ALT、TBIL 升高，在加味大柴胡湯干預后，上述指標降低，表明加味大柴胡湯能改善模型大鼠的肝功能，減輕肝損傷。

為了探究ERS在OJ中的相關機制，本研究觀察了 MMDB 在 OJ 模型大鼠體內對 JNK、Bcl-2 表達的影響。JNK是MAPK家族中的重要成員,在細胞ERS調節(jié)過程中起重要作用。JNK 被磷酸化激活后，能通過轉錄依賴或轉錄非依賴機制調控下游靶基因的表達或靶蛋白的活性而介導細胞凋亡［10］。JNK激活后可從胞質中轉位入核，通過磷酸化激活c-JUN、c-FOS 等轉錄因子而調節(jié)凋亡相關靶基因的轉錄表達［11］。林銘斯［12］研究表明，加味茵芍散可通過影響內質網(wǎng)應激-胰島素抵抗中的肌醇依賴酶1α（IRE1α）/JNK 信 號 通 路 抑 制 IRE1α 的 mRNA 及JNK1蛋白磷酸化表達水平，減輕非酒精性脂肪肝的病理變化程度。王茜等［13］發(fā)現(xiàn)，解毒護肝方對藥物性肝損傷大鼠有明顯的保護作用，其機制可能與調控Toll 樣受體3/TNF-α/JNK2 信號通路有關。本研究顯示，在術后3、7、10 d時OJ模型大鼠肝組織JNK的mRNA 及蛋白表達水平增強，加味大柴胡湯干預組在相同時間點，JNK表達減弱，表明黃疸模型組肝損傷凋亡明顯，加味大柴胡湯干預后可以減輕肝細胞的凋亡，這可能是通過抑制JNK的合成，減輕肝細胞的氧化應激反應，從而緩解肝損傷凋亡。

Bcl-2 通常位于線粒體外膜和內質網(wǎng)上，其在ERS過程中表現(xiàn)出抑制細胞凋亡的作用［14］。JNK的凋亡誘導底物包括Bcl-2和Bim，它們分別可被JNK磷酸化抑制和激活［15-16］。目前，許多研究集中于Bcl-2 在調節(jié)T 細胞中三磷酸肌醇受體（IP3R）介導的Ca2+信號中的作用，因為TRPC1激活后IP3R 介導的Ca2+信號在免疫系統(tǒng)中具有非常重要的生理意義［17-18］。張貝貝等［19］發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛多糖可通過抑制高糖誘導的血管內皮細胞Bax的表達，增強Bcl-2的表達，從而抑制血管內皮細胞凋亡，在一定程度上可防治糖尿病血管病變。涂玥等［20］通過研究大黃附子湯，證實其可調節(jié)腎組織JNK/Bcl-2 信號通路，減少腎小管上皮細胞凋亡，改善腎間質纖維化，最終延緩尿酸性腎病進展。與上述結果相似，本研究顯示，與假手術組相比，OJ 模型大鼠肝細胞中Bcl-2 的mRNA及蛋白表達水平降低，加味大柴胡湯干預后，Bcl-2蛋白水平較相同時間點模型大鼠高，表明O組大鼠肝組織發(fā)生損傷凋亡時，Bcl-2 表達下調，而加味大柴胡湯的干預又使Bcl-2 表達增加。因此，筆者考慮加味大柴胡湯可能通過調節(jié)JNK/Bcl-2 信號通路來減少肝細胞凋亡。

綜上所述，本研究雙重結扎大鼠膽總管成功建立OJ 大鼠肝損傷模型，血清AST、ALT、TBIL 水平及JNK、Bcl-2 表達水平發(fā)生變化，產(chǎn)生了ERS，加快細胞凋亡。加味大柴胡湯干預后能一定程度上改善大鼠肝功能，同時下調JNK 表達，提高Bcl-2 表達，這可能與調節(jié)JNK/Bcl-2 信號通路有關。加味大柴胡湯可通過減輕肝細胞的ERS，減少肝細胞凋亡，進而對肝臟起保護作用，但其是否通過其他氧化應激反應或途徑對肝細胞起到保護作用，尚待進一步研究。