加減枇杷清肺飲對痤瘡模型大鼠耳廓組織炎癥的影響

薛兵，任威威，薛思思，楊彩瑞，王迪，方惠敏，成秀梅

痤瘡是一種常見的累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，大約85%的青少年會(huì)受到痤瘡的影響，嚴(yán)重者會(huì)遺留永久性凹陷瘢痕，給患者的生理和心理帶來影響［1］。研究顯示炎癥反應(yīng)是誘發(fā)痤瘡發(fā)病的重要因素之一［2］。痤瘡炎癥的產(chǎn)生與痤瘡丙酸桿菌（P.acnes）誘發(fā)免疫應(yīng)答有關(guān)，其中腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β和干擾素（IFN）-γ等炎性因子在痤瘡炎癥反應(yīng)中具有重要促炎和抑炎作用［3-5］。枇杷清肺飲出自《外科大成》，該方治療痤瘡，取得了較好的臨床效果［6-7］。為進(jìn)一步證實(shí)這一療效，本研究通過皮內(nèi)注射P.acnes構(gòu)建大鼠耳廓痤瘡局部炎癥模型，采用枇杷清肺飲加減方對其進(jìn)行干預(yù)，探索其治療耳廓痤瘡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料 SPF級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±10）g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可證號(hào)：SCXK（冀）2018-004；合格證編號(hào)：1903089；動(dòng)物倫理號(hào)：DWLL2019011。于河北中醫(yī)學(xué)院科研中心飼養(yǎng)，溫度（24±2）℃，相對濕度50%～60%。枇杷清肺飲加減方（枇杷葉9 g，桑白皮9 g，黃芩9 g，黃連6 g，梔子6 g，連翹9 g，金銀花12 g，槐花9 g，生山楂12 g，皂角刺6 g，赤芍9 g，浙貝母9 g，甘草3 g）為中藥顆粒制劑，購自河北中醫(yī)學(xué)院國醫(yī)堂；異維A 酸軟膠囊（國藥準(zhǔn)字H10930210）購自上海信誼延安藥業(yè)；P.acnes（ATCC6919）購自廣東省微生物研究所；TNF-α、IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒分別購自賽默飛生物、優(yōu)爾生生物；兔TNF-α、IFN-γ 多克隆抗體均購自武漢Abclonal 公司；兔 IL-1β 多克隆抗體購自英國 Abcam 公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自諾唯贊生物。TE2101-L 電子天平（德國Sedoris 公司）；DP72 光學(xué)電子顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；CV18超聲波細(xì)胞破碎器購自美國SONIC公司；164-5052 蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移儀購自美國Bio-rad 公司；ImageQuant LAS-4000 化學(xué)發(fā)光成像分析儀購自美國GE公司）；Nanodrop 2000c 超微量分光光度計(jì)、Applied biosystems 7500 qPCR 儀及PCR 試劑購自美國賽默飛世爾公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠耳廓痤瘡模型制備及給藥 將40只大鼠編號(hào)后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、異維A酸組（陽性對照）和枇杷清肺飲組，每組10只。除空白組外，其余3組大鼠均于右耳廓皮內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌混懸液（6×107cfu/mL），每日1 次，每次250 μL/kg，連續(xù)注射5 d［8］，末次給藥后通過表觀指標(biāo)和病理指標(biāo)判斷模型是否建立成功。表觀指標(biāo)變化是痤瘡最直接的判定標(biāo)準(zhǔn)，是判定大鼠痤瘡模型制備成功與否的核心指標(biāo)［9］。局部皮膚病理指標(biāo)是判定大鼠模型成功與否的直接證據(jù)［10］。模型建立后表觀指標(biāo)：（1）局部組織增厚、變硬、紅腫。（2）局部皮膚隆起呈丘疹、出現(xiàn)膿皰。（3）毛囊口出現(xiàn)黑色角栓，并開放增大。局部皮膚病理：（1）表皮、真皮、皮下組織界限模糊。（2）表皮增厚且過度角化。（3）毛囊皮脂腺增大明顯，毛囊漏斗部擴(kuò)大成壺狀并且充滿角化物質(zhì)。（4）真皮層毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張明顯，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤［8］。

模型制備成功后異維A酸組給予異維A酸膠囊，枇杷清肺飲組給予枇杷清肺飲加減方。參照人與動(dòng)物等效劑量換算法（體表面積換算法）［11］，異維A酸軟膠囊取6.25倍成人用量（按體質(zhì)量60 kg 計(jì)算為0.5 mg/kg）即3.125 mg/kg，灌胃給藥體積為10 mL/kg；枇杷清肺飲加減方成人生藥量為1.8 g/kg，Wistar 大鼠按照成人用量的6.25 倍計(jì)算，即11.25 g/kg，灌胃給藥體積為10 mL/kg?？瞻捉M和模型組給予等劑量生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥21 d。

1.2.2 標(biāo)本收集 末次給藥后24 h禁食不禁水，剃除大鼠耳背皮膚周圍的毛，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉。麻醉后開腹，分離腹主動(dòng)脈，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，于真空促凝采血管靜置待凝后，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，留取上清液-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ〔≡畈课坏亩M織，部分置于4%多聚甲醛溶液固定，另一部分凍存于液氮備用。

1.2.3 大鼠耳廓外觀形態(tài)變化 給藥期間肉眼觀察大鼠耳廓痤瘡模型的耳外觀及形態(tài)變化：局部組織是否出現(xiàn)粗糙、增厚；局部皮膚是否出現(xiàn)丘疹、膿皰；皮膚注射處是否出現(xiàn)水腫；毛囊口是否出現(xiàn)黑色角栓。用游標(biāo)卡尺測量大鼠耳廓厚度，計(jì)算耳廓腫脹率。耳廓腫脹率=（注射后耳廓厚度-注射前耳廓厚度）/注射前耳廓厚度×100%。

1.2.4 HE染色觀察各組大鼠耳廓組織病理改變 耳廓組織經(jīng)4%甲醛固定液24 h 后，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片制成6 μm 切片，進(jìn)行常規(guī)HE 染色，光鏡下觀察大鼠耳廓組織的病理改變。

1.2.5 大鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平檢測 將大鼠血清樣品、ELISA 試劑盒取出復(fù)溫，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以空白對照孔調(diào)零后檢測450 nm 波長處的光密度（OD）值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平。

1.2.6 Western blot 檢測大鼠耳廓組織TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達(dá) 取大鼠耳廓組織研磨制成蛋白勻漿，取上清進(jìn)行蛋白測定。取相同濃度的蛋白行SDS-PAGE，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST 洗膜后以TNF-α（1∶500）、IFN-γ（1∶800）、IL-1β（1∶500）一抗4 ℃孵育過夜（以GAPDH為內(nèi)參），次日室溫下孵育二抗（1∶1 000）1 h，顯影，使用Image J 18.0軟件進(jìn)行圖像分析并量化目標(biāo)條帶的灰度值。

1.2.7 qPCR檢測大鼠耳廓組織TNF-α、IFN-γ、IL-1β mRNA表達(dá) 取大鼠耳廓組織制成組織勻漿，Trizol法提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將提取后的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，以GAPDH 作為內(nèi)參，引物序列見表1。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。取循環(huán)閾值（Ct），采用2-ΔΔCt法計(jì)算表示各基因的相對表達(dá)水平。

Tab.1 Real-time fluorescence quantitative PCR primer sequences表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組內(nèi)治療前后各指標(biāo)的比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組大鼠耳廓外觀形態(tài)變化 灌胃給藥21 d后，空白組大鼠耳廓柔軟淡紅，毛細(xì)血管清晰可見，耳管開口處無粉刺、丘疹、膿皰等皮損；模型組大鼠耳廓顏色暗紅，毛囊口增厚、粗糙、干燥，皮膚表面高低不平，兼有散在丘疹、膿皰，注射處真皮上層毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯；枇杷清肺飲組和異維A 酸組與模型組相比，丘疹、膿皰不同程度減少，毛囊口處略縮小、平整，毛細(xì)血管較清晰，見圖1。

Fig.1 Changes of auricle in four groups of rats圖1 各組大鼠耳廓變化

2.2 4組大鼠耳廓組織病理改變 空白組大鼠耳廓組織未見明顯異常，無炎癥細(xì)胞浸潤，表皮各層界限清晰、完整；模型組大鼠耳廓組織可見表皮、真皮、皮下組織界限模糊，毛囊表皮增厚、過度角化，毛囊相互融合，角化物質(zhì)堵塞毛囊口并且延伸至皮脂腺（箭頭示），真皮層毛細(xì)血管擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤毛囊周圍；異維A酸組表皮增厚緩解，毛囊口角化減輕，僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤；枇杷清肺飲組毛囊擴(kuò)張和炎癥明顯減輕，且角化層逐步恢復(fù)完整規(guī)則，見圖2。

2.3 4組大鼠耳廓厚度及腫脹率變化 與空白組比較，模型組大鼠耳廓厚度及腫脹率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，異維A 酸組和枇杷清肺飲組的大鼠耳廓厚度和腫脹率均出現(xiàn)下降（P＜0.05），與異維A 酸組比較，枇杷清肺飲組大鼠耳廓厚度和腫脹率下降（P＜0.05），見表2。

Fig.2 Pathological changes of auricle tissues in four groups of rats after treatment(HE stianing，×200)圖2 治療后各組大鼠耳廓組織病理變化（HE染色，×200）

2.4 4 組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ 水平的變化 與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，枇杷清肺飲組和異維A 酸組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平降低，IFN-γ水平升高（P＜0.05）；與異維A 酸組比較，枇杷清肺飲組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平降低（P＜0.05），IFN-γ差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.5 4組大鼠耳廓組織TNF-α、IL-1β和IFN-γ的蛋白和mRNA 表達(dá)水平比較 與空白組相比，模型組大鼠耳廓組織TNF-α、IL-1β 的蛋白和mRNA 表達(dá)水平均升高（P＜0.05），IFN-γ 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，異維A 酸組和枇杷清肺飲組大鼠耳廓組織TNF-α、IL-1β 的蛋白和mRNA 表達(dá)水平下降（P＜0.05），而IFN-γ 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），異維A 酸組IFN-γmRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），枇杷清肺飲組IFN-γmRNA表達(dá)水平增加（P＜0.05）；與異維A 酸組比較，枇杷清肺飲組大鼠耳廓組織TNF-α、IL-1β 的蛋白表達(dá)均有所下降，IFN-γ 的蛋白和mRNA 表達(dá)水平均升高（P＜0.05），而TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05），見圖3、4。

Tab.3 Comparison of serum levels of TNF-α,IL-1β and IFN-γ between four groups of rats表3 4組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平比較（n=10，ng/L，）

Tab.3 Comparison of serum levels of TNF-α,IL-1β and IFN-γ between four groups of rats表3 4組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平比較（n=10，ng/L，）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與模型組比較，c與異維A 酸組比較，P＜0.05

組別空白組模型組異維A酸組枇杷清肺飲組F TNF-α 89.441±5.902 397.001±43.662a 284.702±19.041ab 176.201±5.552abc 30.472＊＊IL-1β 16.451±1.190 50.630±2.294a 35.830±1.672ab 25.301±1.322abc 77.223＊＊IFN-γ 15.573±0.895 4.791±0.221a 10.752±0.591ab 12.901±0.632ab 52.781＊＊

Fig.3 Protein expressions of IFN-γ,TNF-α and IL-1β in auricle tissues detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測各組大鼠耳廓組織IFN-γ、TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)

Tab.2 Comparison of auricle thickness and swelling rate after treatment between four groups of rats表2 4組大鼠耳廓厚度及治療后腫脹率的比較 （）

Tab.2 Comparison of auricle thickness and swelling rate after treatment between four groups of rats表2 4組大鼠耳廓厚度及治療后腫脹率的比較 （）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與模型組比較，c與異維A酸組比較，P＜0.05

組別空白組模型組異維A酸組枇杷清肺飲組F n t 10 10 10 10耳廓厚度（mm）注射前0.530±0.041 0.522±0.060 0.530±0.051 0.553±0.011 0.811注射后0.540±0.052 0.902±0.111a 0.813±0.031ab 0.682±0.020abc 61.952＊＊0.491 9.593＊＊15.191＊＊18.390＊＊腫脹率（%）2.872±1.640 75.483±30.690a 52.530±12.064ab 25.541±18.580abc 27.874＊＊

Fig.4 IFN-γ,TNF-α and IL-1β mRNA expressions of auricle tissues detected by qPCR圖4 qPCR檢測各組大鼠耳廓組織IFN-γ、TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)

3 討論

痤瘡是一種慢性炎癥性皮膚病，具有常見性和多發(fā)性。痤瘡?fù)ǔ?huì)遺留凹陷性瘢痕，嚴(yán)重影響了患者的美觀和生活質(zhì)量［12］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)病與雄激素水平偏高、皮脂腺分泌旺盛、微生物的感染、炎癥反應(yīng)等多種因素相關(guān)，其中炎癥反應(yīng)貫穿痤瘡發(fā)病的始終且P.acnes是痤瘡的重要致病菌之一，P.acnes可誘發(fā)免疫應(yīng)答并釋放一系列炎癥因子，從而導(dǎo)致痤瘡炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)。其中TNF-α、1L-1β和IFN-γ 炎性因子在痤瘡炎癥反應(yīng)中具有重要作用［13-14］。TNF-α 是一種多肽類細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥及免疫應(yīng)答的重要因子［12］。IL-1β 是一種具有多向性功能的炎癥介質(zhì)，1L-1β 表達(dá)升高是痤瘡炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志之一［13］。TNF-α 和1L-1β 通過作用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附分子來促進(jìn)炎癥細(xì)胞向皮膚損傷部位聚集，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)。IFN-γ是一種免疫調(diào)節(jié)因子，可以激活巨噬細(xì)胞，具有促進(jìn)組織相容性復(fù)合體分子的表達(dá)和抗原提呈的作用，可抑制TNF-α、1L-1β等炎癥細(xì)胞因子的分泌，從而抑制炎癥反應(yīng)［14］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠耳廓增厚、干燥、粗糙，毛細(xì)血管擴(kuò)張；病理可見表皮明顯角化，毛囊上皮與表皮顆粒層均增厚，毛囊口被角化物質(zhì)堵塞且延伸到皮脂腺，毛囊周圍炎癥細(xì)胞浸潤；同時(shí)血清和耳廓組織中TNF-α和1L-1β表達(dá)升高，IFN-γ表達(dá)下降，提示痤瘡模型大鼠的耳廓皮膚出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，模型建立成功。

中醫(yī)稱痤瘡為“粉刺”，《外科正宗·肺風(fēng)粉刺酒鼻》云：“粉刺屬肺，齄鼻屬脾，總皆血熱瘀滯不散，所謂有諸內(nèi)、形諸外”，《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“痤，癤也，內(nèi)蘊(yùn)血腫，形大如棗者”，即痤瘡病機(jī)為肺經(jīng)風(fēng)熱、脾胃積熱、痰濕瘀熱［15］。針對痤瘡的病理機(jī)制、病變特點(diǎn)以及外在表現(xiàn)，本研究采用加減枇杷清肺飲治療痤瘡，枇杷清肺飲由枇杷葉、桑白皮、黃連、人參、甘草等組成。此方從古至今作為治療痤瘡的名方，相關(guān)臨床試驗(yàn)均證實(shí)了該方治療痤瘡的顯著效果［16-17］，但是對其機(jī)制缺少深入實(shí)驗(yàn)研究。為加強(qiáng)此方劑的療效，本課題組在原方的基礎(chǔ)上去掉人參，加入金銀花、黃芩、梔子、連翹、山楂、皂角刺、赤芍、浙貝母。方中以枇杷葉、桑白皮、金銀花為君藥，以黃柏、黃芩、黃連為臣藥，以梔子、連翹、山楂、皂角刺、赤芍、浙貝母為佐藥，諸藥共奏清熱解毒，疏散風(fēng)熱，軟堅(jiān)散結(jié)之效，療效頗佳。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，枇杷清肺飲組大鼠耳廓變軟，變薄，毛細(xì)血管較清晰，丘疹、脂栓、膿皰減少；大鼠耳廓組織病理結(jié)果顯示表皮層變薄，毛囊擴(kuò)張程度減輕，且炎癥細(xì)胞的浸潤程度明顯降低；大鼠血清和耳廓組織中IFN-γ明顯升高，TNF-α和1L-1β 明顯降低，證實(shí)枇杷清肺飲加減方對P.acnes誘導(dǎo)的大鼠耳廓炎癥有明確的抗炎作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，枇杷葉中的主要提取物揮發(fā)油、三萜酸類化合物，具有抑菌和抗炎的作用［18］；桑白皮中的主要成分總黃酮具有抗炎、抗感染、免疫調(diào)節(jié)的作用［19］；黃連的主要成分是異喹啉類生物堿，具有抗炎抗菌的作用［20］。黃芩提取物主要為黃芩苷，具有抗炎、抗感染的作用［21］，上述藥物用于臨床治療痤瘡，療效確切，因而進(jìn)一步證實(shí)了枇杷清肺飲加減方對痤瘡炎癥改善的效果。

綜上所述，枇杷清肺飲加減方可能通過抑制TNF-α、1L-1β 的表達(dá)和促進(jìn)IFN-γ 的表達(dá)來改善痤瘡模型大鼠的癥狀。本研究為加減枇杷清肺飲治療痤瘡的作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，由于P.acne誘導(dǎo)的炎癥免疫應(yīng)答還與Toll樣受體（TLR）/核因子（NF）-κB 信號(hào)通路相關(guān)［22］，枇杷清肺飲加減方是否通過影響TLR/NF-κB 信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)，有待進(jìn)一步研究。