SIRT5對(duì)高糖環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響及機(jī)制探討

賀帥，岳淑芬，周蕾，齊琦

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率呈逐年升高的趨勢(shì)，大多數(shù)結(jié)腸癌患者確診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后較差［1］。糖尿病在結(jié)腸癌中常見，并影響其發(fā)展及預(yù)后［2-3］。糖代謝異常（糖代謝重編程）在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用；而機(jī)體的代謝改變可能會(huì)驅(qū)動(dòng)癌癥代謝重編程，糖尿病會(huì)加劇這種情況；有氧糖酵解對(duì)糖代謝異常具有重要意義［4-5］。Sirtuin5（SIRT5）是Sirtuins 家族中獨(dú)特的成員，其去丙二?；叭ョ牾；鹊鞍仔揎椬饔蒙婕疤墙徒膺^(guò)程中關(guān)鍵酶并可增強(qiáng)糖酵解，而糖酵解與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)［6］。SIRT5 是否可通過(guò)影響糖代謝關(guān)鍵酶己糖激酶-2（HK2）及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α/M2型丙酮酸激酶（PKM2）信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)糖代謝并參與高糖環(huán)境下結(jié)腸癌發(fā)展的研究少見。本研究利用SIRT5-RNAi 慢病毒靶向沉默人結(jié)腸癌Lovo 細(xì)胞，以檢測(cè)其對(duì)高糖環(huán)境下細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響，并進(jìn)一步檢測(cè)SIRT5 對(duì)糖酵解關(guān)鍵酶HK2 及mTOR/HIF-1α/PKM2 信號(hào)通路的影響，探討其與高糖環(huán)境下結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌HT-29、SW620、SW480、Lovo細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；兔多克隆抗體SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2、HK2、GAPDH 及HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG 購(gòu)自北京博奧森公司；RIPA 裂解液購(gòu)自上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；Trizol 購(gòu)自 promega 公司；RPMI 1640 及 DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自Ausbian公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Corning公司；凋亡試劑盒購(gòu)自eBioscience公司；MTT購(gòu)自Genview公司；BCA Protein Assay Kit 及RIPA 裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù) 有 限 公 司 ；PVDF 膜 購(gòu) 自 millipore 公 司 ；Celigo 購(gòu) 自Nexcelom公司；PCR引物由上海吉?jiǎng)P基因有限公司合成；MMLV 及 PCR 試劑盒購(gòu)自 promega 公司；PCR 儀購(gòu)自 Roche 公司；對(duì)照RNAi 慢病毒及SIRT5-RNAi 慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與選擇、慢病毒轉(zhuǎn)染和分組 復(fù)蘇人結(jié)腸癌細(xì)胞系（SW620、Lovo、HT-29 及 SW480 細(xì)胞），置于 RPMI 1640 培養(yǎng)液（SW620、Lovo、SW480 細(xì)胞）及 DMEM 培養(yǎng)液（HT-29細(xì)胞）中（含10%FBS）培養(yǎng)、傳代，至細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)行前期探索研究，結(jié)果顯示Lovo 細(xì)胞SIRT5 表達(dá)量最高，用此做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別用普通培養(yǎng)基（葡萄糖含量2 000 mg/L）及高糖培養(yǎng)基（葡萄糖含量4 500 mg/L）培養(yǎng)SIRT5高表達(dá)的Lovo 細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，高糖培養(yǎng)基及普通培養(yǎng)基細(xì)胞各分為3 組：空白對(duì)照組（MOCK 組，無(wú)干預(yù)）、陰性對(duì)照組（NC 組，利用對(duì)照RNAi 慢病毒轉(zhuǎn)染）和SIRT5-RNAi 組（KD組，采用SIRT5-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染）。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)SIRT5 瞬時(shí)沉默后Lovo 細(xì)胞增殖能力的改變 慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組同1.2.1；調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔2 000 個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)；從鋪板后次日開始，培養(yǎng)終止前4 h每孔加20 μL MTT液（5 g/L），分別于1、2、3、4、5 d去除培養(yǎng)基，每孔加150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩器振蕩2～5 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)各孔光密度（OD）值，確定細(xì)胞活性，設(shè)調(diào)零孔（完全培養(yǎng)基+MTT+DMSO）。

1.2.3 AnnexinⅤ法檢測(cè)SIRT5 瞬時(shí)沉默后Lovo 細(xì)胞的凋亡率 慢病毒轉(zhuǎn)染分組同1.2.1，轉(zhuǎn)染后72 h 待細(xì)胞融合度為85%左右時(shí)，收集各組細(xì)胞，200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL Annexin V-APC 染色，室溫避光10～15 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。使用流式細(xì)胞儀分析軟件guava InCyte分析凋亡率。

1.2.4 Celigo 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIRT5 沉默后Lovo 細(xì)胞的遷移率 參照文獻(xiàn)［2］，選擇高糖環(huán)境（高糖培養(yǎng)基）中SIRT5 對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。慢病毒轉(zhuǎn)染分組同1.2.1高糖培養(yǎng)基分組，以50 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，次日細(xì)胞融合度為90%以上時(shí)用劃痕儀對(duì)96孔板輕推形成劃痕。磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗2 次，添加1%FBS 血清培養(yǎng)基并即刻（0 h）刷板，繼續(xù)在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在24 h用Celigo 清掃平板，使用Celigo 分析遷移面積，計(jì)算遷移率=［（S3+S4）-（S1+S2）］/［1-（S1+S2）］×100%，1-（S1+S2）代表0 h劃痕區(qū)面積，（S3+S4）-（S1+S2）代表劃痕區(qū)24 h減少的面積。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)高糖環(huán)境下結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞系SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2mRNA的表達(dá)情況 復(fù)蘇培養(yǎng)高糖環(huán)境下各組Lovo 細(xì)胞，分組同1.2.1高糖培養(yǎng)基分組，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，Trizol 裂解，提取總RNA，測(cè)定濃度，以1 μg RNA為模板，選取反轉(zhuǎn)錄引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，1∶100 稀釋合成的cDNA，取 1 μL cDNA組成12 μL反應(yīng)體系（SYBR Premix EX taq 6.0 μL，上游引物（5 μmol/L）0.5 μL，下游引物（5 μmol/L）0.5 μL，cDNA 1.0 μL，無(wú)核酸酶水 4.0 μL），qPCR檢測(cè)高糖環(huán)境下各組Lovo細(xì)胞SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2mRNA 的相對(duì)含量，并制作熔解曲線，GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。反應(yīng)過(guò)程：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 h ，95 ℃ 15 s。采用相對(duì)定量的 2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR所用引物序列

1.2.6 Western blot 檢測(cè)高糖環(huán)境下結(jié)腸癌Lovo 細(xì)胞系SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2蛋白的表達(dá)情況 蛋白裂解液提取各組結(jié)腸癌細(xì)胞蛋白，分組同1.2.1高糖培養(yǎng)基分組。每個(gè)上樣孔加50 μg 蛋白，行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂乳封閉，4 ℃過(guò)夜，分別加入內(nèi)參GAPDH 抗體及SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2、HK2 兔多克隆抗體，37 ℃溫育1 h。加HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000），37 ℃孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，蛋白質(zhì)條帶經(jīng)Gel-Pro Analyzer version 4.5軟件進(jìn)行灰度值測(cè)量，用GAPDH條帶的灰度值對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)條件下各組Lovo 細(xì)胞增殖情況比較 普通培養(yǎng)基中，SIRT5-RNAi慢病毒載體靶向沉默后1～4 d 對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，5 d 時(shí)KD 組較NC組、MOCK組OD值降低（P＜0.05），但后2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高糖培養(yǎng)基中，3～5 d 時(shí)KD 組較NC 組、MOCK 組 OD 值均降低，4 d 時(shí) NC 組較 MOCK組OD值亦降低（P＜0.05），見表2。

2.2 不同培養(yǎng)條件下各組Lovo 細(xì)胞凋亡率的比較 普通培養(yǎng)基中，3組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化；高糖培養(yǎng)基中，KD組較NC組、MOCK組凋亡率明顯增加（P＜0.05），但后2 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1、表3。

2.3 高糖環(huán)境下各組Lovo 細(xì)胞遷移率比較 高糖培養(yǎng)基中，MOCK組、NC組及KD組的細(xì)胞遷移率分別 為 55.03%±1.99%、54.13%±1.84% 及 44.18%±1.84%（F=38.792，P＜0.01），KD 組較 NC 組、MOCK組遷移率降低（P＜0.05），但后2 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

2.4 高糖環(huán)境下各組Lovo 細(xì)胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2mRNA的表達(dá)水平 除NC組HIF-1α低于 MOCK 組外，NC 組、MOCK 組及 KD 組SIRT5、mTOR、PKM2及HK2mRNA 的表達(dá)水平依次降低（P＜0.01），見表4。

2.5 高糖環(huán)境下各組Lovo 細(xì)胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2蛋白的表達(dá)水平 MOCK組、NC 組及 KD 組 SIRT5、mTOR 及 HIF-1α 依次降低，KD 組較 MOCK 組、NC 組 PKM2 及 HK2 的蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01），但后2 組間PKM2 及HK2 的蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3、表5。

Tab.2 Comparison of Lovo cell proliferation ability between three groups表2 各組Lovo細(xì)胞增殖能力比較 （n=3，OD值，）

Tab.2 Comparison of Lovo cell proliferation ability between three groups表2 各組Lovo細(xì)胞增殖能力比較 （n=3，OD值，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與MOCK組比較，b與NC組比較，P＜0.05

組別MOCK組NC組KD組F普通培養(yǎng)基1 d 0.171±0.010 0.168±0.009 0.171±0.004 0.166 2 d 0.223±0.007 0.217±0.004 0.223±0.011 0.512 3 d 0.271±0.013 0.270±0.012 0.265±0.014 0.186 4 d 0.343±0.014 0.342±0.013 0.331±0.013 0.739 5 d 0.623±0.010 0.614±0.011 0.586±0.019ab 5.920＊組別MOCK組NC組KD組F高糖培養(yǎng)基1 d 0.185±0.011 0.183±0.005 0.181±0.004 0.229 2 d 0.273±0.011 0.269±0.007 0.243±0.017a 4.709＊3 d 0.351±0.012 0.345±0.009 0.251±0.006ab 111.213＊＊4 d 0.491±0.010 0.442±0.007a 0.289±0.015ab 266.024＊＊5 d 0.653±0.015 0.635±0.014 0.439±0.011ab 250.294＊＊

Fig.1 The apoptosis of Lovo cells detected by AnnexinⅤafter intervention圖1 AnnexinⅤ法檢測(cè)干預(yù)后各組Lovo細(xì)胞的凋亡率

Fig.2 The migration ability of Lovo cells after intervention detected by scratch test圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干預(yù)后各組Lovo細(xì)胞的遷移能力

Tab.3 Comparison of apoptosis rates between three Lovo cell groups表3 各組Lovo細(xì)胞凋亡率比較（%，）

＊＊P＜0.01；a與MOCK組比較，b與NC組比較，P＜0.05

組別MOCK組NC組KD組F n333普通培養(yǎng)基0.13±0.06 0.10±0.01 0.10±0.02 0.870高糖培養(yǎng)基0.63±0.06 0.50±0.10 1.43±0.06ab 137.600＊＊

Fig.3 Expressions of SIRT5,PKM2 and HK2 protein in Lovo cells圖3 各組Lovo細(xì)胞中SIRT5、PKM2及HK2蛋白的表達(dá)水平

Tab.4 Expression levels of SIRT5,mTOR,HIF-1α,PKM2 and HK2 mRNA in Lovo cells表4 各組Lovo細(xì)胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2 mRNA的表達(dá)水平 （）

Tab.4 Expression levels of SIRT5,mTOR,HIF-1α,PKM2 and HK2 mRNA in Lovo cells表4 各組Lovo細(xì)胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2 mRNA的表達(dá)水平 （）

＊＊P＜0.01；a與MOCK組比較，b 與NC組比較，P＜0.05

組別MOCK組NC組KD組F HK2 0.848±0.020 0.953±0.014a 0.556±0.022ab 384.648＊＊SIRT5 0.892±0.022 0.961±0.014a 0.315±0.023ab 955.638＊＊mTOR 0.816±0.020 0.921±0.010a 0.526±0.020ab 385.755＊＊HIF-1α 0.789±0.020 0.642±0.011a 0.319±0.027ab 466.180＊＊PKM2 0.856±0.010 0.976±0.022a 0.588±0.019ab 331.001＊＊

Tab.5 Expressions of SIRT5，mTOR，HIF-1α，PKM2 and HK2 protein in each Lovo cell group表5 各組Lovo細(xì)胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2蛋白的表達(dá)水平 （）

Tab.5 Expressions of SIRT5，mTOR，HIF-1α，PKM2 and HK2 protein in each Lovo cell group表5 各組Lovo細(xì)胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2蛋白的表達(dá)水平 （）

＊＊P＜0.01；a與MOCK組比較，b與NC組比較，P＜0.05

組別MOCK組NC組KD組F HK2 0.72±0.020 0.73±0.023 0.37±0.027ab 216.976＊＊SIRT5 0.730±0.019 0.690±0.022a 0.330±0.016ab 414.264＊＊mTOR 0.550±0.033 0.400±0.013a 0.250±0.012ab 150.426＊＊HIF-1α 0.390±0.034 0.220±0.021a 0.080±0.007ab 131.278＊＊PKM2 0.650±0.020 0.640±0.033 0.270±0.017ab 242.571＊＊

3 討論

研究顯示，結(jié)腸癌中伴發(fā)高血糖的總體病死率顯著高于正常血糖者［3］。SIRT5是Sirtuins家族中獨(dú)特的成員，具有NAD+依賴的去乙酰化、去丙二?；?、去琥珀?；叭ノ於；钚?，與糖脂代謝關(guān)系密切［6-7］。已有研究顯示，SIRT5 在胃癌［8］、乳腺癌［9］等惡性腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的代謝重編程中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，普通培養(yǎng)基中，靶向沉默 SIRT5 后 1～4 d 對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，5 d 時(shí)KD 組較 NC 組、MOCK 組 OD 值降低，但各組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高糖培養(yǎng)基中，靶向沉默后3～5 d時(shí)KD組較NC組和MOCK組OD值、24 h時(shí)遷移率明顯降低、凋亡率增加，提示與NC 組及MOCK組比較，KD組在普通培養(yǎng)基條件下第5天增殖才會(huì)降低，高糖培養(yǎng)基中沉默SIRT5 后次日細(xì)胞增殖水平即降低；高糖培養(yǎng)基中，KD 組較 NC 組、MOCK 組增殖、遷移能力明顯降低，而凋亡率增高，證實(shí)了SIRT5可促進(jìn)高糖環(huán)境下結(jié)腸癌的進(jìn)展。

HK2 及PKM2 是糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解活躍過(guò)程中其表達(dá)水平增高［4］。PKM2翻譯后修飾可促進(jìn)糖酵解，且PKM2高表達(dá)能增強(qiáng)Warburg 效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生［10］。已有研究顯示，SIRT5 介導(dǎo)的去琥珀酰化作用可調(diào)控糖酵解關(guān)鍵酶PKM2 的活性，進(jìn)而增強(qiáng)糖酵解能力［10］。筆者前期研究結(jié)果顯示，SIRT5、PKM2 及HK2 在結(jié)腸癌中高表達(dá)，且高表達(dá)部位一致，三者之間有一定的相關(guān)性［11］。目前，對(duì)于SIRT5 是否可通過(guò)影響糖代謝關(guān)鍵酶HK2及PKM2表達(dá)來(lái)促進(jìn)高糖環(huán)境下結(jié)腸癌發(fā)展還鮮見報(bào)道。本研究顯示，KD 組與NC 組及MOCK 組比較，高糖環(huán)境中結(jié)腸癌細(xì)胞PKM2及HK2mRNA 及其蛋白表達(dá)水平均降低，表明高糖環(huán)境下SIRT5可能通過(guò)直接或間接的方式影響糖酵解關(guān)鍵酶PKM2 及HK2 表達(dá)水平，從而促進(jìn)糖酵解并參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

糖代謝異常所致的高血糖環(huán)境下，HIF 通過(guò)激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporter，GLUT）及糖酵解基因的表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞攝入大量葡萄糖以加強(qiáng)糖酵解，使腫瘤細(xì)胞獲得充足的腺苷三磷酸（ATP）［12］，而活躍的糖酵解使HIF-1α 過(guò)表達(dá)，兩者共同作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［5］。糖酵解產(chǎn)生的大量乳酸可改變腫瘤細(xì)胞微環(huán)境，有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲。mTOR信號(hào)通路PI3K/AKt/mTOR 異常與腫瘤密切相關(guān)，該信號(hào)通路改變可促進(jìn)糖攝取和糖酵解的過(guò)程［13］。mTOR 與其調(diào)節(jié)的下游因子Myc家族和HIFs 家族在腫瘤中處于活化狀態(tài)且可共同作用，從而激活多種糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［14］。mTOR也可通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)的PKM2基因轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)PKM2 的表達(dá)，促使腫瘤的發(fā)生，且PKM2的異常表達(dá)與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)已得到證實(shí)［14］。本實(shí)驗(yàn)中，SIRT5-RNAi 慢病毒瞬時(shí)沉默SIRT5 后，與 NC 組及 MOCK 組比較，高糖環(huán)境中結(jié)腸癌細(xì)胞 mTOR、HIF-1α 及 PKM2 表達(dá)量均顯著下降，再次證實(shí)SIRT5 可通過(guò)直接或間接的方式影響糖酵解，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及遷移。

綜上所述，SIRT5 可能通過(guò)促進(jìn)高糖環(huán)境下糖酵解關(guān)鍵酶 HK2 表達(dá)及 mTOR/HIF-1α/PKM2 信號(hào)通路，以直接或間接方式促進(jìn)糖酵解，影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移，促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展。因此，筆者認(rèn)為SIRT5抑制劑可為結(jié)腸癌合并糖尿病的治療提供新的研究方向。