高效液相色譜-非特異性同位素稀釋質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量分析全血中總血紅蛋白含量

潘夢(mèng)蕓，馮流星，李紅梅

（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,北京100029）

血紅蛋白（HGB）是紅細(xì)胞中負(fù)責(zé)運(yùn)輸和儲(chǔ)存氧氣的含鐵蛋白，是判定貧血的重要標(biāo)志物［1，2］. HGB含量水平低表示貧血，含量水平高通?？蓪?dǎo)致心力衰竭、心臟病發(fā)作或中風(fēng). 另外，HGB含量水平異常還會(huì)導(dǎo)致非常嚴(yán)重的遺傳性疾病，如鐮狀細(xì)胞性貧血和地中海貧血. 鑒于HGB重要的生理功能，該項(xiàng)目的檢測(cè)在臨床檢驗(yàn)中非常普遍. 根據(jù)法國(guó)健康保險(xiǎn)（Sécurité Sociale）理賠統(tǒng)計(jì)，HGB 檢測(cè)在血液生物標(biāo)志物檢測(cè)數(shù)量方面居首位，每年需花費(fèi)約2.37億歐元［3］. 因此，臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域中HGB的準(zhǔn)確測(cè)量對(duì)于相關(guān)疾病的診斷和健康評(píng)估具有重要意義. 目前，臨床檢驗(yàn)中針對(duì)總HGB含量的檢測(cè)方法包括氰化高鐵光度測(cè)定（HiCN方法）［4］和堿性羥基高鐵血紅素（AHD）方法等［5，6］. 大多數(shù)相關(guān)報(bào)道的HGB含量測(cè)量結(jié)果均通過(guò)上述方法檢測(cè)得到. 但因前者使用劇毒的氰化鉀而后者采用單一波長(zhǎng)測(cè)定導(dǎo)致其使用受到限制，且結(jié)果無(wú)法追溯到國(guó)際單位制（SI）［7，8］. 近年來(lái)，歐盟IVD 指令及ISO17511，ISO17025等國(guó)際導(dǎo)則明確要求所有體外診斷產(chǎn)品的校準(zhǔn)物和控制物的定值需具有溯源性，以確保測(cè)量結(jié)果的一致性和有效性［9～11］. 因此，需要建立準(zhǔn)確、可靠且可溯源的全血中HGB的準(zhǔn)確測(cè)量方法，以作為國(guó)際臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的參考測(cè)量程序，從而促進(jìn)全球醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域HGB項(xiàng)目的等效測(cè)量和國(guó)際互認(rèn).

通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）對(duì)蛋白質(zhì)中的特征元素進(jìn)行測(cè)量從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的定量分析，是近年來(lái)蛋白質(zhì)定量技術(shù)研究的熱點(diǎn)［12，13］. ICP-MS結(jié)合同位素稀釋法（ID）及相關(guān)分離技術(shù)可以滿足蛋白質(zhì)高準(zhǔn)確度定量的要求，通過(guò)元素定量可直接溯源到SI單位，溯源鏈短且更為清晰［8，14，15］. 因此，通過(guò)測(cè)定HGB中的鐵（Fe）元素含量可以實(shí)現(xiàn)HGB絕對(duì)定量的目的. 文獻(xiàn)［16～18］報(bào)道了采用57Fe濃縮同位素稀釋劑定量HGB的HPLC-ID-ICP-MS方法，但其常應(yīng)用于純化的血細(xì)胞，鮮見(jiàn)對(duì)全血等復(fù)雜基體樣品中HGB定量的報(bào)道. 此外，迄今尚未見(jiàn)對(duì)復(fù)雜全血基體中轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）和HGB同時(shí)定量的研究報(bào)道，其主要困難在于樣品基體復(fù)雜、存在其它蛋白的干擾且蛋白之間的含量差別較大，難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)量.

本文采用HPLC-ICP-MS與非特異性-ID相結(jié)合，通過(guò)測(cè)定目標(biāo)蛋白中的Fe元素實(shí)現(xiàn)對(duì)全血中HGB的定量分析. 首先采用HGB 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品，通過(guò)在線HPLC-ID-ICP-MS 和樣品整體消解后ID-ICP-MS進(jìn)行測(cè)量并與標(biāo)準(zhǔn)值比較，驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性和可靠性. 在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用到全血樣品中HGB和Tf的定量分析，并考察了54Fe同位素稀釋劑流速的影響，實(shí)現(xiàn)了2種蛋白的同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)量. 該方法準(zhǔn)確、可靠，可直接溯源到SI單位，可作為國(guó)際臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中HGB檢測(cè)的潛在參考測(cè)量程序.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

HGB 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（IRMM/IFCC-467）購(gòu)自歐盟標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所（IRMM）；人轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）和人白蛋白（Alb）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；乙酸銨（NH4Ac）和三羥甲基氨基甲烷（Tris）均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司；濃硝酸（HNO3，優(yōu)級(jí)純）購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；全血樣品、54Fe 濃縮同位素稀釋劑（GBW04462，濃度為7.8337 μg/g，56Fe/54Fe 豐度比為0.11313）和鐵單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液［GBW（E）080123］由中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供.

Element 2型扇形磁場(chǎng)電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS，美國(guó)ThermoFisher Scientific 公司）；高效液相色譜系統(tǒng)（HPLC，日本Shimadzu公司）；Mill-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；TSK-Gel G3000SWxl凝膠柱（300 mm×7.8 mm，日本Tosoh公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 樣品前處理 全血樣品和HGB標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IRMM/IFCC-467均為液體，無(wú)需進(jìn)行樣品復(fù)溶. 使用前將這2 種樣品在渦旋振蕩器上進(jìn)行均質(zhì)化0.5 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)程序?qū)悠废♂尩胶线m的濃度進(jìn)樣. 在ID-ICP-MS分析過(guò)程中，所有制備步驟均通過(guò)重量分析完成，所有稱量過(guò)程均經(jīng)過(guò)空氣浮力校正.

樣品消解：準(zhǔn)確稱量0.02 g全血樣品，添加1 g54Fe同位素稀釋劑溶液，使混合樣品中56Fe/54Fe豐度比約為1∶1. 加入3 mL HNO3，于185 ℃燜罐消解4 h后，將殘留的HNO3蒸發(fā)至近干，并用去離子水稀釋至約12 g，混合均勻后待測(cè)，平行制備5 個(gè)樣品. IRMM/IFCC-467 樣品的制備過(guò)程與全血樣品相同.

HPLC-ID-ICP-MS分析樣品前處理：將50 μL IRMM/IFCC-467樣品溶液稀釋至2 mL，渦旋15 min混合均勻進(jìn)樣至HPLC-ICP-MS中進(jìn)行測(cè)量. 先將50 μL全血樣品溶液稀釋至2 mL，渦旋15 min使紅細(xì)胞完全破裂并釋放出HGB；然后，以8000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min 以去除細(xì)胞碎片并促進(jìn)其均質(zhì)化，重復(fù)3 次后進(jìn)樣至HPLC-ICP-MS 中進(jìn)行測(cè)量［19，20］. 所有液相色譜樣品在進(jìn)樣前均經(jīng)過(guò)0.22 μm 有機(jī)相微孔濾膜過(guò)濾.

1.2.2 HPLC 分離條件 HPLC 分離采用TSK-gel G3000SWxl 色譜柱，流動(dòng)相為12.5 mmol/L Tris 和125.0 mmol/L NH4Ac 的混合溶液，pH=7.8，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)280 nm，柱溫30 ℃，流速0.35 mL/min，色譜分析時(shí)間程序：35 min，等度洗脫.

1.2.3 ICP-MS 分析條件 儀器功率1300 W，樣品載氣流速1.05 L/min，輔助氣流速0.87 L/min，冷卻氣流速16.00 L/min，分辨率（m/Δm）4000，掃描次數(shù)700×1.

1.2.4 在線HPLC-ID-ICP-MS 定量分析實(shí)驗(yàn) 在測(cè)量HGB 中Fe 的含量時(shí)，通過(guò)島津液相系統(tǒng)自帶的LC-20AD 泵加入54Fe 稀釋劑，與液相色譜的洗脫液經(jīng)過(guò)三通混合后進(jìn)入ICP-MS，在線測(cè)量混合溶液中56Fe/54Fe同位素比值Rm，并根據(jù)柱后同位素稀釋公式（1），轉(zhuǎn)化為待測(cè)元素在整個(gè)液相過(guò)程中的質(zhì)量流（MFs）譜圖［15］.

式中：csp和dspfsp分別表示富集同位素稀釋劑的濃度（ng/g）和質(zhì)量流速（g/min）；Ms和Msp分別為蛋白質(zhì)樣品和同位素稀釋劑中待測(cè)元素的相對(duì)原子質(zhì)量；和分別為樣品和稀釋劑中核素b的豐度；Rs，Rsp和Rm分別為樣品、稀釋劑和混合樣品中核素a與核素b的豐度比. 質(zhì)量色譜圖中相應(yīng)蛋白質(zhì)峰的積分可提供該蛋白質(zhì)中Fe的絕對(duì)量. 根據(jù)每種蛋白質(zhì)的進(jìn)樣量和其中Fe的物質(zhì)的量之比，可以計(jì)算出目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度.

全血中HGB和Tf的含量差別較大（其中Tf為2.2～4.0 mg/g，HGB為100.0～150.0 mg/g），導(dǎo)致2種蛋白中Fe含量差別也很大. 為保證Rm比值合適，采用改變稀釋劑流速的方法，在液相色譜時(shí)間程序的前22 min（Tf 出峰部分），選擇54Fe 同位素稀釋劑的流速為0.05 mL/min，然后增大至0.40 mL/min 以適應(yīng)HGB中Fe含量的巨大差異，并且當(dāng)流速改變時(shí)質(zhì)譜信號(hào)也隨之變化并逐漸達(dá)到穩(wěn)定.

1.2.5 樣品消解-ID-ICP-MS定量分析實(shí)驗(yàn) 首先將樣品消解后采用ID-ICP-MS測(cè)定總Fe含量，然后根據(jù)尺寸排阻色譜（SEC）-HPLC-ICP-MS 檢測(cè)的結(jié)果計(jì)算出HGB 中Fe 含量占總Fe 含量的比例，再根據(jù)HGB中Fe的物質(zhì)的量之比換算即可得到HGB的濃度值. 樣品測(cè)定結(jié)果的計(jì)算公式如下［21］：

式中：Rz，Ry和Rb分別為待測(cè)樣品、稀釋劑和混合后樣品中被選定的2個(gè)同位素的豐度比；Riy和Riz分別為稀釋劑和待測(cè)樣品中第i個(gè)同位素與參考同位素的豐度比；n為最大同位素的序號(hào)；my和mz分別為混合時(shí)稀釋劑和待測(cè)樣品的質(zhì)量；cy和cz分別為稀釋劑和待測(cè)樣品的濃度；Mi為第i個(gè)同位素的相對(duì)原子質(zhì)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IRMM/IFCC-467的絕對(duì)定量

采用SEC 分離IRMM/IFCC-467 樣品的液相色譜圖示于圖1，可見(jiàn)HGB 的洗脫保留時(shí)間為26 min. 該樣品是分離純化后的HGB，因此其色譜圖無(wú)其它雜質(zhì)峰，且色譜峰峰型良好，表明該液相色譜分離條件合適，可用于下一步的實(shí)驗(yàn)分析.

采用富集同位素54Fe 溶液作為稀釋劑，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白用液相色譜柱洗脫后由LC-20AD 泵引入，ICP-MS 在線檢測(cè)的Fe 信號(hào)強(qiáng)度譜圖如圖2（A）所示. 由于蛋白質(zhì)中存在高豐度的Fe，經(jīng)液相色譜洗脫后在線進(jìn)入ICP-MS 中檢測(cè)時(shí)，56Fe 會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的質(zhì)譜峰. 由于該樣品為純化的血細(xì)胞樣品，其中的Fe 僅來(lái)自HGB，因此在ICP-MS 圖譜中僅有1 個(gè)Fe 的信號(hào)峰. 由于LC-20AD 泵一直勻速向液相洗脫液中加入54Fe稀釋劑溶液，因此54Fe信號(hào)強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定. 根據(jù)公式（1）對(duì)同位素比值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理可得到質(zhì)量流譜圖［圖2（B）］，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行峰面積積分，計(jì)算出蛋白質(zhì)中Fe的絕對(duì)質(zhì)量，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中Fe的化學(xué)計(jì)量比和液相進(jìn)樣體積，即可計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的絕對(duì)濃度. 數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表1.

由表1可知，測(cè)得的HGB濃度為（117.6±1.3）mg/g，測(cè)量值在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次的RSD小于3%，證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果及建立的方法可靠. 建立的柱后同位素稀釋方法可通過(guò)直接測(cè)定金屬蛋白中的金屬元素來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，具有精密度好、測(cè)量參數(shù)少且可溯源到SI單位等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的儀器漂移及流動(dòng)相的基體效應(yīng)等因素對(duì)56Fe/54Fe測(cè)量的影響不大［22］.

Fig.1 LC spectrum of IRMM/IFCC?467 reference material by SEC

Fig.2 ICP?MS spectra of IRMM/IFCC?467 via iron

為了對(duì)上述建立的方法進(jìn)行補(bǔ)充，采用樣品全消解的ID-ICP-MS 方法測(cè)量了HGB 樣品中的Fe 含量. 由于使用的樣品是由純化血細(xì)胞制備而成，不含有其它含鐵蛋白，因此其中的Fe全部來(lái)自于HGB. 通過(guò)公式（2）可計(jì)算出其中Fe的含量，進(jìn)而根據(jù)Fe與HGB的摩爾比得到測(cè)量結(jié)果為（116.0±2.1）mg/g（表1）. 通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)2種方法的定量結(jié)果互相吻合，且在標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度范圍之內(nèi)，證明了2種方法的準(zhǔn)確性及可靠性.

2.2 全血樣品中HGB和Tf的絕對(duì)定量分析

在前期建立的標(biāo)準(zhǔn)蛋白絕對(duì)定量方法基礎(chǔ)上，將其應(yīng)用于全血樣品中HGB及Tf的絕對(duì)定量分析.與HGB 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，全血樣品基體復(fù)雜，其中的Fe不僅來(lái)自HGB，還可能來(lái)自于其它含有Fe的金屬蛋白，因此所需要的實(shí)驗(yàn)條件更具有挑戰(zhàn)性.為了實(shí)現(xiàn)全血樣品中HGB及Tf的同時(shí)定量，首先采用SEC柱進(jìn)行液相分離. 實(shí)驗(yàn)中考慮到HGB在色譜柱中的保留時(shí)間（見(jiàn)圖1），可以通過(guò)優(yōu)化的液相色譜條件分離2 種含F(xiàn)e 的蛋白. 全血樣品的液相色譜圖如圖3 所示，在保留時(shí)間為26 min 時(shí)洗脫了HGB. 對(duì)于21 min時(shí)的色譜峰，除了Tf外，其它分子量相似的蛋白質(zhì)（如Alb）也有可能產(chǎn)生［23］.但是，由于Alb中不含F(xiàn)e原子，因此Alb的存在不會(huì)干擾到基于Fe元素的同位素稀釋HPLC-ID-ICPMS方法中Tf的定量.

此外，通過(guò)ID-HPLC-ICP-MS同時(shí)定量Tf和HGB的另一個(gè)挑戰(zhàn)是全血中HGB和Tf的含量存在較大差異，導(dǎo)致兩者中Fe含量的巨大差異. 因此，在同時(shí)測(cè)量HGB和Tf中的Fe含量時(shí)，最佳56Fe/54Fe比值的選擇尤其重要. 實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)LC-20AD泵引入濃度恒定（100.4 ng/g）的54Fe富集同位素稀釋劑溶液，并在線改變富集同位素稀釋劑的流速以調(diào)整洗脫液中的最佳56Fe/54Fe比值. 如圖4（A）所示，將54Fe富集同位素稀釋劑的流速在前22 min（Tf 洗脫）中設(shè)置為0.05 mL/min，然后增大至0.40 mL/min 以適應(yīng)HGB中Fe含量的巨大差異，并且當(dāng)流速改變時(shí)，質(zhì)譜信號(hào)隨之變化并逐漸達(dá)到穩(wěn)定，由此實(shí)現(xiàn)通過(guò)Fe在全血中同時(shí)測(cè)量Tf和HGB的目的.

圖4（B）示出了由56Fe 和54Fe 的信號(hào)積分獲得的56Fe/54Fe 比值以及通過(guò)公式（1）計(jì)算得出的Fe 元素的質(zhì)量流量. 通過(guò)積分相應(yīng)的峰，獲得了HGB和Tf中Fe的絕對(duì)含量. 由于已知HGB和Tf中的Fe原子數(shù)，因此通過(guò)蛋白質(zhì)中Fe的化學(xué)計(jì)量和進(jìn)樣量可以計(jì)算出全血樣品中HGB和Tf的濃度. 由表2可見(jiàn)，總HGB和Tf含量分別為（115.3±2.4）mg/g和（4.6±1.4）mg/g，且均在人全血中的正常濃度范圍內(nèi).

Table 1 Absolute quantitative results of IRMM/IFCC-467 reference materials(n=3)

Fig.3 LC spetrum of whole blood sample by SEC

Fig.4 Mass spectra of whole blood sample via iron

對(duì)于全血樣品，由圖4（A）中2 個(gè)Fe 元素峰計(jì)算得出Tf 貢獻(xiàn)Fe 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.85%. 因此在采用樣品消解-ID-ICP-MS測(cè)量過(guò)程中，扣除Tf中Fe 含量的貢獻(xiàn)并結(jié)合公式（2），得到全血中HGB 含量為（115.5±2.1）mg/g，這與在線HPLCID-ICP-MS 方法的定量結(jié)果（圖5）一致. 此外，根據(jù)流程空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計(jì)算可得該方法的檢出限為1.0×10―7mg/g.

綜上所述，以同位素稀釋技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合HPLC-ICP-MS 聯(lián)用技術(shù)，通過(guò)對(duì)目標(biāo)蛋白中Fe的測(cè)量，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜全血基體中Tf 和HGB 的準(zhǔn)確定量. 該方法的RSD<3%，檢出限為1.0×10-7mg/g，且可直接溯源到SI單位，克服了蛋白樣品前處理復(fù)雜、定量偏差大及基體匹配標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)匱乏等不足. 建立的基于ID-HPLC-ICP-MS 的復(fù)雜生物基體中大分子絕對(duì)定量技術(shù)可實(shí)現(xiàn)在基體樣品中多種蛋白質(zhì)的同時(shí)定量分析，為無(wú)機(jī)質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)提供了切實(shí)可行的方法基礎(chǔ).

Table 2 Absolute quantitative analysis of total HGB and Tf in whole blood(n=3)

Fig.5 Comparison results of HGB measured by bulk?ID?ICP?MS and HPLC?ID?ICP?MS method