硬組織切磨技術(shù)及操作要點(diǎn)

毛永建，李華

北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （北京 101111）

近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)水平的提高，醫(yī)療器械產(chǎn)業(yè) 迅速發(fā)展，醫(yī)療器械生物安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)越來(lái)越完善。植入性局部反應(yīng)試驗(yàn)是醫(yī)療器械生物安全性評(píng)價(jià)的重要試驗(yàn)項(xiàng)目，其中很多齒科材料、骨科材料、血管支架等器械材料的組分是鈦、鎳、鎂等金屬材料或高強(qiáng)度的高分子聚合物，使得普通石蠟切片技術(shù)已經(jīng)無(wú)法滿(mǎn)足組織制片的需求，而硬組織切磨技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了這一短板[1]。本研究以EXAKT 硬組織切磨設(shè)備為例，闡述制備硬組織磨片的技術(shù)方法及操作要點(diǎn)（目前，市場(chǎng)上制備硬組織磨片的設(shè)備有多種，其中大多數(shù)制作方法與EXAKT 切磨方法大同小異，制作步驟亦可參考此方法）。

1 設(shè)備與材料

1.1 設(shè)備

EXAKT 切磨系統(tǒng)。

1.2 試劑

10%中性甲醛、梯度乙醇、Technovit 7200VLC 光固化樹(shù)脂、Technovit 7210VLC 精密粘合樹(shù)脂、Technovit 4000冷固化樹(shù)脂。

2 方法

2.1 固定與分切

在標(biāo)本取材后，應(yīng)立即將其放入10%中性甲醛固定液中（pH 為7.0）初固定1～2 d，固定液與組織的比例至少為10:1。

在較大組織標(biāo)本初固定后，精確定位所需觀察的組織或植入物，用E300CP 組織切片機(jī)分切成小且薄的組織塊，繼續(xù)固定（以5 mm 厚度為例，繼續(xù)固定1～2 d）；如果是較大的動(dòng)物組織標(biāo)本或植入物，無(wú)法分切得很薄，則固定時(shí)間應(yīng)成倍增加，但若固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，甲醛會(huì)呈弱酸性，影響后期的染色。

2.2 脫水

乙醇濃度梯度為70%、80%、90%、95%、100%、100%。為防止組織塊收縮過(guò)快，要從低濃度的乙醇開(kāi)始脫水，并根據(jù)組織塊的種類(lèi)、大小薄厚等確定脫水時(shí)間。表1是一塊含金屬材料骨組織的參考脫水時(shí)間。

表1 體積為1 cm3含金屬材料骨組織的脫水時(shí)間

同等體積的肌肉和皮膚植入組織的脫水時(shí)間略短于骨植入組織，其中低濃度的乙醇脫水時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，高濃度的相對(duì)較短。當(dāng)組織塊過(guò)大過(guò)厚時(shí)，應(yīng)間斷進(jìn)行負(fù)壓抽真空處理，根據(jù)實(shí)際情況觀察組織脫水的狀態(tài)，靈活調(diào)控時(shí)間。

2.3 浸透

將脫水后的標(biāo)本逐級(jí)浸入無(wú)水乙醇/7200VLC 光固化樹(shù)脂中，具體時(shí)間根據(jù)樣品調(diào)整。表2是體積為1 cm3含植入物肌肉組織的浸透時(shí)間。

表2 體積為1 cm3含植入物肌肉組織的浸透時(shí)間

同等體積的骨或皮膚植入組織的浸透時(shí)間可參考肌肉植入組織。為了使7200VLC 光固化樹(shù)脂更好地浸透到組織中，間斷進(jìn)行抽真空處理非常必要。因浸透前期組織塊中含有無(wú)水乙醇，所以長(zhǎng)時(shí)間抽真空很可能使組織龜裂。如無(wú)抽真空設(shè)備，表2中抽真空的步驟會(huì)導(dǎo)致浸透時(shí)間延長(zhǎng)1～2 d。一旦浸透不好，切磨片時(shí)組織塊表面會(huì)有很多空腔或造成樣品、組織脫落，因此，不建議浸透時(shí)間太短。

2.4 包埋

使用光固化包埋機(jī)低強(qiáng)度光源（黃光），使包埋介質(zhì)進(jìn)一步聚合，時(shí)間需要4～6 h，環(huán)境溫度應(yīng)低于40 ℃[2]，如此得到的樹(shù)脂膠硬度較高且固化較穩(wěn)定。

使用藍(lán)色光源，使浸透到組織內(nèi)的包埋介質(zhì)完全固化，時(shí)間為8～12 h。

包埋時(shí)要選擇合適的包埋模具，為節(jié)省空間及時(shí)間，如果組織標(biāo)本塊較小，則可以在一個(gè)包埋模具中同時(shí)包埋數(shù)塊組織，但一定要標(biāo)記好每一塊組織的擺放位置且確保位置適當(dāng)，方便后期分切。

2.5 組織標(biāo)本塊基座的制作

將玻璃載片吸附在真空粘合壓片器上，然后使用Technovit 4000冷固化樹(shù)脂將組織標(biāo)本塊固定在玻片上，注意Technovit 4000冷固化樹(shù)脂Ⅰ液:Ⅱ液:粉末的最佳比例應(yīng)為2:1:3，如果比例恰當(dāng)，Technovit 4000會(huì)很快固化，若攪動(dòng)不充分固化，會(huì)導(dǎo)致磨片時(shí)遇水粘合不牢，可以先將兩種液體混合均勻，然后加入定量的白色粉末中，用攪拌棒快速充分?jǐn)噭?dòng)。需要注意的是，因Technovit 4000有毒有害，所以操作最好在通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行，并佩戴護(hù)具。

對(duì)組織標(biāo)本塊進(jìn)行初步研磨，露出所需觀察的組織面，如果觀察到組織面有空腔或裂紋，則使用E530型干燥聚合修復(fù)裝置，在組織表面滴上7200VLC 樹(shù)脂（量不宜太多，鋪滿(mǎn)組織面即可），然后進(jìn)行負(fù)壓抽真空，再修復(fù)固化1次；修復(fù)后，待組織塊完全干燥再進(jìn)行研磨等操作，否則會(huì)有7200VLC 殘留成分或殘留樣品，待染色后，于鏡下觀察有油污狀污染物，會(huì)影響閱片[3]。

在E400CS 組織磨片機(jī)上用砂紙（320、500、800、1 200、2 500、4 000目等）將附有下載片的標(biāo)本塊組織面研磨成光滑均勻且與玻璃載片平行的平面，露出所需觀察的組織及植入物。對(duì)于帶有金屬植入物的組織標(biāo)本塊，研磨速度要慢，砝碼選擇要小，從320目砂紙開(kāi)始逐步研磨，確保拋光后金屬面與組織面薄厚一致[每次更換砂紙前組織面要用數(shù)顯千分尺測(cè)量至少4個(gè)點(diǎn)位（每個(gè)點(diǎn)位之間的測(cè)量值之差應(yīng)≤5 μm），取平均值]。值得注意的是，為了確保磨片機(jī)的穩(wěn)定，要提前開(kāi)機(jī)預(yù)熱空轉(zhuǎn)30 min；為了確保砂紙與磨盤(pán)貼合的更好更平整，砂紙需要提前在水中浸泡1～2 h，注意時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免影響砂紙的鋒利度。制備好的組織塊基座見(jiàn)圖1。

2.6 附加平行載片

因樹(shù)脂載片不易碎，且與Technovit 7210VLC 精密粘合劑及組織標(biāo)本塊結(jié)合得更好，所以應(yīng)選擇樹(shù)脂載片作為平行載片，但其成本及淘汰率較高，且因采購(gòu)到的樹(shù)脂片工藝水平差異較大，易出劃痕，導(dǎo)致表面不平整（誤差在5 μm 以上），所以要求精確測(cè)量其厚度。

圖1 組織標(biāo)本塊的基座

將平行載片吸附在EXAKT 平行粘合壓片機(jī)上，然后用Technovit 7210VLC 精密粘合劑粘在平行組織面上（注意防止產(chǎn)生氣泡），打開(kāi)光源，開(kāi)始固化，時(shí)間為10～15 min，注意粘時(shí)要確保取粘合劑的器械、組織面、平行載片的表面的清潔，見(jiàn)圖2。

需要注意的是，由于7210VLC 粘合劑呈弱酸性，接觸含“鎂”等活性金屬時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，因此，不能被用于粘接該類(lèi)樣品[4]。

圖2 附加平行載片的結(jié)構(gòu)

2.7 計(jì)算膠的厚度

為保證最終制片的準(zhǔn)確厚度，需使用數(shù)顯千分尺精確測(cè)量并計(jì)算出附加好平行載片后7210VLC 粘合劑的厚度，測(cè)量及計(jì)算方法見(jiàn)圖3。

圖3 組織塊的結(jié)構(gòu)

需要注意的是，測(cè)量的所有步驟都應(yīng)保持在同一溫度下，且根據(jù)組織面的大小選擇測(cè)量點(diǎn)位數(shù)量，組織面越大則測(cè)量點(diǎn)位應(yīng)越多，一般為4～5個(gè)點(diǎn)，求平均值。

2.8 切片

使用E300CP 硬組織切片機(jī)，將有樹(shù)脂平行載片的一面切割成厚度為100～200 μm 的切片，且不宜太薄，因切片后續(xù)要經(jīng)過(guò)多道砂紙逐步研磨，太薄會(huì)給每道砂紙研磨的控制帶來(lái)困難；亦不宜太厚，因有的樣本塊可能需要制備多張切片，太厚會(huì)浪費(fèi)包含植入物的組織。由于設(shè)備的參數(shù)設(shè)置并不能精準(zhǔn)地控制切片的厚度，所以，切片的厚度在很大程度上取決于個(gè)人經(jīng)驗(yàn)的積累。

切片帶鋸和支撐輪組裝是否到位及選擇的帶鋸是否合適都會(huì)直接影響切片的平整度，如果切片前后凹凸不平，則考慮是由于設(shè)備組裝不到位或帶鋸不夠鋒利導(dǎo)致。在切割過(guò)程中，切割臺(tái)下有50～100 g 的推動(dòng)力，在切片過(guò)程中任何外力都會(huì)導(dǎo)致切割面凹凸不平。當(dāng)帶有金屬植入物的組織或組織塊較大時(shí)，帶鋸的轉(zhuǎn)速和擺動(dòng)速度均要慢，且應(yīng)選擇較小的推動(dòng)力。

2.9 磨片

用數(shù)顯千分尺測(cè)量、計(jì)算組織的準(zhǔn)確厚度，根據(jù)所測(cè)量厚度調(diào)定需在磨片機(jī)上研磨的厚度；當(dāng)切片很薄時(shí)，可省略320目砂紙研磨，選擇500、800、1 200、2 500、4 000目的砂紙磨片至需要的厚度為止；需要注意的是，研磨到2 500 目時(shí)要格外小心，因?yàn)榈? 500 目時(shí)切片的厚度已接近預(yù)設(shè)值，進(jìn)一步需要的研磨量已很難由設(shè)置參數(shù)來(lái)控制，需依賴(lài)自身經(jīng)驗(yàn)去設(shè)定研磨時(shí)間，極端情況下，受研磨時(shí)冷卻水的影響，可能會(huì)出現(xiàn)片子被機(jī)器緊密吸附，導(dǎo)致組織和植入物在極短時(shí)間內(nèi)被全部磨掉的情況。4 000目砂紙起拋光的作用，設(shè)定時(shí)間可以長(zhǎng)一些，可為7～10 min 或更長(zhǎng)。

2.10 染色

常用染色法包含HE 染色法、甲苯胺藍(lán)染色法及亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色法，我們可以根據(jù)所需觀察的指標(biāo)選擇不同的染色方法。HE 染色法的步驟與常規(guī)石蠟切片HE染色法基本一致（去掉脫蠟部分），但固化后的樹(shù)脂不易上色，可根據(jù)組織標(biāo)本塊種類(lèi)、厚度、大小的不同來(lái)適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間，如普通石蠟切片HE 染色中蘇木素染色時(shí)間需要5～10 min，而硬組織磨片需要20～30 min 或更長(zhǎng)；待每個(gè)步驟完成后，均需于鏡下觀察染色效果，若效果不佳，則需復(fù)染并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)整時(shí)間；不同的組織、不同厚度的磨片染色時(shí)間存在差異，只有及時(shí)進(jìn)行鏡下觀察及持續(xù)積累經(jīng)驗(yàn)，才能不斷提升硬組織磨片染色的質(zhì)量。

3 討論

與石蠟切片技術(shù)比較，硬組織切磨技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：（1）不用脫鈣，眾所周知，脫鈣程度不好把控，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可引起組織細(xì)胞皺縮而造成組織結(jié)構(gòu)不完整[5]，對(duì)于一些含鈣較高的醫(yī)用材料，脫鈣可破壞組織結(jié)構(gòu)，影響其生物學(xué)評(píng)價(jià)及定量分析；（2）可以做到原位切片，對(duì)于一些植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)，很多醫(yī)用金屬或其他材料（如鈦、鎂等金屬材料、帶螺紋的牙科種植體及一些不規(guī)則的醫(yī)用材料等），石蠟切片無(wú)法做到原位切片。硬組織切磨技術(shù)的缺點(diǎn)：（1）成本高，設(shè)備、帶鋸、砂紙、樹(shù)脂及樹(shù)脂載片等主要耗材均需專(zhuān)機(jī)配套使用，價(jià)格較石蠟切片高很多；（2）周期相對(duì)長(zhǎng)，一張標(biāo)準(zhǔn)的硬組織磨片從固定到浸透到最終制作成片再到染色至少需要2個(gè)月，如組織標(biāo)本塊過(guò)大或過(guò)厚還需再延長(zhǎng)時(shí)間；（3）步驟繁多，每一步都需精雕細(xì)刻，時(shí)間無(wú)法省略或縮短；（4）硬組織磨片相對(duì)較厚，普通石蠟切片可以控制在3～5 μm，但硬組織制片終厚度在20～50 μm，由于其材料的特殊性和設(shè)備的不穩(wěn)定性，過(guò)薄的切片不易染色且易造成組織及樣品缺失。

總之，硬組織切磨技術(shù)是醫(yī)療器械生物安全性評(píng)價(jià)的重要技術(shù)手段。制作一張標(biāo)準(zhǔn)的硬組織磨片周期跨度很長(zhǎng)，全程操作步驟均不可逆，且每個(gè)硬組織標(biāo)本塊最多只可切幾張切片，每一張都很珍貴，因此，每一步操作都要到位，謹(jǐn)慎細(xì)心，精準(zhǔn)控制時(shí)間，避免失誤；此外，操作技術(shù)人員需要不斷地學(xué)習(xí)和實(shí)踐，積累豐富的制片經(jīng)驗(yàn)。

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