1-脫氧野尻霉素對肥胖小鼠甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)的影響

李思遠(yuǎn)，寧俊麗，丁曉雯，黃先智

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.西南大學(xué) 家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716）

肥胖是一種主要由長期能量攝入與消耗失衡而導(dǎo)致的全球性慢性疾病，影響機(jī)體的糖、脂代謝及激素代謝等諸多代謝系統(tǒng)，是癌癥、高血壓、2型糖尿病、心血管疾病[1-3]的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為影響人類健康的五大危險(xiǎn)因素之一[4]。

甲狀腺激素（thyroid hormones，THs）作為一種內(nèi)分泌激素，能夠促進(jìn)脂肪酸氧化，促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為膽汁酸外排，在調(diào)節(jié)脂代謝及能量平衡等方面具有重要意義[5]。THs主要包含甲狀腺素（thyroxine，T4）和三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）兩種。甲狀腺合成及釋放的THs大部分為T4，只有少部分為T3，其中T4為THs的主要存在形式，通常被認(rèn)為是激素前體，而T3活性是T4的5 倍，是THs的主要活性形式，主要來源于肝臟等組織中I型脫碘酶（type 1 deiodinase，DIO1）使T4脫碘生成[6]。血液中的THs以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)形式保持動態(tài)平衡，只有游離態(tài)THs能夠進(jìn)入靶細(xì)胞與甲狀腺激素受體（thyroid receptor，TR）結(jié)合發(fā)揮生理作用[7]。

目前，已有大量研究報(bào)道了在肥胖條件下THs水平及其代謝的變化，Shen Huiting等[8]認(rèn)為，相比正常小鼠，肥胖小鼠總甲狀腺素（total T4，TT4）水平顯著下降，游離甲狀腺素（free T4，F(xiàn)T4）水平顯著上升，總?cè)饧谞钕僭彼幔╰otal T3，TT3）及游離三碘甲狀腺原氨酸（free T3，F(xiàn)T3）水平無明顯變化；Cheserek等[9]研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠相比正常小鼠，TT4水平顯著增加，TT3水平顯著降低，F(xiàn)T4及FT3水平無明顯變化，同時(shí)DIO1mRNA表達(dá)下調(diào)；另有研究表明肥胖小鼠TT4、TT3水平均顯著下降，肝臟DIO1mRNA及TRβmRNA表達(dá)顯著下調(diào)[10]。盡管關(guān)于肥胖個(gè)體THs水平的變化沒有一致的結(jié)論，但可以確定的是肥胖導(dǎo)致調(diào)節(jié)THs合成及釋放的下丘腦-垂體-甲狀腺軸（hypothalamic-pituitary-thyroid axis，HPT）功能紊亂[11]、THs功能異常、機(jī)體能量代謝失衡進(jìn)一步加劇。由于THs特別是T3能夠促進(jìn)能量消耗，許多學(xué)者曾利用T3治療肥胖，但最終因其對心血管存在負(fù)面效應(yīng)而放棄[12]，因此，尋找對肥胖患者甲狀腺功能具有一定改善作用但毒副作用小的天然食品功能成分，對于肥胖的改善甚至治療具有重要意義。

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一種主要從植物桑中分離得到的哌啶生物堿，其降糖、降脂、抗腫瘤、抗病毒等生理活性已被科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明[13-15]。在脂代謝方面，目前發(fā)現(xiàn)DNJ降脂機(jī)理主要為調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)酶活性，抑制脂肪酸合成，促進(jìn)脂肪酸β氧化[16]，但對肥胖個(gè)體THs穩(wěn)態(tài)的影響鮮有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠為模型，研究肥胖對THs穩(wěn)態(tài)的影響以及DNJ的干預(yù)作用，探究DNJ改善肥胖的新途徑。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

140 只4 周齡清潔級昆明種小鼠（雌雄各半），生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2018-003，購于重慶恩斯維爾生物科技有限公司。

基礎(chǔ)飼料 重慶恩斯維爾生物科技有限公司；高脂飼料[17-18]由實(shí)驗(yàn)室自行配制：含基礎(chǔ)飼料78.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇1%、膽酸鈉0.2%。

DNJ（純度≥98%） 南京道斯夫生物技術(shù)有限公司；總甘油三酯（total triglyceride，TG）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、BCA法總蛋白測定試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司；極低密度脂蛋白膽固醇（very low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）ELISA試劑盒 廈門慧嘉生物技術(shù)公司；TT4 ELISA試劑盒、TT3 ELISA試劑盒、DIO1活力測定試劑盒、DIO1含量測定ELISA試劑盒、TRβ含量ELISA試劑盒 上海優(yōu)選生物技術(shù)有限公司提供；總RNA提取試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）SYBR Green染料試劑盒 上海翊圣生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R型臺式冷凍高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；EPOCH2型全波長酶標(biāo)儀 美國基因公司；QTOWER 3G實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 德國耶拿分析儀器公司；FM200型勻漿機(jī) 上海弗魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 DNJ灌胃液的配制

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果[16]，將DNJ用生理鹽水溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8 mg/mL的DNJ溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肥胖小鼠模型的建立

140 只4 周齡昆明小鼠（雌雄各半）適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)挑選20 只（雌雄各10 只）作為對照組，繼續(xù)飼喂基礎(chǔ)飼料，其余120 只作為造模組飼喂高脂飼料6 周，根據(jù)下式計(jì)算肥胖度。肥胖度大于20%時(shí)認(rèn)為造模成功[19]。

1.3.3 動物分組及飼養(yǎng)

隨機(jī)選擇造模成功的肥胖小鼠80 只（雌雄各半）分為4 組（每組20 只，雌雄各半），分別為肥胖對照組和DNJ高、中、低劑量組，繼續(xù)飼喂高脂飼料。以1.3.2 節(jié)中的對照組作為正常對照組繼續(xù)飼喂基礎(chǔ)飼料。DNJ高、中、低劑量組分別以8.0、4.0、2.0 mg/（kgmb·d）劑量灌胃DNJ，正常對照組與肥胖對照組以生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃45 d。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食飲水，每5 d稱1 次體質(zhì)量?？刂剖覝兀?2±2）℃、相對濕度（50±15）%，12 h輪換照明。

1.3.4 樣本采集及指標(biāo)測定

各組小鼠灌胃45 d，禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量后眼球取血于真空采血管中，室溫放置1 h后，于4 ℃、3 000 r/min離心10 min分離血清[20]，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平采用比色法測定，VLDL-C、TT3、TT4、TSH水平采用ELISA法測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

取肝臟稱質(zhì)量后迅速于預(yù)冷生理鹽水中漂洗，稱取部分肝臟，按1∶9（m/V）加入磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）于冰上進(jìn)行勻漿，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清液得10%肝勻漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩０凑赵噭┖姓f明書的方法測定肝臟組織總蛋白、DIO1活力、DIO1及TRβ蛋白含量。

1.3.5 肝臟總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒方法提取肝組織R N A ， 測定260 nm/280 nm吸光度比值檢測其純度，并通過電泳觀察條帶檢測其質(zhì)量，之后按照試劑盒方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

反應(yīng)體系按照SYBR Green染料說明書操作配制，擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，10 s，退火55～60 ℃，20 s，延伸72 ℃，20 s，40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后根據(jù)熔解曲線評估引物特異性，根據(jù)擴(kuò)增Ct值計(jì)算2-△△Ct得到mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表 1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DNJ對肥胖小鼠體質(zhì)量的影響

體質(zhì)量的過度增長是肥胖的一個(gè)重要表現(xiàn)，控制體質(zhì)量在正常范圍內(nèi)能夠有效控制肥胖及肥胖相關(guān)疾病對健康的危害[21-22]。

圖 1 DNJ對肥胖小鼠體質(zhì)量的影響（n ＝10）Fig. 1 Effect of DNJ on body mass in obese mice (n = 10)

由圖1可知，肥胖對照組與DNJ各劑量組雌、雄小鼠的體質(zhì)量在灌胃前（第0天）無顯著差異（P＞0.05）且均顯著高出正常對照組體質(zhì)量20%以上（P＜0.05），表明肥胖模型造模成功。隨著灌胃進(jìn)行，從灌胃第30天起至灌胃結(jié)束高劑量組雌鼠體質(zhì)量與肥胖對照組體質(zhì)量差異顯著（P＜0.05），中、低劑量組雌鼠體質(zhì)量從第35天起至灌胃結(jié)束顯著低于肥胖對照組（P＜0.05）；對于雄鼠，DNJ高、中、低劑量組體質(zhì)量分別在灌胃第25、40天及第30天與肥胖對照組體質(zhì)量出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）且差異持續(xù)至灌胃結(jié)束。整個(gè)灌胃階段，肥胖對照組與DNJ各劑量組雌、雄鼠體質(zhì)量均顯著高于正常對照組（P＜0.05）。表明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍的DNJ能夠抑制高脂飲食引起的肥胖小鼠體質(zhì)量增加，維持體質(zhì)量穩(wěn)定，但在實(shí)驗(yàn)的時(shí)間范圍內(nèi)并不能使之恢復(fù)到正常水平。

2.2 DNJ對肥胖小鼠血脂水平的影響

表 2 DNJ對肥胖小鼠血脂水平的影響（n＝10）Table 2 Effect of DNJ on blood lipids in obese mice (n= 10)

肥胖通常伴有血脂水平的異常，這些異常與動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[23-25]。由表2可知，與正常對照組相比，肥胖對照組雌、雄鼠TC、TG水平均顯著上升（P＜0.05），表明長期高脂飲食會引起高血脂。與肥胖對照組相比，經(jīng)過45 d的DNJ干預(yù)，中、高劑量組雌鼠TC水平分別下降14.63%、16.77%（P＜0.05），雄鼠中只有高劑量組TC水平下降15.44%（P＜0.05）；低、中、高劑量組雌鼠TG水平相比肥胖對照組分別下降8.45%、13.29%、28.23%（P＜0.05），中、高劑量組雄鼠TG水平分別下降14.20%、40.35%（P＜0.05）。DNJ所有劑量組小鼠TC、TG水平仍顯著高于正常對照組（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，用實(shí)驗(yàn)劑量的DNJ干預(yù)45 d，能夠改善高脂飲食引起的TC、TG水平升高，但并不能使之恢復(fù)到正常水平。

HDL-C在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中發(fā)揮重要作用，可將膽固醇由肝外組織逆轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行代謝，防止過多的膽固醇沉積在血管壁上，起到防止動脈粥樣硬化的作用，而LDL-C則是心血管疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素之一，降低其水平能有效降低心血管疾病發(fā)病率[24]，VLDL-C除了攜帶膽固醇外還富含甘油三酯，其水平上升可能導(dǎo)致機(jī)體胰島素抵抗及動脈粥樣硬化[25]。

由表2可知，與正常對照組相比，雌、雄鼠肥胖對照組的HDL-C水平均顯著下降（P＜0.05），LDL-C及VLDL-C水平均顯著上升（P＜0.05），表明長期的高脂飲食會引起血清中脂蛋白水平異常。DNJ干預(yù)后，中劑量組雌、雄鼠和高劑量組雌、雄鼠HDL-C水平相比肥胖對照組分別上升30.21%、58.75%（P＜0.05）和31.20%、42.80%（P＜0.05）；低、中、高劑量的DNJ使雌、雄鼠LDL-C分別下降19.30%、26.40%、30.86%（P＜0.05）和8.90%、11.89%、33.33%（P＜0.05）；中劑量組雌、雄鼠和高劑量組雌、雄鼠VLDL-C水平相比肥胖對照組分別下降22.16%、31.01%（P＜0.05）和20.93%、41.18%（P＜0.05）。表明實(shí)驗(yàn)劑量DNJ干預(yù)45 d，肥胖小鼠HDL-C、LDL-C和VLDL-C水平有所改善。

綜上，長期的高脂飲食使小鼠血脂水平異常，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)劑量的DNJ干預(yù)45 d，實(shí)驗(yàn)小鼠血脂水平有不同程度的改善，表明DNJ能夠促進(jìn)機(jī)體脂代謝使血脂水平降低。

2.3 DNJ對肥胖小鼠THs功能的影響

THs能夠促進(jìn)脂肪酸氧化，降低機(jī)體脂肪積蓄及體質(zhì)量，在調(diào)節(jié)脂代謝方面發(fā)揮著重要作用。肥胖個(gè)體中THs的合成及代謝紊亂，因此改善這一紊亂狀態(tài)對于肥胖的緩解甚至治療具有重要意義[27]。

2.3.1 DNJ對肥胖小鼠TT4、TT3質(zhì)量濃度的影響

圖 2 DNJ對肥胖小鼠TT4及TT3質(zhì)量濃度的影響（n ＝10）Fig. 2 Effect of DNJ on TT4 and TT3 contents in obese mice (n = 10)

由圖2A可知，肥胖對照組雌、雄小鼠的TT4水平與正常組比較均無顯著差異（P＞0.05）。與肥胖對照組相比，低、中、高劑量的DNJ使雌、雄鼠TT4水平分別上升12.72%、16.14%、22.03%（P＜0.05）和11.95%、12.42%、15.99%（P＜0.05），均顯著高于正常對照組（P＜0.05）。

如圖2B所示，肥胖對照組雌、雄鼠TT3水平相比正常對照組顯著下降（P＜0.05）；各劑量的DNJ干預(yù)45 d后，雌鼠TT3水平相比肥胖對照組分別升高45.89%、60.22%、66.86%（P＜0.05），其中低劑量組恢復(fù)至正常水平（P＞0.05），中、高劑量組顯著高于正常對照水平（P＜0.05）；低、中、高劑量組雄鼠TT3水平較肥胖對照組分別升高16.21%、40.06%、47.79%（P＜0.05），但均未恢復(fù)至正常水平（P＜0.05）。

2.3.2 DNJ對肥胖小鼠TSH水平的影響

甲狀腺細(xì)胞與TSH結(jié)合后分泌THs，因此TSH對于維持機(jī)體THs水平的相對穩(wěn)定極為重要，其微小變動都將影響THs的分泌與合成。

圖 3 DNJ對肥胖小鼠TSH水平的影響Fig. 3 Effect of DNJ on TSH in obese mice

如圖3所示，與正常對照組相比，肥胖對照組雌、雄鼠TSH水平均顯著上升（P＜0.05）；相比肥胖對照組，低、中、高劑量的DNJ能夠使雌、雄鼠TSH水平分別降低7.15%、6.34%、9.65%（P＜0.05）和5.75%、8.91%、9.73%（P＜0.05）；所有DNJ劑量組的TSH水平仍顯著高于正常對照組（P＜0.05）。

2.3.3 DNJ對肥胖小鼠TT3/TT4比值和肝臟DIO1的影響

TT3/TT4比值可反映DIO1對T4的脫碘能力[9]，DIO1主要在肝臟、腎臟、甲狀腺和垂體表達(dá)，對于T4向T3的轉(zhuǎn)化起到十分重要的作用[29]。

圖 4 DNJ對肥胖小鼠TT3/TT4及肝臟DIO1活力、含量、mRNA相對表達(dá)量的影響Fig. 4 Effect of DNJ on TT3/TT4 ratio and liver DIO1 activity, protein level, and mRNA expression in obese mice

由圖4A可知，肥胖對照組TT3/TT4相比正常對照組顯著下降，暗示肥胖可能影響到DIO1的脫碘能力，與肥胖對照組相比，低、中、高劑量的DNJ使雌鼠TT3/TT4顯著上升（P＜0.05），且恢復(fù)至正常水平（P＞0.05），雄鼠中只有中、高劑量組TT3/TT4顯著上升（P＜0.05），但未恢復(fù)至正常水平（P＜0.05）。表明DNJ可能對DIO1的脫碘能力具有一定改善作用。

為了進(jìn)一步研究這種改善作用，對肝臟DIO1活力、蛋白水平及mRNA相對表達(dá)進(jìn)行測定，DIO1活力測定結(jié)果如圖4B所示。相比正常對照組，肥胖對照組DIO1活力均顯著下降（P＜0.05）。相比肥胖對照組，中、高劑量的DNJ能夠使雌鼠、雄鼠肝臟DIO1活力分別上升39.04%、40.99%（P＜0.05）和26.29%、24.40%（P＜0.05），但未恢復(fù)至正常水平（P＜0.05）。表明DNJ能夠改善肥胖引起的肝臟DIO1活性下降。

肝臟DIO1含量及DIO1mRNA相對表達(dá)測定結(jié)果分別如圖4C、D所示。肥胖對照組肝臟DIO1含量顯著低于正常對照組（P＜0.05），經(jīng)過中、高劑量的DNJ干預(yù)后，雌、雄鼠肝臟DIO1含量相比肥胖對照組分別上升27.09%、35.68%（P＜0.05）和20.69%、29.50%（P＜0.05），并且恢復(fù)至正常組水平（P＞0.05）；肥胖對照組肝臟DIO1mRNA相對表達(dá)量相比正常對照組顯著下調(diào)（P＜0.05），經(jīng)過DNJ干預(yù)后，相比肥胖對照組，除了低劑量組雄鼠mRNA相對表達(dá)量無顯著變化外（P＞0.05），其余各DNJ劑量組mRNA相對表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05）。表明DNJ可上調(diào)肝臟DIO1mRNA表達(dá)，促進(jìn)肝臟DIO1蛋白合成。

2.3.4 DNJ對肥胖小鼠肝臟TRβ含量的影響

肝臟是THs的主要靶器官之一，THs（主要是T3）進(jìn)入靶細(xì)胞后通過與TR結(jié)合發(fā)揮其生理作用，TR有2 種亞型，其中TRβ亞型主要在肝臟中表達(dá)[30]。

圖 5 DNJ對肥胖小鼠肝臟TRβ含量及其mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 5 Effect of DNJ on TRβ content and mRNA expression levels in liver of obese mice

如圖5 所示，肥胖對照組雌、雄鼠肝臟T R β 含量及T R βm R N A 相對表達(dá)量顯著低于正常對照組（P＜0.05），DNJ干預(yù)后，相比肥胖對照組，雌鼠中、高劑量組TRβ含量顯著上升27.45%、37.53%（P＜0.05），各DNJ劑量組TRβmRNA相對表達(dá)量均顯著上調(diào)；低、中、高劑量的DNJ使雄鼠TRβ含量分別上升21.97%、20.51%、27.81%（P＜0.05），中、高劑量組TRβmRNA相對表達(dá)量相比肥胖對照組顯著上調(diào)（P＜0.05）。表明DNJ能夠促進(jìn)肥胖小鼠肝臟TRβ蛋白表達(dá)。

2.3.5 DNJ對肥胖小鼠T3應(yīng)答脂代謝基因的影響

THs與TR結(jié)合后調(diào)控相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，由于T3被認(rèn)為是THs的主要活性形式，因此這些靶基因通常稱為T3應(yīng)答基因，已有研究表明脂肪甘油三酯脂酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1α（carnitine palmitoyltransferase 1α，CPT1α）、膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7 alpha-hydroxylase，CYP7A1）等脂代謝酶mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到T3的調(diào)控[31]。

圖 6 DNJ對肥胖小鼠肝臟ATGL、CPT1α、CYP7A1 mRNA表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of DNJ on ATGL, CPT1α and CYP7A1 mRNA expression in liver tissues of obese mice

由圖6 可知，肥胖對照組中AT G L、C P T 1 α、CYP7A1mRNA相對表達(dá)量相比正常對照組顯著下調(diào)（P＜0.05），與肥胖對照組相比，低、中、高劑量的DNJ干預(yù)均能使雌、雄鼠的ATGL、CPT1α、CYP7A1mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。

3 討 論

肥胖是一種能量失衡導(dǎo)致的慢性疾病，同時(shí)也是心血管疾病、2型糖尿病、癌癥等疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[21]。已有大量研究證實(shí)了DNJ在促進(jìn)脂代謝、緩解肥胖方面的作用，如Tsuduki等[32]以高脂飼料飼喂大鼠同時(shí)以1 mg/kgmb劑量DNJ灌胃4 周，結(jié)果表明DNJ能夠通過激活脂肪酸β氧化促進(jìn)脂代謝，降低機(jī)體脂肪積蓄。李有貴等[31]以50 mg/kgmb劑量桑葉DNJ灌胃高脂血癥模型小鼠90 d，結(jié)果表明小鼠血清TC、TG水平逐漸恢復(fù)至正常水平。在本實(shí)驗(yàn)所用DNJ劑量范圍與實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，TC、TG水平雖然有所改善但未恢復(fù)至正常水平，可能與灌胃劑量及實(shí)驗(yàn)時(shí)間長短不同有關(guān)。

圖 7 DNJ對肥胖小鼠甲狀腺激素的影響示意圖[34]Fig. 7 Schematic representation of the effect of DNJ on thyroid hormones in obese mice[34]

圖7為DNJ對THs的影響示意圖[34]，總結(jié)了DNJ對肥胖小鼠的作用機(jī)制。THs的合成與釋放受到HPT的反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)THs能夠滿足機(jī)體需要時(shí)，通過降低TSH分泌以減少THs合成，當(dāng)THs不足時(shí)則通過增加TSH分泌促進(jìn)THs合成釋放[35]。在本研究中，雌、雄肥胖對照組TSH水平顯著升高，表明肥胖個(gè)體對THs的需求增加，希望通過增加TSH水平以促進(jìn)THs合成釋放，達(dá)到促進(jìn)脂代謝的目的，但與此相矛盾的是肥胖對照組TT4水平無顯著變化，可能是長期的高脂飲食使小鼠對TSH的應(yīng)答能力受到影響，甲狀腺無法正常合成及釋放T4[36]，DNJ干預(yù)后，機(jī)體部分恢復(fù)對TSH的應(yīng)答能力，TT4水平也相應(yīng)上升。T3是THs的主要活性形式，與TR結(jié)合的能力相比T4更強(qiáng)，然而甲狀腺合成分泌的T3僅占血液循壞T3的20%，大部分T3由脫碘酶使T4脫碘產(chǎn)生，脫碘酶有3 種亞型，其中DIO1主要在肝臟、腎臟等組織表達(dá)，決定循環(huán)T3的濃度[37-38]。本研究中，TT3/TT4相比肥胖對照組顯著下降，DNJ干預(yù)后，TT3/TT4上升，推測肥胖個(gè)體DIO1對T4的轉(zhuǎn)化能力降低，DNJ的干預(yù)能夠改善DIO1的脫碘能力，進(jìn)一步對DIO1的活性、蛋白水平及mRNA相對表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明DNJ的干預(yù)能夠使DIO1活性上升、mRNA表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)T4向T3轉(zhuǎn)化。另外，郝立月[39]以高脂飲食飼喂小鼠，發(fā)現(xiàn)飼喂初期血清TT4及TT3水平上升并顯著高于正常對照，但后期均下降，TT4水平與正常對照無顯著差異，TT3顯著低于正常對照組，認(rèn)為在飼喂高脂飲食前期，機(jī)體能夠?qū)^多的能量攝入做出反應(yīng)，增加TT4及TT3水平以促進(jìn)能量消耗，這是機(jī)體的一種代償保護(hù)機(jī)制，但到后期，T4的合成以及轉(zhuǎn)化均受到影響，導(dǎo)致TT4及TT3水平下降，并且給予功能成分干預(yù)后出現(xiàn)TT4及TT3上升并且高于正常對照的現(xiàn)象。在本研究中，肥胖對照組TT4水平與正常對照組無顯著差異，TT3水平顯著低于正常對照組，與其研究結(jié)果相一致，并且DNJ干預(yù)后也出現(xiàn)TT4及TT3水平上升并顯著高于正常對照組的現(xiàn)象，DNJ的干預(yù)可能使機(jī)體這種保護(hù)機(jī)制得以部分恢復(fù)，增加TT4及TT3促進(jìn)能量消耗。另有研究表明肥胖造成的機(jī)體氧化應(yīng)激對DIO1活性造成影響，因此，DNJ對DIO1活性改善可能與其具有抗氧化性有關(guān)[28,40]。

肝臟是THs的靶器官之一，在肝臟中THs（主要是T3）通過TRβ發(fā)揮作用，TRβ與維甲酸X受體（retinoid X receptor，RXR）形成二聚體并與T3應(yīng)答基因啟動子上的THs應(yīng)答反應(yīng)元件（thyroid hormone response element，TRE）結(jié)合，當(dāng)T3進(jìn)入細(xì)胞與TRβ結(jié)合形成T3-TRβ-TRE復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)對脂代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[41]。ATGL是甘油三酯分解為甘油二酯的關(guān)鍵酶之一，CPT1α是脂肪酸β氧化的限速酶，而CYP7A1則是膽固醇代謝過程中的限速酶，主要作用是使膽固醇分解為膽酸，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明DNJ的干預(yù)能夠使ATGL、CPT1α、CYP7A1mRNA表達(dá)上調(diào)，已有研究表明ATGL、CPT1α、CYP7A1 3 種酶的基因啟動子區(qū)域均存在TRE，mRNA的表達(dá)受到T3的調(diào)控[31,42-43]，因此，DNJ對于ATGL、CPT1α、CYP7A1mRNA表達(dá)的上調(diào)與其對THs功能的改善作用有關(guān)。

此外，功能成分的效果也可能因性別不同而產(chǎn)生差異。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)立雙性別小鼠觀察DNJ的降脂作用及對THs的改善作用是否存在性別差異。對于THs，中、高劑量的DNJ使雌鼠TT3顯著上升并高于正常對照組，各劑量組的雄鼠TT3雖然上升卻未恢復(fù)至正常水平；另一方面，低劑量組雄鼠TRβ蛋白水平得到顯著改善，而雌鼠則需要中劑量的DNJ才可使TRβ蛋白水平顯著改善。Li Yougui等[44]的研究表明DNJ對高脂飲食雌性小鼠TC水平的改善作用優(yōu)于雄性小鼠，本研究中，中劑量的DNJ便能使雌鼠TC顯著下降，而雄鼠中只有高劑量DNJ才有效果，表明DNJ對雌鼠TC的改善作用較好，與Li Yougui等[44]的研究結(jié)果相一致。造成這些差異的原因有待進(jìn)一步研究，同時(shí)這些差異也暗示對不同性別對象使用DNJ時(shí)，應(yīng)充分考慮性別不同造成的影響，對使用劑量進(jìn)行合適的調(diào)整。

綜上所述，DNJ能夠改善機(jī)體對TSH的應(yīng)答及脫碘酶活性，上調(diào)DIO1和TRβmRNA表達(dá)來改善肥胖造成的THs功能紊亂，進(jìn)一步靶向調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而改善血脂水平，抑制體質(zhì)量增加。