細(xì)葉小檗果小檗堿抑菌性能及機(jī)理

包怡紅，張俊順，符 群，張海婷

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

細(xì)葉小檗（Berberis poiretii）為小檗科小檗屬漿果，別名針雀、三顆針等。小檗屬是小檗科中大屬之一，植物多為常綠或落葉灌木，很少為喬木。本屬約有植物500余種，主要分布于亞洲東部、中部以及拉丁美洲，少數(shù)分布于歐洲、北美洲和非洲北部。我國小檗屬植物資源豐富，有250余種，約占世界的一半，全國各地均有分布，主要分布在西南、西北地區(qū)[1]。小檗屬果實(shí)主要含有甾醇、萜類化合物、花青素、酚酸類化合物，還有生物堿、有機(jī)酸、微量元素等物質(zhì)[2]。細(xì)葉小檗含有的生物堿有小檗堿、小檗胺、巴馬汀、哥倫胺和苦參堿[3-4]，其中小檗堿含量高并且具有較強(qiáng)的生物活性[5-6]，如消炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血壓、保護(hù)心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等[7-11]。

近年來，隨著對小檗堿活性成分及藥理作用的研究深入，細(xì)葉小檗在臨床方面獲得廣泛的應(yīng)用，傳統(tǒng)和現(xiàn)代研究大多集中在小檗屬植物的根、莖以及莖皮部位，然而該屬果實(shí)在研究利用方面有著巨大開發(fā)潛力[12]，劉萍[13]、徐媛[14]、符群[15]等對細(xì)葉小檗果實(shí)中小檗堿的提取工藝與抑菌活性進(jìn)行研究，但對其抑菌機(jī)理的研究很少，基于此，本實(shí)驗(yàn)將對小檗堿在抑菌機(jī)理方面進(jìn)行補(bǔ)充。

如今，食源性病菌引起的食物污染嚴(yán)重威脅著人們的健康，食品腐敗變質(zhì)現(xiàn)象普遍存在，因此抑制食源性腐敗菌的生長以延長食品貨架期變得尤為重要，本實(shí)驗(yàn)主要研究了細(xì)葉小檗果實(shí)中的小檗堿對食品中常見的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌4 種供試菌的抑菌活性，并對抑菌機(jī)理進(jìn)行了初步的探究，為其在天然食品防腐劑中的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

細(xì)葉小檗果實(shí)采于黑龍江省鶴崗市。

供試菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、沙門氏菌（Salmonella）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

Y 3 1 J 9 H 6 7 0 2 4 小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞9 8%）上海源葉生物科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨、MH（B）培養(yǎng)基、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、戊二醛、叔丁醇、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨、四甲基乙二胺、巰基乙醇、溴酚藍(lán)、甘油、甘氨酸（均為分析純）天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；HZQ-F恒溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；FD-1A-80冷凍干燥機(jī)上海比朗儀器有限公司；BCD-215KS冰箱 青島海爾股份有限公司；TGL-16G臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DDS-307電導(dǎo)率儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Spetramax 2e全波長酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；UV-5500紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小檗堿含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取5 mg小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解并定容于50 mL的容量瓶中。準(zhǔn)確吸取1、2、3、4、5 mL于50 mL容量瓶中，無水乙醇定容。在345 nm波長處測量吸光度[16]，以小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝0.032 7x+0.126 1（R2＝0.999 6）。

1.3.2 小檗堿的提取

將細(xì)葉小檗的果實(shí)在烘箱中干燥至恒質(zhì)量，用高速粉碎機(jī)粉碎，過100 目篩，得到細(xì)葉小檗果實(shí)粉末，稱取10 g粉末，按照液料比32∶1加入體積分?jǐn)?shù)27%的乙醇溶液，分裝至燒杯中，調(diào)節(jié)pH值依次為2.2、7.6和8.5，在功率為300 W的超聲波中分別提取50、25 min和25 min，而后抽濾得到小檗堿提取液，將小檗堿提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮，在345 nm波長處測定濃縮后提取液的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算小檗堿的質(zhì)量濃度。

1.3.3 抑菌性能的測定

1.3.3.1 抑菌活性的測定

采用濾紙片法測定小檗堿對4 種細(xì)菌的抑菌活性，參照樊梓鸞等[17]的方法，用打孔器制得直徑為6 mm的濾紙片，高溫滅菌備用。在無菌條件下，將培養(yǎng)基倒入無菌平板，冷卻凝固，取100 μL菌懸液于培養(yǎng)基上涂布均勻，取4 片滅菌后的濾紙片（直徑6 mm）置于含菌平板上，其中3 片滴加10 μL質(zhì)量濃度為4.10 mg/mL的小檗堿，另外一片以10 μL無菌水作為對照，細(xì)菌置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用交叉法測得抑菌圈的直徑大小。

1.3.3.2 最低抑菌濃度的測定

試管滅菌、編號，用二倍稀釋法將提取液稀釋，配制8 個梯度濃度，小檗堿的質(zhì)量濃度分別為0.039、0.078、0.156、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000 mg/mL，分別編號為1～8。96 孔板滅菌后，向每個孔內(nèi)滴加20 μL（107CFU/mL）菌液，90 μL液體培養(yǎng)基，90 μL不同梯度濃度的提取液。以無菌水為對照，37 ℃培養(yǎng)12 h，每孔取100 μL涂布平板，培養(yǎng)12 h，觀察4 種細(xì)菌的生長情況，以第一個出現(xiàn)單菌落平板的樣品濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[18]。

1.3.4 生長曲線的測定

參考Liu Guorong等[19]的方法并略作修改。將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的濃度稀釋為1×107CFU/mL后，加入質(zhì)量濃度為一倍MIC（1 MIC）的小檗堿，對照組不加入小檗堿，向96 孔板中加入20 μL 4 種供試菌懸液，放置于37 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱，培養(yǎng)期間每隔2 h取樣，用酶標(biāo)儀在660 nm波長處測定吸光度。

1.3.5 抑菌機(jī)理分析

1.3.5.1 菌體形態(tài)的觀察

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并稀釋菌液為107CFU/mL。各取3 mL菌液加入1 MIC小檗堿，對照組不加入小檗堿，在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)4 h后，5 000 r/min、15 min離心收集菌體，磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0，下同）清洗3 次，加入戊二醛溶液，于4 ℃環(huán)境下放置4 h進(jìn)行固定。依次使用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液和無水乙醇進(jìn)行脫水。-40 ℃下真空冷凍干燥24 h后，離子噴金，隨后進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察[20]。

1.3.5.2 電導(dǎo)率的測定

將供試菌種接種于滅菌的液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL），5 000 r/min離心15 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液清洗3 次，離心，重懸于磷酸鹽緩沖液中，加入各菌種1 MIC的小檗堿，對照組用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行校正，放于37 ℃搖床中培養(yǎng)6 h，每隔1 h取出測電導(dǎo)率[21]。

1.3.5.3 核酸含量的測定

分別將供試菌種接種至100 mL的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取10 mL菌液，5 000 r/min離心15 min收集菌體，磷酸鹽緩沖溶液沖洗3 次，重新定容至10 mL，加入1 MIC的小檗堿，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 h。3 h后取3 mL樣品溶液于離心管中，5 000 r/min離心5 min，取其上清液在260 nm波長處測定吸光度[22]，對照組用磷酸緩沖溶液進(jìn)行校正。

1.3.5.4 小檗堿對細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的影響

將1 M I C 的小檗堿加入到培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的4 種供試菌的菌懸液中，對照組用磷酸緩沖溶液進(jìn)行校正，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖溶液清洗3 次，加入20 μL上樣緩沖溶液，沸水浴5 min，離心取上清液，根據(jù)電泳樣品制備步驟進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳[23]。

1.3.5.5 細(xì)胞膜Na+/K+-ATP酶活力的測定

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌接種于滅菌的液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL），離心，棄上清液，用磷酸鹽緩沖溶液清洗3 次，制成菌懸液，加入1 MIC的小檗堿，對照組用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行校正，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)6 h，8 000 r/min離心15 min，磷酸鹽緩沖溶液清洗3 次，超聲破碎細(xì)胞（破碎條件：工作5 s、間歇15 s、共10 min，功率400 W），采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。用ATP酶試劑盒測定4 種供試菌中Na+/K+-ATP酶的活力，每個樣品3 次平行[24]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010與SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，Duncan’s多重比較分析檢驗(yàn)顯著性，以P＜0.05表示差異顯著，數(shù)據(jù)處理結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗堿的抑菌性能

2.1.1 小檗堿的抑菌活性及MIC

小檗堿質(zhì)量濃度為4.10 mg/mL時，測定其對4 種供試菌的抑菌活性，以無菌水作對照，如表1所示。對照組無抑菌圈出現(xiàn)，加入小檗堿的實(shí)驗(yàn)組均有抑菌圈出現(xiàn)，說明小檗堿對4 種供試菌均有抑制作用。大腸桿菌的MIC最小，為2.40 mg/mL，并且小檗堿對大腸桿菌的抑菌圈直徑最大，為（11.60±0.11）mm，依次是金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞沙門氏菌?？傮w來看，小檗堿對大腸桿菌的抑菌效果更好，原因可能是大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，而革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁較厚，結(jié)構(gòu)較為致密，阻礙了小檗堿的進(jìn)入。

表 1 小檗堿對4 種供試菌種的抑菌活性及MICTable 1 MICs and antimicrobial activities of berberine against 4 tested microbes

2.1.2 小檗堿對4 種供試菌生長曲線的影響

從圖1可以看出，對照組供試菌的生長曲線均為典型的S型，細(xì)菌生長穩(wěn)定，均有對數(shù)生長期和穩(wěn)定生長期。而加入1 MIC的小檗堿后，實(shí)驗(yàn)組的4 種供試菌的生長速率均明顯降低，延滯期明顯延長，對數(shù)生長期延后，枯草芽孢桿菌無明顯對數(shù)生長期，而金黃色葡萄球菌對數(shù)生長期延后約8 h；最大生物量與對照組相比也明顯降低，基本在16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，生長曲線趨于平緩甚至有所下降。由此可見小檗堿對4 種供試菌的生長繁殖均有抑制作用，延緩其生長期，降低最高生物量，在穩(wěn)定期也可抑制生長甚至導(dǎo)致衰亡期提前。

圖 1 小檗堿對4 種供試菌生長曲線的影響Fig. 1 Effect of berberine on growth curves of 4 tested bacteria

2.2 小檗堿的抑菌機(jī)理

2.2.1 小檗堿對菌體形態(tài)的影響

圖 2 小檗堿對4 種供試菌菌體形態(tài)的影響Fig. 2 Effect of berberine on cell morphology of 4 tested bacteria

由圖2可知，未添加小檗堿的4 種供試菌的菌體完整，細(xì)胞膜表面有輕微皺縮，比加入小檗堿的菌體更為圓潤飽滿，細(xì)胞膜完整，沒有破裂。當(dāng)加入1 MIC的小檗堿時，4 種供試菌的菌體產(chǎn)生較大程度的皺縮，菌體扭曲變形，細(xì)胞膜褶皺，大腸桿菌和金黃色葡萄菌菌體細(xì)胞膜明顯破裂，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外泄，菌體裂解死亡[25]。說明小檗堿作用于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌菌體受損，結(jié)構(gòu)不完整從而發(fā)揮抑菌作用。

2.2.2 小檗堿對菌懸液電導(dǎo)率的影響

由圖3可以看出，對照組電導(dǎo)率增長平緩，有輕微的增長趨勢，是由于菌體細(xì)胞的自然衰亡與溶解[26]；加入小檗堿后4 種供試菌菌懸液的電導(dǎo)率開始增大，明顯高于對照組，電導(dǎo)率反映了小檗堿對菌體細(xì)胞膜通透性的影響。K+、Na+、H+等可以通過菌體細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，這些離子在維持細(xì)胞膜電位以及菌體細(xì)胞的正常代謝等方面有著重要作用，從而保障細(xì)胞的正常功能[27]。而小檗堿能使菌體細(xì)胞破裂，使菌體細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外泄，菌體代謝無法進(jìn)行，最終導(dǎo)致菌體死亡。

圖 3 小檗堿對4 種菌電導(dǎo)率的影響Fig. 3 Effect of berberine on conductivity of 4 test bacteria

2.2.3 小檗堿對受試菌核酸溶出的影響

圖 4 小檗堿對4 種菌核酸溶出的影響Fig. 4 Effect of berberine on nucleic acid release from 4 test bacteria

如圖4所示，加入1 MIC小檗堿的實(shí)驗(yàn)組菌種在260 nm波長處的吸光度與對照組相比均明顯增加。表明菌體中核酸的釋放量增大，小檗堿破壞了細(xì)胞膜的完整性，核酸等大分子物質(zhì)外泄，導(dǎo)致細(xì)胞代謝受損，細(xì)胞失去保護(hù)，最終菌體死亡[28]，這與掃描電子顯微鏡所示的細(xì)胞受損破裂及菌懸液電導(dǎo)率升高的結(jié)果一致。

2.2.4 小檗堿對菌體蛋白合成的影響

圖 5 小檗堿對菌體蛋白合成的影響Fig. 5 Effect of berberine on bacterial protein synthesis

如圖5所示，加入小檗堿的實(shí)驗(yàn)組與未加入小檗堿的對照組條帶有顯著差異。4 個對照組的條帶數(shù)量比實(shí)驗(yàn)組多，并且清晰明顯。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的金黃色葡萄球菌條帶在44.3 kDa處的條帶明顯變淺；大腸桿菌在116、66.4 kDa和44.3 kDa處的條帶消失且條帶數(shù)量均減少；沙門氏菌在44.3 kDa與200 kDa之間的條帶變淺；枯草芽孢桿菌在44.3 kDa附近處的條帶變淺、較不明顯。說明小檗堿抑制了4 種供試菌細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)，對蛋白的合成具有一定的抑制作用。

2.2.5 小檗堿對細(xì)胞膜Na+/K+-ATP酶活力的影響

圖 6 小檗堿對4 種菌NaTP酶活力的影響Fig. 6 Effect of berberine on cell membrane Na+/K+-ATPase activity of 4 test bacteria

如圖6所示，加入1 MIC小檗堿的4 種供試菌的Na+/K+-ATP酶活力與對照組相比明顯降低。沙門氏菌與金黃色葡萄球菌Na+/K+-ATP酶活力下降幅度較小，1 MIC小檗堿對枯草芽孢桿菌的Na+/K+-ATP酶活力抑制效果最好，Na+/K+-ATP酶活力由（35.00±1.80）U/mg降至（4.50±0.19）U/mg。原因可能是小檗堿對蛋白有抑制作用，進(jìn)而抑制了酶的活力，因此小檗堿對Na+/K+-ATP酶活力具有抑制作用[29]。

3 結(jié) 論

食品防腐劑是應(yīng)用于食品工業(yè)的重要食品添加劑，主要分為天然防腐劑和化學(xué)合成防腐劑，現(xiàn)階段主要以化學(xué)合成防腐劑為主，其對人體健康具有潛在的危害性，因而天然食品防腐劑越來越受到人們的重視[30]。細(xì)葉小檗果中的小檗堿作為一種天然抑菌物質(zhì)，可以抑制食品中常見的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌以及枯草芽孢桿菌。由本實(shí)驗(yàn)可知，小檗堿對這4 種供試菌均有抑菌圈出現(xiàn)，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌以及枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為（10.20±0.14）、（11.60±0.11）、（9.80±0.14）mm和（10.10±0.18）mm，MIC分別為3.30、2.40、3.95 mg/mL和3.60 mg/mL，對大腸桿菌的抑菌直徑最大并且具有最小的MIC，表明小檗堿對大腸桿菌的抑菌效果更好。小檗堿處理后的細(xì)菌生長曲線較平緩，對數(shù)生長期延后，阻礙了細(xì)菌的正常生長繁殖。小檗堿破壞菌體的形態(tài)，使菌體細(xì)胞破裂，胞內(nèi)離子外流。同時，小檗堿能干擾菌體內(nèi)蛋白的合成，抑制細(xì)胞膜Na+/K+-ATP酶的活力，影響菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的積累，酶的功能受損，使其無法進(jìn)行正常代謝，最終導(dǎo)致細(xì)菌衰亡。此外，有研究表明，一些抑菌劑如百里香酚、氯氰菊酯和氟尿嘧啶，可以與DNA結(jié)合，并可能誘導(dǎo)DNA二級結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化[31]。黎芳靖[32]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能影響植物水稻細(xì)菌性條斑病菌的能量代謝，基于這些研究結(jié)果，今后有待開展小檗堿對DNA及能量代謝等方面的研究。