深度測序鑒定玉米雄穗花器官分化期響應(yīng)干旱脅迫的miRNA和其靶基因

王業(yè)建，梁曉玲，阿布來提·阿布拉，韓登旭，楊 杰，郗浩江，劉 俊，李銘東

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所， 烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】干旱能抑制植物的生長和發(fā)育，并導(dǎo)致植物的品質(zhì)和產(chǎn)量下降。了解植物對非生物脅迫的反應(yīng)對提高作物生產(chǎn)力有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在長期的進(jìn)化過程中，植物已經(jīng)開發(fā)出一系列調(diào)節(jié)機制，以應(yīng)對不同層面的這些不利條件，包括細(xì)胞、生理、生物化學(xué)和分子過程[1-2]。已確定植物中激素介導(dǎo)的信號交叉參與對干旱和鹽脅迫的反應(yīng)，如脫落酸(ABA)、水楊酸和乙烯?；虮磉_(dá)調(diào)控是植物在轉(zhuǎn)錄后水平對抗干旱的關(guān)鍵策略[3-4]。基因表達(dá)調(diào)控最重要的參與者之一是microRNA(miRNA)。miRNA是一種長度約為21個核苷酸的非編碼小RNA分子。研究表明，miRNA具有與其靶mRNA的完美或接近完美的互補核苷酸結(jié)合的特點，通過mRNA切割或通過翻譯抑制負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[5]。除了miRNA在發(fā)育和代謝中的作用外，miRNA還參與非生物和生物應(yīng)激反應(yīng)。例如，miR394是一種保守的miRNA，已在一系列植物物種中發(fā)現(xiàn)，如擬南芥、水稻、棉花、柳枝稷和甘藍(lán)型油菜[6-7]。目前，有多達(dá)40個與非生物脅迫相關(guān)的植物miRNA家族，其中多種與干旱脅迫反應(yīng)有關(guān)[8]。玉米(Zeamays)基因組中miRNA的表征和分析取得了重大進(jìn)展[9-10]。雖然玉米是一種相對耐旱和耐鹽的作物，但玉米高鹽度和過度缺水可導(dǎo)致一系列代謝紊亂，包括滲透作用(脫水)，營養(yǎng)不平衡和離子毒性，都會產(chǎn)生極大的負(fù)面影響[11]?；谵D(zhuǎn)錄組和轉(zhuǎn)基因分析，已顯示大量基因在玉米或其他物種中響應(yīng)鹽度和干旱脅迫而顯示出持久的表達(dá)。例如，轉(zhuǎn)基因擬南芥中玉米CBL相互作用蛋白激酶基因(GhCIPK6)的過表達(dá)導(dǎo)致對鹽，干旱和ABA脅迫的耐受性提高，GlyCIP6可能是對抗玉米中鹽和干旱脅迫的正向調(diào)節(jié)因子[12]。轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)玉米C群絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)基因(GhMPK2)具有較低的水分損失率，表現(xiàn)出對鹽和干旱的耐受性增強，GhMPK2可能正向調(diào)節(jié)煙草和玉米的鹽和耐旱性[13]?；谖㈥嚵械霓D(zhuǎn)錄組分析揭示了玉米中某些鹽/干旱介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中許多候選基因表達(dá)差異，可能是耐受干旱脅迫的潛在標(biāo)記，如WRKY，ERF，跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，丙酮酸脫羧酶和蔗糖合成酶等[14]?！颈狙芯壳腥朦c】與親本相比，近交親本系的F1自交后代表現(xiàn)出優(yōu)越的性能和脅迫耐受性[15-17]。這種效應(yīng)被稱為雜種優(yōu)勢，在植物育種中被廣泛利用。研究運用現(xiàn)代分子生物學(xué)及高通量測序技術(shù)，測序鑒定玉米雄穗花器官分化期響應(yīng)干旱脅迫的miRNA及其靶基因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過miRNA測序，篩選出耐旱自交系“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”之間，以及PHBA6干旱脅迫和對照處理之間差異表達(dá)的miRNA，挖掘調(diào)控耐旱自交系“PHBA6”雄穗花器官分化期干旱適應(yīng)性的miRNA。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料為耐旱自交“PHBA6”(PHZ51×PHG47)和干旱敏感自交系“吉63”[(127-32×鐵84)(W24×W20)輻)] , 由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供。

材料于2017年在新疆農(nóng)科院海南三亞科技示范園基地大棚分期播種，前期進(jìn)行正常的滴灌澆水處理，2個自交系的雄穗處于花器官分花期時進(jìn)行干旱脅迫處理，耐旱種質(zhì)“PHBA6”進(jìn)行正常滴灌澆水處理作為對照，干旱處理15 d后，分別取干旱處理的“PHBA6”和“吉63”的雄穗(分別命名為PDST15和JDST15)，以及對照處理的“PHBA6”的雄穗(命名為PNTT15)，迅速包好放入液氮中, 于-80℃保存。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及質(zhì)量控制

分別合并來自6個對照和PEG處理的玉米雄穗，使用miRNA Mini Kit(Qiagen)分離小RNA。 使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent)測試RNA樣品的質(zhì)量和濃度。 將小RNA與3'和5'適配子連接，并使用TruSeq TM Small RNAkit(Illumina)根據(jù)說明書進(jìn)行RT-PCR。 從凝膠中分離預(yù)期的最終PCR產(chǎn)物，純化并使用Hiseq2000測序儀(Illumina)測序。sRNA測序和基本生物信息學(xué)分析分別在MAGrogen(韓國)和LC Sciences(Texas, USA)上進(jìn)行。

1.2.2 文庫制備和miRNA測序

用SolexaQA軟件包(Solexa)計算質(zhì)量統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用Illumina HiSeq 2500儀器進(jìn)行深度測序得到50 bp 的單端測序讀數(shù)(reads)。來自4個庫中每個庫的生成數(shù)據(jù)文件用于后續(xù)分析。從miRNA讀數(shù)中去除適應(yīng)序列后，建立小RNA的總讀數(shù)和獨特讀數(shù)。 從讀數(shù)中，映射到rRNA，tRNA，snoRNA和snRNA的小RNA被丟棄，剩余的讀數(shù)被映射到玉米基因組和轉(zhuǎn)錄本中。這些基因組合轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)可使用Bowtie軟件在美國國家醫(yī)學(xué)圖書館(NLM)的Genbank(http://ftp.ncbi.nlm. nih.gov)和法國的膜生物學(xué)國家重點實驗室獲得(http://www.biomemb. cnrs.fr/ date_ contigs.doc)。為了使用Bowtie進(jìn)行對齊，需要去除缺乏3’的序列、5’污染的序列和小于18個核苷酸的序列。

1.2.3 保守和新miRNA的預(yù)測

為了鑒定保守的miRNA，使用Bowtie v 0.12.7將sRNA與NCBI中發(fā)表在miRBase 20.0(http：/ / www.miRBase.org)植物成熟miRNA比對。具有完整匹配序列的miRNA被認(rèn)為是保守序列。具有1～3個錯配的miRNA被認(rèn)為是miRNA變體，并且與miiRNA數(shù)據(jù)庫中沒有相似性的miRNA被認(rèn)為是新的miRNA。 在該研究中鑒定的miRNA前體序列的長度范圍為57～264 bp。 使用UAEsmall RNA workbench軟件驗證了二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成和推定的新miRNA序列在相應(yīng)前體上的比對。

1.2.4 miRNA表達(dá)分析比較和功能

按照先前描述的方法，用miRNA Read/Clear×Total Read Count來進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理，即計算每個miRNA中的序列計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化。文庫大小參數(shù)被認(rèn)為是特定樣本和偽參考樣本的比率之間的中值。在去除了文庫中未顯示讀數(shù)的miRNA序列后，在文庫中技術(shù)miRNA獨特序列。使用數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)軟件(degseq包)進(jìn)行差異表達(dá)分析。將變異的生物系數(shù)(BCV)值設(shè)定為0.2。如果多個測試校正的P值并且錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05，則預(yù)測樣品池間miRNA表達(dá)是差異顯著的。使用PermutMatrix軟件和KOBAS軟件進(jìn)行層次聚類分析和KEGG 通路的富集分析。

1.2.5 miRNA靶基因的計算預(yù)測

使用psRNAtarget軟件在RNA-seq重疊群上搜索miRNA來完成對從4個文庫測序的保守的，變體和新的miRNA的靶基因的預(yù)測。參數(shù)設(shè)置為：最大期望值(ME)為3，完成度評分(hspsize)為20，目標(biāo)位點周圍的側(cè)翼長度(上游17 bp、下游13 bp和中心錯配區(qū)9～11 nt的翻譯抑制為靶基因可分析范圍。

注釋潛在的mRNA靶標(biāo)，并使用blast2GO v2.3.5軟件注釋功能，基于推斷的蛋白質(zhì)相似性，使用BLASTx在Swiss-Prot / Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得的其他序列和保守結(jié)構(gòu)域。每個序列被注釋一個基因本體(GO)或更的細(xì)胞組分，分子功能和生物過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)對比

研究表明，分別從JDST15、PDST15和PNTT15的miRNA文庫中獲得12133269、14669833和1009941 reads。去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，共剩下9632540、550036和6868703條有效讀取(valid reads)被用miRNA比對鑒定與預(yù)測分析。樣本中測序序列的分布概況，其中一些低比重占有率的大片段序列，例如rRNA或mRNA，樣本的總RNA質(zhì)量較高未被降解。3個文庫都顯示出與其他RNA家族相似的分布，包括rRNA(Uniq～1.34%)，sn RNA(Uniq～0.02%)，snoRNA(Uniq～0.01%)和tRNA(Uniq～0.13%)。表1

選取Rfam數(shù)據(jù)庫來注釋測序得到的小RNA序列，盡可能地發(fā)現(xiàn)并去除其中可能的rRNA、 scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA等非miRNA序列。分別對總的測序數(shù)據(jù)(總數(shù))以及Unique數(shù)據(jù)(種數(shù))進(jìn)行了統(tǒng)計。選取Rfam數(shù)據(jù)庫來注釋測序得到的小RNA序列，盡可能地發(fā)現(xiàn)并去除其中可能的rRNA、 scRNA、 snoRNA、 snRNA、tRNA等非miRNA序列。分別對總的測序數(shù)據(jù)(總數(shù))以及Unique數(shù)據(jù)(種數(shù))進(jìn)行了統(tǒng)計。PNTT15組特異性rRNA、tRNA、snoRNA和snRNA所占比例分別為：54.50%、26.74%、6.39%和6.62%；PDST15組分別為為42.09%、26.09%、18.43%和10.97；JDST15組分別為53.12%、24.49%、15.58%和7.50%。圖1

圖1 Rfam數(shù)據(jù)比對Fig.1 Rfam data comparison results

2.2 Valid小RNA長度分布

研究表明，統(tǒng)計過濾后的Valid數(shù)據(jù)的總數(shù)及種數(shù)長度，大部分?jǐn)?shù)據(jù)分布在20～24 nt，符合Dicer 酶切割的典型特征。圖2

圖2 Valid數(shù)據(jù)長度分布統(tǒng)計Fig.2 Valid data length distribution statistics

2.3 PDST15 vs PNTT15和JDST15 vs PDST15差異miRNA的檢出和發(fā)現(xiàn)

研究表明，在玉米中已經(jīng)報道的前體miRNA檢出176個。其中在JDST15、PDST15和PNTT15組中分別檢出160、151和145個。成熟體miRNA檢出199個在3組中分別檢出156、159和146個。在JDST15、PDST15和PNTT15組分別新發(fā)現(xiàn)前體miRNA 83、81和50個，成熟體miRNA7、76和42個。

根據(jù)miRBase(Release 20)(Kozomara和Griffiths-Jones，2011)中所有已知植物miRNA的3個文庫的所有清潔讀數(shù)的比對發(fā)現(xiàn)，miRNA在物種間高度保守，共有709個已知植物miRNA家族。這些miRNA家族占總獨特讀數(shù)序列的約0.47%和平均總?cè)哂嚅喿x序列的23.59%。在這些miRNA家族中，71個miRNA在2個不同物種中響應(yīng)干旱有特異型。47個miRNA家族僅在PHBA6自交系對照處理中發(fā)現(xiàn)。例如，miR1868和miR2099分別僅在干旱處理的樣品中表達(dá)。干旱處理的文庫共享65個miRNA家族，這些家族沒有出現(xiàn)在對照組文庫中。在3個文庫中共鑒定出709個miRNA家族中的357個，表明在維持正常生物活性中的關(guān)鍵作用，例如miR156 / 157、miR159、miR168和miR172。所有3個文庫都存在相似的最常見miRNA家族，包括miR156，miR157、miR166、miR167和miR3954。 Pearsonχ2檢驗顯示，709個(79.69%)miRNA家族中有565個在3個文庫中差異表達(dá)(P值≤0.05)。共有443個(61.37%)miRNA家族在三種處理的成對比較中表現(xiàn)出顯著差異，包括miR157，miR159，miR2948和miR3694。 miR1854和miR1148在對照與干旱和鹽與干旱之間具有最大的倍數(shù)變化，高達(dá)≥10倍，干旱脅迫強烈抑制其表達(dá)。表1～3

表1 3個文庫中總miRNA標(biāo)簽分類Table 1 The classification of total small RNA tags in 3 library

2.4 miRNA靶基因預(yù)測和富集性

研究表明，共預(yù)測到4 658個基因，利用Fisher 精確假設(shè)檢驗對差異miRNA進(jìn)行分析，得出miRNA和基因富集的KEGG通路和GO信號通路。在PDST15 vs PNTT15組中這些基因主要參與生物學(xué)過程中的蛋白磷酸化，轉(zhuǎn)錄本的調(diào)節(jié)，ARF蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控；細(xì)胞組成中的維持細(xì)胞膜和核完整性；分子過程中的蛋白結(jié)合，ATP結(jié)合。在JDST15 vs PDST15組中，差異基因參與的生物學(xué)過程主要為：轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，脂肪酸生物合成過程和蛋白磷酸化；細(xì)胞組成中的維持細(xì)胞膜和核完整性；分子過程中的蛋白結(jié)合，ATP結(jié)合以及DNA結(jié)合。

差異表達(dá)miRNAs靶向基因富集的通路主要為：碳水化合物形成，脂質(zhì)形成，氨基酸代謝產(chǎn)物，輔助因子和維生素生成，其他次生代謝的生物合成，聚糖生物合成和環(huán)境適應(yīng)等。圖3～5

注：PHBA6干旱脅迫和對照前50種最豐富的保守miRNA(左)，不同品種玉米干旱脅迫后前50種最豐富的保守miRNA的熱圖。紅色，上調(diào); 綠色，下調(diào)

圖4 通過差異表達(dá)的miRNAs預(yù)測的靶基因注釋的部分基因GOFig.4 GO analysis of partial genes annotated by target genes predicted by differentially expressed miRNAs

圖5 預(yù)測差異表達(dá)miRNAs靶向的前10個途徑Fig.5 Top 10 pathways for predicting differentially expressed miRNAs

3 討 論

在干旱脅迫下，許多保守的和新的miRNA表達(dá)存在差異；一些miRNA甚至在干旱處理中特異性表達(dá)。在3個文庫中獲得了大量的miRNA讀數(shù)，同時在3個文庫中觀察到冗余讀數(shù)，獨特讀數(shù)和匹配的獨特讀數(shù)的類似大小分布，其中長度為24個核苷酸的讀數(shù)占大多數(shù)。匹配的冗余讀數(shù)在21個核苷酸類中具有最多的讀數(shù)，其次是24個核苷酸。玉米中的小RNA豐度和大小與擬南芥[18]和水稻[19]中報道的結(jié)果大致一致。

在所有3種處理中，miR156/157家族是最豐富的小RNA，占總小RNA含量的60%。與對照相比，miR156和miR157在干旱處理中分別下調(diào)0.44和1.23倍。據(jù)報道，玉米根和葉中的miR156和miR157均在高濃度鹽(> 2.5%)下表達(dá)量均下降，并且隨著PEG的增加以劑量依賴性方式下調(diào)。目前的在干旱脅迫下雄穗中的結(jié)果也與前人報道基本一致。研究表明，miR156 / 157在植物中負(fù)向地靶向SPL轉(zhuǎn)錄因子，并且miR156 / 157過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥中成年性狀和開花的延遲[20]。miR156(Corngrass1，Cg1)的過量產(chǎn)生導(dǎo)致玉米幼年營養(yǎng)期的延長。目前關(guān)于miR156 / 157的研究主要集中在其在形態(tài)變化和開花調(diào)控中的作用[21]。研究中，小RNA測序提供了干旱脅迫干擾miR156 / 157表達(dá)的證據(jù)，miR156 / 157在干旱脅迫下的新作用。

大豆中NF-Y復(fù)合物的NF-YA(GmNFYA3)可被ABA和非生物脅迫誘導(dǎo)，包括干旱，NaCl和冷刺激[22]。擬南芥中GmNFYA3的過量表達(dá)導(dǎo)致葉片水分流失減少和干旱脅迫增加，并提高其對高鹽度和外源ABA的敏感性。煙草中的體內(nèi)試驗顯示miR169指導(dǎo)GmNFYA3 mRNA切割[23]。在玉米中，預(yù)測NF-YA3(contig16841和contig22907)是ghr-miR169的靶標(biāo)。此外，與對照相比，干旱和處理中的ghr-miR169a / b / c表達(dá)顯著下調(diào)0.04至0.93倍。相反，ghr-miR169d / e / f / g在干旱處理中顯著上調(diào)0.04～0.85倍。Ghr-miR169i / j表達(dá)在干旱處理中受到抑制。推測至少ghr-miR169a / b / c可能通過作用于玉米中的NF-YA3而在抗旱中發(fā)揮積極作用。

植物水通道蛋白是大型主要內(nèi)在蛋白家族的一類，眾所周知，通過不同的小分子(包括水和其他小營養(yǎng)素)的生物膜發(fā)揮作用[24]。除了在水和養(yǎng)分的吸收和運輸中的作用外，還發(fā)現(xiàn)水通道蛋白涉及一系列非生物脅迫，例如干旱和冷脅迫。例如，轉(zhuǎn)基因煙草中質(zhì)膜水溶蛋白的過表達(dá)在有利的生長條件下提高了植物活力，但在干旱或鹽脅迫下沒有，因為通過質(zhì)膜水通道蛋白的共轉(zhuǎn)運水在干旱或鹽脅迫期間具有有害作用[25]。已發(fā)現(xiàn)從玫瑰中分離出的TIP型水通道蛋白基因Rh-TIP1受到乙烯和水缺乏處理的抑制[26]。確定20個miRNA可能靶向玉米中的22個水通道蛋白，其中兩個miRNA-tar-get對(ghr-miR4371和contig780;以及ghr-miR4371和BK007054.1)也通過降解組序列分析檢測到。水通道蛋白可能通過作為miRNA靶標(biāo)(例如ghr-miR4371)參與對玉米中的干旱脅迫的響應(yīng)。

過量表達(dá)miR393的轉(zhuǎn)基因水稻植物對鹽和堿處理更敏感，miR393是通過靶向非生物相關(guān)基因?qū)}和堿脅迫響應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子[27]。在該研究中，獲得了相反的結(jié)果，其中g(shù)hr-miR393a / b / c / d / e表達(dá)通過干旱和鹽度處理上調(diào)。然而，玉米中預(yù)測的ghr-miR393靶標(biāo)也是應(yīng)激相關(guān)基因，以及幾種激素應(yīng)答基因，包括NADPH：細(xì)胞色素P450還原酶(CPR1)，III類過氧化物酶(POX4)，蛋白質(zhì)AUXIN SIGNALING F-BOX 3，和TIR1(運輸抑制器響應(yīng)1)。如果玉米中的miR393也是水稻中的負(fù)壓脅迫調(diào)節(jié)因子，一種可能的解釋是，玉米幼苗中miR393s在干旱脅迫下的上調(diào)有助于擴(kuò)大玉米的脅迫信號，觸發(fā)通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)串?dāng)_來對抗干旱脅迫的更有效或更強大的途徑，可能是通過生長素相關(guān)途徑。

使用基于CitationRank的算法，在植物的干旱和鹽度脅迫的背景下編碼相關(guān)的編碼基因?；贕O分析允許確定基因?qū)儆谀男〨O術(shù)語(生物過程，分子功能和細(xì)胞成分)[28]?；贕O的分析可以提供更多關(guān)于理解miRNA功能的想法。研究中總共274個miRNA(256個保守的miRNA和18個新的miRNA)和其1驗364個靶標(biāo)被分類為542個分子功能，679個生物學(xué)過程和138個細(xì)胞組分。至少137種miRNA及其與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。229種靶標(biāo)能夠分為1.2種分子功能，118種生物過程和37種細(xì)胞成分。35個miRNA-靶標(biāo)對屬于響應(yīng)于干燥的生物學(xué)過程(GO：0009269)和對水剝奪的反應(yīng)(GO：0009414)，例如ghr-miR159b、ghr-miR166h、ghr-miR399i、 ghr-n26和ghr-miR399f。許多分類的生物過程與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，如生長素代謝(GO：0009850)和生物合成論(GO：0009851)，乙烯介導(dǎo)的信號通路(GO：0009873)，對生物刺激的反應(yīng)(GO) ：0009607)，細(xì)胞分裂素代謝(GO：0009690)和生物合成(GO：0009691)，以及茉莉酸代謝(GO：0009694)和生物合成。其中，MYB3R被評為干旱環(huán)境中最重要的基因。最近，越來越多的研究報道MYB與植物的耐旱性有關(guān)。例如，煙草中的R2R3型MYB基因NbPhan被認(rèn)為在解決干旱脅迫方面發(fā)揮了作用，其煙草沉默導(dǎo)致煙葉嚴(yán)重萎縮和增加水分流失率[29]。MYB對纖維發(fā)育也至關(guān)重要。玉米中miRNA和MYB轉(zhuǎn)錄因子之間的相關(guān)調(diào)節(jié)機制有望用于雙重目的，即纖維發(fā)育和耐旱性。對于鹽度反應(yīng)，包括顆粒蛋白重復(fù)半胱氨酸蛋白酶，醇脫氫酶1，富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白3和赤霉素2-β-雙加氧酶7的基因被確定為在鹽度響應(yīng)的重要性方面排名較高。有許多報道顯示實際上顆粒蛋白重復(fù)半胱氨酸蛋白酶與干旱反應(yīng)無關(guān)，而與植物中的程序性細(xì)胞死亡無關(guān)[30-31]。干旱脅迫可能更容易通過半胱氨酸蛋白酶觸發(fā)植物中的程序性細(xì)胞死亡。

4 結(jié) 論

鑒定了337前體miRNA，其中包含289種已知的miRNA和48種新的miRNA。在3個文庫，兩個分組中共有155種差異表達(dá)miRNA。目標(biāo)預(yù)測，基于GO功能分類和基于遺傳和基因組(KEGG)的功能富集顯示，miRNA可能通過靶向一系列與脅迫相關(guān)的基因而在干旱脅迫中發(fā)揮作用。至少55個預(yù)測的靶基因進(jìn)一步被60個miRNA調(diào)控。NAC、MYB和MAPK基因家族在干旱脅迫下評分最高，在植物抗旱中重要作用。根據(jù)目標(biāo)基因預(yù)測，一系列玉米miRNA與這些排名靠前的基因相關(guān)，包括miR164、miR172、miR1520、miR6158、ghr-n24和ghr-n56等。miRNAs可能在玉米雄穗花器官分化期耐旱中發(fā)揮重要作用，miRNAs的篩選為分子輔助育種和轉(zhuǎn)基因育種將提供新的靶標(biāo)。