銀杏種子萌發(fā)過程低場核磁T2反演譜解譯初探

趙茂程，顧 盛，汪希偉，汪貴斌，李 忠

銀杏種子萌發(fā)過程低場核磁T2反演譜解譯初探

趙茂程1,2，顧 盛1，汪希偉1，汪貴斌3，李 忠4

（1. 南京林業(yè)大學機械電子工程學院，南京 210037；2. 泰州學院，泰州 225300；3. 南京林業(yè)大學林學院，南京 210037；4. 南京林業(yè)大學機電產(chǎn)品包裝生物質(zhì)材料國家地方聯(lián)合工程研究中心，南京 210037）

隨著科學技術的發(fā)展，低場核磁共振（Low Field Nuclear Magnetic Resonance, LF-NMR）橫向弛豫時間（Transverse Relaxation Time, T2）反演譜檢測技術越來越多的被應用于農(nóng)業(yè)，但當前對T2反演譜的解譯尚停留在水分相態(tài)分布層面。為探索從物質(zhì)成分角度對種子T2反演譜進行解譯的新方法，該研究以銀杏種子為對象，利用低場核磁共振技術檢測并對比銀杏鮮種、種子粉末及其主要成分試樣的T2反演譜，分析各信號峰的形成機理，并以此為依據(jù)對其在種子萌發(fā)過程中的變化進行解譯。研究結果表明：淀粉與蛋白質(zhì)混合試樣T2反演譜的峰T21、T22、T23以及淀粉與油脂混合試樣的峰T24在峰頂時間上和種子粉末試樣相對應信號峰完全一致；在物質(zhì)成分及配比完全相同的情況下，種子粉末試樣T2反演譜的峰T21～T24的峰頂時間較鮮種分別相差12.98%、32.21%、13.02%、0%，T21、T22峰比例較鮮種分別偏少41.72%、29.33%，T23峰比例偏多92.26%，T24峰比例偏少91.71%，說明種子組織結構會對其內(nèi)部水分的弛豫時間和相態(tài)分布比例造成一定影響。僅從物質(zhì)成分角度考慮，種子內(nèi)水分的弛豫時間主要在淀粉、蛋白質(zhì)的影響下表現(xiàn)為T21、T22、T23，在淀粉和油脂的影響下表現(xiàn)為T24。由此認為峰T21、T22主要為吸附在淀粉和蛋白質(zhì)上相態(tài)不同的結合水的信號，峰T23為主要被淀粉和蛋白質(zhì)束縛后產(chǎn)生的半結合水的信號，峰T24主要為種子中自由水的信號（少量源自油脂）。此外，種子即將裂殼時將形成T2a（峰頂時間在10 ms左右）、T2b（峰頂時間＞1 000 ms）2個新信號峰，可作為預示種子萌發(fā)狀態(tài)即將發(fā)生重要變化的“預兆峰”。提出的從化學組分及核磁檢測原理角度對銀杏種子萌發(fā)過程T2反演譜進行解譯的新途徑，可為基于LF-NMR方法對種子萌發(fā)過程中化學組分變化進行活體分析提供參考。

核磁共振；種子；水分；T2反演譜；解譯；萌發(fā)過程

0 引 言

銀杏（L.）是原產(chǎn)于中國的珍貴樹種之一，其葉具有極高的藥用和經(jīng)濟價值[1-4]，現(xiàn)已大量推廣種植。銀杏主要的繁殖方法有播種、扦插、嫁接、分蘗等，由于實生苗葉總萜內(nèi)脂和黃酮含量高[5]，葉用銀杏常采用播種繁殖。研究銀杏種子萌發(fā)過程中的水分狀態(tài)分布以及成分含量變化，對探究其萌發(fā)機理、指導科學種植具有重要意義。

低場核磁共振技術（Low Field Nuclear Magnetic Resonance，LF-NMR）的橫向弛豫時間（Transverse Relaxation Time，T2）反演譜檢測可以快速、無損地獲知樣品內(nèi)水分含量和相態(tài)分布情況，已廣泛運用于食品[6-9]、環(huán)保[10]、材料[11-12]、地質(zhì)[13-14]等領域。T2反演譜檢測在種植業(yè)也成為了重要的研究手段，宋平等[15]通過LF-NMR技術動態(tài)監(jiān)測玉米種子的萌發(fā)過程，研究其內(nèi)部各相態(tài)水分的流動規(guī)律和生理代謝狀態(tài)；楊洪偉等[16]利用T2弛豫譜和質(zhì)子密度加權成像分析在聚乙二醇處理下水稻種子萌發(fā)過程內(nèi)部水分分布和變化規(guī)律；牟紅梅等[17]結合T2弛豫譜和質(zhì)子密度加權成像分析，對冬小麥籽粒進行連續(xù)活體檢測，揭示了小麥灌漿過程水分變化規(guī)律。國外學者也利用T2反演譜對植物萌發(fā)過程進行了諸多研究[18-21]。但目前對T2反演譜的解譯僅停留在水分相態(tài)分布的層面，未能將其與檢測對象的化學組分建立關聯(lián)。

為突破當前對T2反演譜解譯的局限，本文以銀杏種子為研究對象，通過低場核磁共振技術，檢測并分析鮮種、種子粉末及其主要成分試樣的T2反演譜，探究各信號峰的形成機理，擬提出一種從物質(zhì)成分角度對種子萌發(fā)過程中T2反演譜的變化進行解譯的新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗設備

本文主要設備為MesoMR23-060H-I在線低溫核磁共振分析與成像系統(tǒng)（蘇州紐邁分析儀器股份有限公司）、RXZ-500B人工氣候箱（寧波江南儀器廠）、Allegra 64R臺式高速離心機（貝克曼庫爾特有限公司）、DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、JA1003電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；麥芽糖購自上海源葉生物科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，另索氏提取器、玻璃試管、培養(yǎng)盒、吸水紙若干。

試驗采用的銀杏種子取自江蘇省邳州市銀杏良種基地，品種為道真5號，于2018年10月采摘后帶皮儲藏。2019年3月，在種子完成生理后熟后，洗去外種皮，晾干表面水分并挑選出顆粒飽滿、大小和質(zhì)量相近的銀杏種子。選取20顆用于萌發(fā)試驗，其余種子備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 主要成分提取

參照GB 5009.6-2016[22]提取銀杏種子粗脂肪。通過堿溶酸沉法獲得粗銀杏種子蛋白質(zhì)[23]，并參照文獻[24-25]的方法提取淀粉。將去殼去皮的銀杏種子在40 ℃下烘干后粉碎，過400目篩。采用正己烷脫脂（種子粉末：正己烷=1:8（質(zhì)量/體積）），4 ℃下低速攪拌1 h后抽濾，重復2次。將脫脂后的種子粉末分散在蒸餾水（10%，質(zhì)量/體積）中，使用1 mol/L的NaOH將pH值調(diào)節(jié)至9.0，并在室溫下攪拌30 min，以8 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，收集上清液用于提取蛋白質(zhì)，并刮除沉淀物表面綠色蛋白質(zhì)層（剩余部分即淀粉）。重復上述操作，直至沉淀物表面無綠色蛋白質(zhì)層。將淀粉用1 mol/L的HCl中和至pH值7.0，使用鼓風干燥箱在40℃下干燥24 h，研磨后過150目篩，在室溫下保存?zhèn)溆?。將上清液? mol/L的HCl酸化至pH值4.4，通過離心回收沉淀物，用1 mol/L的NaOH中和至pH值7.0，經(jīng)冷凍干燥后獲得銀杏種子蛋白質(zhì)。

1.2.2 T2弛豫譜檢測與反演

將樣品置入探頭線圈后，首先通過核磁共振分析應用軟件中的FID（Free Induction Decay）脈沖序列自動尋找90°脈寬P1，并校正中心頻率O1，再選擇CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列檢測T2弛豫譜。主要參數(shù)設置如下：90°脈寬P1=6s，180°脈寬P2=12s，回波時間TE=0.25 ms，回波個數(shù)NECH=15 000，累加次數(shù)NS=12，模擬增益RG1=20 dB，數(shù)字增益DRG1=3，前置放大倍數(shù)PRG=1，頻率漂移O1每次檢測時自動校準。T2弛豫譜檢測完成后，通過分析軟件自帶的SIRT方法進行反演，迭代次數(shù)設置為1 000 000。對每組樣品進行3次連續(xù)的信號采集，取均值進行分析。

1.2.3 銀杏種子萌發(fā)試驗

本文的研究目的在于建立種子主要成分與T2反演譜之間的關聯(lián)，而銀杏種子的主要成分種類均相同，因此種子個體間的差異不對本文研究造成影響。本文選用20顆種子分為10組（每次檢測2顆種子的共同信號）進行萌發(fā)試驗，期間進行稱質(zhì)量及T2反演譜檢測。設定第一次檢測的時間為0 h，檢測完成后把種子埋入盛有濕沙（相對濕度60%～80%）的培養(yǎng)盒中，放進人工氣候箱，溫度設定為30 ℃[26]，濕度100%，光照12 h/d。每隔24 h將種子取出，洗去沙粒后用吸水紙擦拭掉表面的水分，靜置5 min后重復上述檢測，記錄下種子在萌發(fā)過程中各個時刻的質(zhì)量（認為種子增加的質(zhì)量源于吸收的水分）、T2反演譜。檢測完成后立即將種子埋入培養(yǎng)盒，并適量澆水，保證種子在萌發(fā)的過程中有充足的水分。萌發(fā)試驗進行到胚根長出體外2 mm左右。根據(jù)式（1）計算出種子在萌發(fā)過程中各時間點的吸水率W[27]，并繪制吸水率變化曲線（僅用于尋找本研究中種子萌發(fā)過程吸水規(guī)律發(fā)生明顯變化的時間節(jié)點，作為T2反演譜變化過程中的典型時刻）。

式中W為銀杏種子的吸水率，%；W為銀杏種子t時刻的含水質(zhì)量，g；0為銀杏種子初始含水質(zhì)量，g；0為種子初始鮮質(zhì)量，g。

1.2.4 種子粉末及主要成分試樣T2反演譜檢測

為分析銀杏種子T2反演譜各信號峰的形成機理，采集種子粉末及主要成分試樣的T2反演譜，并與鮮種進行比對，檢測參數(shù)見1.2.2節(jié)。稱取種子粉末0.5 g，添加水分制成含水率為50%的試樣（銀杏種子初始含水率約為50%，下述試樣采用同樣的含水率）進行T2反演譜檢測；稱取淀粉、蛋白質(zhì)、麥芽糖、油脂各0.5 g，分別添加水分制成單成分試樣進行檢測；另外將4種物質(zhì)按照干種子中的近似質(zhì)量分數(shù)（淀粉60%，蛋白質(zhì)20%，麥芽糖5%，油脂10%）逐一添加，制成混合試樣，每次添加物質(zhì)時加入相應質(zhì)量的水分并檢測T2反演譜。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法

使用Excel 2016和Origin 2018對數(shù)據(jù)進行計算處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 銀杏種子萌發(fā)過程吸水率變化情況

銀杏種子萌發(fā)過程吸水率隨時間變化關系曲線見圖1，數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式呈現(xiàn)。由圖1可知，0～24 h種子吸水率快速增長，24～72 h吸水率增加有所減緩，72 h之后種子吸水率進入振蕩階段，直至288 h開始持續(xù)增加，隨后骨質(zhì)中種皮開裂（裂殼），胚根長出體外（露白）。因此，可以將銀杏種子的吸水率變化大致分為4個階段：快速吸水期（0～24 h）、慢速吸水期（24～72 h）、振蕩期（72～288 h）、持續(xù)吸水期（288 h～露白）。

圖1 銀杏種子萌發(fā)過程吸水率變化

2.2 銀杏種子內(nèi)水分相態(tài)劃分

橫向弛豫時間T2反映了種子內(nèi)水分與物質(zhì)結合的緊密程度，T2弛豫時間越短，說明結合得越緊密，水分流動性越差。圖2為銀杏種子不同萌發(fā)階段的典型T2反演譜。裂殼前，T2反演譜上存在4個波峰，各個波峰的峰面積（信號幅值）即不同相態(tài)水分對應的信號量，反映該相態(tài)水的含量。參照已有研究的劃分方式[28-29]，將橫向弛豫時間為T21和T22（峰頂時間＜10 ms）的水分分別定義為結合水A和結合水B，這2個組分的水吸附在種子內(nèi)大分子有機物上，流動性較差；將橫向弛豫時間為T23（10 ms＜峰頂時間＜100 ms）的水分定義為半結合水，這部分水受一定束縛；將橫向弛豫時間為T24（峰頂時間＞100 ms）的水分定義為自由水，該組分水具有較強流動性，可在細胞內(nèi)外流動。需要說明的是，孫旭等[30]僅在銀杏種子中檢測到1種峰頂時間＜10 ms的結合水，與本文的檢測結果不一致。原因可能是檢測參數(shù)設置不同，本文或設置了更小的回波時間（Time of Echo，TE）。TE越小，回波點越密集，能更好地采集弛豫時間短的信號；當TE設置較大時，會導致系統(tǒng)無法區(qū)分出短弛豫信號。

另外，在種子即將裂殼時有2個新信號峰形成，橫向弛豫時間分別為T2a（峰頂時間在10 ms左右）和T2b（峰頂時間＞1 000 ms），對應的信號幅值分別為A2a和A2b。隨著萌發(fā)的進行，A2a、A2b均呈逐漸增大的趨勢。T2a、T2b兩個新信號峰的出現(xiàn)說明種子內(nèi)部環(huán)境發(fā)生了明顯變化，能夠很好地預示種子即將裂殼，可作為反映種子萌發(fā)狀態(tài)即將發(fā)生重要變化的“預兆峰”，在其他關于種子萌發(fā)過程的LF-NMR研究中未見有類似的“預兆峰”出現(xiàn)，但此類“預兆峰”是否為銀杏種子特有，有待進一步探究。

注：T21、T22、T23、T24分別為結合水A、結合水B、半結合水以及自由水信號峰的橫向弛豫時間；T2a、T2b為種子萌發(fā)過程中新增相態(tài)水分信號峰的橫向弛豫時間。

2.3 銀杏種子T2反演譜各信號峰形成機理

通過對比分析銀杏鮮種與各試樣的T2反演譜，探究其信號峰的形成機理。圖3為銀杏鮮種與單成分試樣的T2反演譜，銀杏種子的信號為萌發(fā)試驗中樣本的平均初始信號。圖中以主要成分代表試樣種類。由圖3可知，單成分試樣各信號峰的弛豫時間與種子信號差異較大。

圖3 銀杏種子及其主要成分試樣的T2反演譜

表1為銀杏鮮種、種子粉末及混合成分試樣各信號峰的峰頂時間及峰比例，以主要成分代表試樣種類。

表1 銀杏鮮種、種子粉末及混合成分試樣各信號峰峰頂時間及峰比例

由LF-NMR的檢測原理可知，水分在不同物質(zhì)、組織結構的影響下表現(xiàn)為不同的弛豫時間[31]。由表1可知，淀粉與蛋白質(zhì)混合試樣的T21、T22、T23峰頂時間和種子粉末試樣完全一致，后續(xù)加入麥芽糖和油脂后，這3個信號峰的峰頂時間均未發(fā)生改變，說明種子粉末試樣中T21、T22、T23峰頂時間主要受淀粉和蛋白質(zhì)的影響；油脂試樣的T24峰頂時間為265.609 ms，加入淀粉后變?yōu)?31.013 ms，和種子粉末試樣一致，說明種子粉末試樣的T24峰頂時間主要受淀粉和油脂的影響。然而因為尚有含量約5%的成分未提取，且混合試樣與種子粉末的成分配比略有不同，因此兩者的T2反演譜存在一定差異。

此外與鮮種相比，在物質(zhì)成分及配比完全相同的情況下，種子粉末試樣的峰T21～T24峰頂時間分別相差12.98%、32.21%、13.02%、0%，因此種子組織結構會對信號峰峰頂時間造成一定影響。

另外，銀杏種子與其粉末試樣的T2反演譜存在較大差異，相比鮮種，粉末試樣的T21、T22峰比例分別偏少41.72%、29.33%，T23峰比例偏多92.26%，T24峰比例偏少91.71%（見表1）。雖然銀杏種子與其粉末試樣在成分上并無差異，但將種子烘干并粉碎的過程會破壞細胞結構，由于結合水是細胞結構的重要組成成分，重新添加水分無法將其復原，因此導致種子粉末試樣T21、T22峰比例偏少。粉末試樣的T23峰比例較鮮種大幅偏多是因為試樣中的水分可直接與淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)接觸，被其束縛后大量形成半結合水，而在鮮種中這些物質(zhì)貯藏于細胞內(nèi)的質(zhì)體中，水分無法與其充分接觸，因此在同樣的含水率下，粉末試樣的半結合水比例遠高于鮮種。鮮種的T24峰比例較粉末試樣大幅偏多是由于在細胞結構的維持下，有部分水受物質(zhì)影響較弱，形成了可在細胞內(nèi)外流動的自由水，而粉末試樣中的細胞結構已被破壞，無法阻隔水分與物質(zhì)的接觸，因此不具備形成較多自由水的條件。

綜合上述內(nèi)容，種子組織結構會對信號峰峰頂時間及峰比例造成一定影響，僅從物質(zhì)成分角度考慮，種子內(nèi)水分的弛豫時間主要在淀粉、蛋白質(zhì)的影響下表現(xiàn)為T21、T22、T23，在淀粉和油脂的影響下表現(xiàn)為T24。由此認為種子的峰T21、T22主要為吸附在淀粉和蛋白質(zhì)上相態(tài)不同的結合水的信號，峰T23為主要被淀粉和蛋白質(zhì)束縛后產(chǎn)生的半結合水的信號，峰T24主要為種子中自由水的信號（少量源自油脂）。

需要說明的是，本文的研究旨在建立T2反演譜與種子化學組分之間的關聯(lián)，進而從物質(zhì)成分角度解譯T2反演譜，為定性分析。為得到銀杏鮮種組織結構、各成分含量對T2反演譜信號峰弛豫時間及峰比例所造成影響的量化指標，需進一步開展定量研究。

2.4 銀杏種子萌發(fā)過程T2反演譜各信號峰的變化趨勢

種子內(nèi)各相態(tài)水分含量與T2反演譜信號峰幅值呈線性關系[32]。銀杏種子萌發(fā)過程不同時間節(jié)點各信號峰的峰頂時間及單位質(zhì)量信號幅值見表2。為顯示各相態(tài)水分信號幅值的變化規(guī)律，將其除以種子初始鮮質(zhì)量（g），得到單位質(zhì)量信號幅值，以U21～U24代表峰T21～T24的單位質(zhì)量信號幅值。數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式呈現(xiàn)。

表2 各萌發(fā)節(jié)點信號峰峰頂時間及單位質(zhì)量信號幅值

由表2可知，自萌發(fā)節(jié)點0 h至24 h（下述時間均代表萌發(fā)節(jié)點），僅U21略有減少，U22～U24均有所增加。自24 h至72 h，U21變化幅度較大，減少50.10%，U22、U24均略有減少，U23增加7.97%。自72 h至288 h，僅U23增加5.38%，其余各信號峰單位質(zhì)量信號幅值均小幅度降低。從288 h至裂殼，U21小幅增加，U22降低15.33%，U23少量增加，U24增加19.98%。自種子裂殼至露白，U21無明顯變化，U22略有增加，U23迅速增加16.70%，U24少量減少。可見在銀杏種子萌發(fā)過程中，U23增加最多（43.99%），其余各信號峰單位質(zhì)量信號幅值均呈不同幅度的波動。另外，T21弛豫時間有較大幅度的波動（自0 h至24 h減小36.61%，自24 h至72 h增加170.42%），其余各信號峰弛豫時間整體上緩慢增加。

3 討 論

本文重點從物質(zhì)成分角度對銀杏種子萌發(fā)過程中T2反演譜的變化進行討論。在萌發(fā)過程中種子內(nèi)部發(fā)生了復雜的水交換過程，涉及到一系列物質(zhì)轉(zhuǎn)化與生理變化，在此期間T2反演譜的變化能夠反映種子內(nèi)水分相態(tài)轉(zhuǎn)化、大分子分解（淀粉，蛋白質(zhì)）、新蛋白質(zhì)合成以及含水量增加等情況[20]，另外新信號峰的出現(xiàn)能夠預示種子萌發(fā)狀態(tài)即將發(fā)生重要變化。對銀杏種子萌發(fā)過程T2反演譜的初步解譯如下。

3.1 信號峰幅值及弛豫時間變化原因

種子吸水率在最初24 h迅速增加的主要原因可歸結為與生命活動無關的純物理現(xiàn)象[33]，在此階段種子內(nèi)淀粉、蛋白質(zhì)等親水膠體大量吸水，種子整體含水量迅速提升，因此U22、U23、U24隨萌發(fā)節(jié)點均有所增加。U21減少可能是因為結合水A向其它組分轉(zhuǎn)化：水分進入胚乳后，種子的代謝能力被激活，吸附在大分子物質(zhì)上的部分結合水A開始轉(zhuǎn)化為半結合水，與宋平等[15]的觀點類似；另一方面，結合水A受束縛程度增強，弛豫時間大幅縮短。

快速吸水期過后，種子被動吸水的能力逐漸下降，但在接下來的階段，種子生理活動并未隨吸水率降低而減弱。慢速吸水期結合水A大量轉(zhuǎn)化為半結合水，U21大幅減少，同時其自由度提高，弛豫時間大幅增加?？梢娫诿劝l(fā)的0～72 h銀杏種子內(nèi)部環(huán)境發(fā)生較大變化，直至振蕩期峰T21弛豫時間和單位質(zhì)量信號幅值迅速變化的趨勢才明顯減緩。

自24～288 h，U22、U24持續(xù)小幅度減少，U23快速增加。這段時間內(nèi)種子整體含水率變化幅度較小，但種子內(nèi)部的生理活動仍較為旺盛。種子代謝需要自由水的參與，但由于吸水率停滯，自由水未能得到補充（在此期間種子吸收的水分主要轉(zhuǎn)化為了半結合水），U24有所減少。U23增加、U22減少或因淀粉與蛋白質(zhì)在此階段大量吸水并逐漸開始被水解：種子在萌發(fā)過程中需要將貯藏的淀粉和蛋白質(zhì)分解成小分子糖類和氨基酸，為胚的生長發(fā)育提供所需營養(yǎng)和材料，在此階段這些物質(zhì)大量吸水，以備水解所需，水分被束縛后即形成半結合水；同時有部分淀粉和蛋白質(zhì)已開始水解，結合水B主要通過氫鍵與淀粉、蛋白質(zhì)中的極性基團互相作用，形成水膠體[30]，水解過程中淀粉與蛋白質(zhì)的結構發(fā)生變化，或?qū)е挛狡渖系慕Y合水B減少。此外如前所述，慢速吸水期有部分結合水A轉(zhuǎn)化為半結合水，導致U23增加。

脫離振蕩期后，種子代謝能力迅速增強，吸水率得以增加，胚進入快速生長發(fā)育階段（288 h～裂殼），但此時種子吸收的水分不再大量轉(zhuǎn)化為半結合水，U23增加趨勢停滯。該階段增加最多的組分為自由水，自由水是良好的溶劑，其含量增加表明種子代謝進入了一個十分旺盛的時期。期間淀粉酶、蛋白酶的總體活性不斷增強，加快淀粉和蛋白質(zhì)的分解速率。這些物質(zhì)快速分解導致吸附其上的結合水B含量迅速降低，U22大幅減少。此外，銀杏種子在胚快速生長的過程中會合成新的蛋白質(zhì)[34]，該階段U21少量增加以及裂殼至露白期間U22少量增加或與新蛋白質(zhì)合成有關。

種子裂殼至露白期間，-淀粉酶、肽酶、硝酸還原酶活性達到最大[34]。各類酶活性的增強加速了種子內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化和代謝活動，為胚芽生長提供足夠的能量和所需氨基酸，該階段種子吸收的水分主要被淀粉、蛋白質(zhì)束縛形成半結合水，致使U23大幅增加而U24有所減少。

在整個萌發(fā)過程中，種子所有信號峰的弛豫時間整體上均呈增加趨勢，且除T21外無明顯波動。弛豫時間增加說明水分自由度提高，可能是由于萌發(fā)過程中種子不斷吸水、物質(zhì)濃度降低，導致物質(zhì)對水分的束縛減弱。

3.2 新信號峰形成原因

由圖2可知，在裂殼前種子T2反演譜上有T2a、T2b兩個新信號峰形成，說明種子內(nèi)部環(huán)境發(fā)生了明顯變化。新信號峰形成原因分析如下：一方面，胚乳中蛋白質(zhì)、淀粉等物質(zhì)水解后，其水解產(chǎn)物使與之結合的水分弛豫時間或分別表現(xiàn)為T2a、T2b；另外，在萌發(fā)過程中種子內(nèi)有新蛋白質(zhì)合成，水分與之結合后弛豫時間或表現(xiàn)為T2a。隨著萌發(fā)過程的進行，A2a和A2b均逐漸增大，能夠很好地預示種子即將裂殼（T2a更為明顯），因此這兩個新增信號峰可作為反映種子萌發(fā)狀態(tài)即將發(fā)生重要變化的“預兆峰”。

4 結 論

1）通過對比分析銀杏鮮種、種子粉末及其主要成分試樣的T2反演譜，研究各信號峰的形成機理。研究表明：淀粉與蛋白質(zhì)混合試樣T2反演譜的峰T21、T22、T23以及淀粉與油脂混合試樣的峰T24在峰頂時間上和種子粉末試樣相對應信號峰完全一致；在物質(zhì)成分及配比完全相同的情況下，種子粉末試樣T2反演譜的峰T21～T24的峰頂時間較鮮種分別相差12.98%、32.21%、13.02%、0%，T21、T22峰比例較鮮種分別偏少41.72%、29.33%，T23峰比例偏多92.26%，T24峰比例偏少91.71%，說明種子組織結構會對其內(nèi)部水分的弛豫時間和相態(tài)分布比例造成一定影響。僅從物質(zhì)成分角度考慮，種子內(nèi)水分的弛豫時間主要在淀粉、蛋白質(zhì)的影響下表現(xiàn)為T21、T22、T23，在淀粉和油脂的影響下表現(xiàn)為T24。由此認為峰T21、T22主要為吸附在淀粉和蛋白質(zhì)上相態(tài)不同的結合水的信號，峰T23為主要被淀粉和蛋白質(zhì)束縛后產(chǎn)生的半結合水的信號，峰T24主要為種子中自由水的信號（少量源自油脂）。

2）在裂殼前銀杏種子T2反演譜上有T2a（峰頂時間在10 ms左右）、T2b（峰頂時間＞1 000 ms）兩個新信號峰形成。T2a、T2b兩個新信號峰的出現(xiàn)說明種子內(nèi)部環(huán)境發(fā)生了明顯變化，能夠很好地預示種子即將裂殼，可作為反映種子萌發(fā)狀態(tài)即將發(fā)生重要變化的“預兆峰”。

3）銀杏種子萌發(fā)過程的T2反演譜檢測發(fā)現(xiàn)，各相態(tài)水分信號量在萌發(fā)過程中呈現(xiàn)互異的變化規(guī)律，其中半結合水信號量持續(xù)增加，其余各相態(tài)水分信號量以不同幅度波動；所有信號峰的弛豫時間整體上均呈增加趨勢，除T21外無明顯波動。

本文研究了銀杏種子T2反演譜各信號峰的形成機理，提出了一種從化學組分及核磁檢測原理角度對種子萌發(fā)過程中的T2反演譜進行解譯的新方法，從而為基于LF-NMR方法對種子萌發(fā)過程中的化學組分變化進行活體分析提供參考。

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Preliminary study on interpretation of LF-NMR T2inversion spectrum of ginkgo biloba seed during germination process

Zhao Maocheng1,2, Gu Sheng1, Wang Xiwei1, Wang Guibin3, Li Zhong4

(1.210037; 2.225300,; 3.210037,; 4.210037,)

With the development of science and technology, low field nuclear magnetic resonance (LF-NMR) is increasingly used in agriculture.At present, the interpretation of the transverse relaxation time (T2) inversion spectrum stays at the level of the water phase state distribution in the measured sample. It is beneficial to connect the T2inversion spectrum to the chemical composition of test subject. In order to find such a connection as the substance-oriented interpretation of the T2inversion spectrum,LF-NMR was applied for 20 ginkgo biloba (L.) seeds during germination that divided into 10 groups. Temporal observation of ginkgo biloba seeds over the germination process were carried out in vivo using LF-NMR. Their T2inversion spectra were collected and compared with those from the reference samples that made from seed powder or different mixtures of the main ingredients of ginkgo biloba seeds to explore the forming mechanism of the signal peaks of T2inversion spectra for a viable interpretation from the perspective of substances. Analysis of the T2inversion spectra of ginkgo biloba seeds indicated that water in live ginkgo biloba seed could be divided into 4 phase states according to T2, including 2 distinctive bound water of different kinetic activity with transverse relaxation times spiking at T21and T22, semi-bound water spiking at T23, and free water at T24. The peak T21, T22, T23of the T2inversion spectrum of the starch and protein mixed sample and the peak T24of the starch and oil mixed sample were exactly the same as the corresponding signal peaks of the seed powder sample in terms of peak time. When the material composition and the ratio were completely the same, the peak times of the peak T21-T24of the T2inversion spectrum of the seed powder sample were 12.98%, 32.21%, 13.02% and 0% different from those of the fresh seed, respectively. The proportions of peak T21and T22are 41.72% and 29.33% less than those of fresh species, respectively, the proportion of peak T23is 92.26% higher, and the proportion of peak T24is 91.71% lower. This showed that the seed tissue structure would affect the relaxation time and phase distribution ratio of its internal water to a certain extent. Only from the perspective of material composition, the water in seed was mainly expressed as relaxation time T21, T22, T23under the influence of starch and protein, and T24under the influence of starch and lipid. Therefore, it was believed that peak T21and T22was the signal of bound water (their phases are different) that mainly adsorbed on starch and protein, peak T23is the signal of semi-bound water that mainly fettered by starch and protein, and peak T24is mainly the signal of free water in seed (a small amount derived from lipid). Results of the temporal observation over the germination process found an interesting pattern of change regarding the water phase states in live seeds. While the unit mass signal amplitude of semi-bound water on a monotonous rise and the rest phase states fluctuate over time, the relaxation time of all signal peaks showed an increasing trend on the whole, and there was no significant fluctuation except T21. What’s more, 2 new signal peaks that spiking at T2a(around 10 ms) and T2b(over 1 000 ms) developed when a seed approaches the stage of seed-split and the spikes continued to grow ever since. We called them the “prophet spikes” for they foretell an important change in the seed and was about to split. The approach supply a new angle to interpret T2inversion spectra with chemical and NMR detection principle insights and a new reference for in vivo analysis of chemical composition changes during seed germination based on LF-NMR method.

nuclear magnetic resonance; seed; water; T2inversion spectrum; interpretation; germination process

趙茂程，顧盛，汪希偉，等. 銀杏種子萌發(fā)過程低場核磁共振T2反演譜解譯初探[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2020，36(15)：317-324.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.15.038 http://www.tcsae.org

Zhao Maocheng, Gu Sheng, Wang Xiwei, et al. Preliminary study on interpretation of LF-NMR T2inversion spectrum of ginkgo biloba seed during germination process[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(15): 317-324. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.15.038 http://www.tcsae.org

2020-02-18

2020-08-10

國家自然科學基金面上項目（31570714）

趙茂程，教授，博士生導師，主要從事無損檢測與圖像處理、現(xiàn)代機械設計理論與方法研究。Email：mczhao@njfu.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.15.038

S351.5+1

A

1002-6819(2020)-15-0317-08