改良固定法對冷凍組織石蠟切片的影響效果觀察

王德望，彭麗紅，龔金梅，司明遠，劉 夢，歐陽聰，張夢迪

冷凍切片技術已廣泛應用于術中病理診斷，高質量的冷凍切片技術對確保術中病理診斷的可靠性至關重要[1-2]。目前，國內外對于術中冷凍制片的研究較多，有關冷凍后組織處理的研究較少。冷凍后組織行常規(guī)制片常常會出現(xiàn)形態(tài)學失真性改變，這是臨床病理工作中普遍性難題[3]。作者發(fā)現(xiàn)冷凍后的組織經常規(guī)10%中性福爾馬林固定24 h左右或更長時間后制片，易發(fā)生組織收縮過度，細胞間或組織間出現(xiàn)人工裂隙，細胞核過度收縮，腺源性組織尤為明顯，增加了診斷難度。尤其是術中行快速冷凍病理檢查的組織標本小，病變不典型，術中診斷較困難，且冷凍后對應石蠟組織(以下簡稱：冷對組織)為唯一組織塊時，因組織過度收縮，比術中快速冷凍切片更不易觀察、診斷。作者近3年通過反復實踐后發(fā)現(xiàn)，改良冷凍后組織的固定方法可有效緩解組織過度收縮的問題，現(xiàn)將經驗分享如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2016年8月～2019年3月南京同仁醫(yī)院病理科存檔的術中行快速冷凍病理檢查的部分實性或囊實性標本合計200余例，重點回顧性觀察其中經石蠟切片證實的60例甲狀腺乳頭狀癌和20例肺腺癌。

1.2 主要設備低溫恒溫冷凍切片機、全自動組織脫水機、漂烘儀、切片機等。

1.3 試劑配制10%中性福爾馬林；AAF液(無水乙醇85 mL，冰醋酸5 mL，40%甲醛15 mL)。

1.4 方法

1.4.1常規(guī)固定方法 將術中行快速冷凍病理檢查后的冷凍組織置于10%中性福爾馬林中隔夜固定后，再常規(guī)脫水，該方法作為本實驗中的對照方法。改良固定方法1(以下簡稱：方法1)：將術中行快速冷凍病理檢查的冷凍組織置于預冷的AAF液中4 ℃冰箱中過夜固定，再常規(guī)脫水。改良固定方法2(以下簡稱：方法2)：將術中行快速冷凍病理檢查的冷凍組織置于10%中性福爾馬林中常溫固定3 h以上，10 h以內，即送檢當天適當固定后，再行常規(guī)脫水。

1.4.2實驗分組 實驗1組，選取最大徑0.5 cm以上的腫物，取2塊組織分別行快速冷凍病理檢查后，再分別行常規(guī)方法及方法1固定；實驗2組，選取最大徑0.5 cm以上的腫物，取2塊組織分別行快速冷凍病理檢查后，再分別行常規(guī)方法及方法2固定。

1.4.3觀察方法 所有組織塊經常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察實驗1、2組的甲狀腺乳頭癌各30例，肺腺癌各10例(經常規(guī)石蠟切片驗證)。

2 結果

實驗1組中27例經方法1處理的甲狀腺乳頭狀癌組織形態(tài)優(yōu)于經常規(guī)固定處理的同源組織標本，具體表現(xiàn)：常規(guī)固定處理的標本經常規(guī)制片后，甲狀腺濾泡出現(xiàn)變形，拉伸感，細胞間人工裂隙明顯，細胞及胞核收縮，胞核透亮空泡狀特征不明顯(圖1)，而方法1處理的甲狀腺乳頭癌標本組織變形輕微，拉伸感消失或緩解，組織間人工裂隙消失或緩解，細胞及胞核收縮不明顯，核透亮、空泡狀(圖2)。3例甲狀腺乳頭癌組織經方法1處理后組織形態(tài)與常規(guī)固定處理后的同源組織無明顯差異性改變。10例經方法1處理的肺腺癌組織形態(tài)優(yōu)于經常規(guī)固定處理的同源組織標本，具體表現(xiàn)：常規(guī)固定處理的標本經常規(guī)制片后，癌灶處肺泡間隔因組織收縮致增寬看似不明顯，肺泡壁癌細胞核明顯收縮，同時因細胞質收縮，導致部分本來連續(xù)性貼壁生長的癌細胞看似非連續(xù)(圖3)，而方法1處理的肺癌標本，病灶區(qū)肺泡間隔增寬現(xiàn)象明顯，貼壁型生長區(qū)域肺泡壁癌細胞形態(tài)飽滿，呈連續(xù)性貼壁生長，核凸向肺泡腔(圖4)。

實驗2組中28例經方法2處理的甲狀腺乳頭狀癌組織形態(tài)(圖5)優(yōu)于經常規(guī)固定處理的同源組織標本(圖6)，表現(xiàn)結果同實驗1組，2例無明顯差異性改變。9例經方法2處理的肺腺癌組織形態(tài)優(yōu)于經常規(guī)固定處理的同源組織標本，表現(xiàn)結果同實驗1組，1例無無明確差異性改變。

3 討論

通常我們認為10%中性福爾馬林在組織處理過程中主要起到蛋白固定的作用，對組織的收縮作用比較弱，組織固定時間一般在6～24 h之間，最長不宜超過72 h，普遍認為，過長時間固定會造成組織抗原性丟失，一般不導致組織收縮過度，而導致組織形態(tài)變形失真[4]。但作者發(fā)現(xiàn)，組織冷凍后常溫下10%中性福爾馬林固定時間如果大于10 h，制片后組織形態(tài)會失真，主要表現(xiàn)為：組織過度收縮，細胞間出現(xiàn)人工裂隙，細胞體積變小，核變致密，核型不清晰。這些改變會導致病變出現(xiàn)“人工不典型”，個別情況下如果病變組織小，術中快速冷凍病理檢查已全部取材或近似全部取材，因其它原因術中不能明確診斷的情況下，而冰對組織的“人工不典型”可能進一步增加診斷的難度，而不利于最終的診斷。因此，根據(jù)本科室長期以來的觀察經驗，傳統(tǒng)觀點所認為的10%中性福爾馬林組織收縮性弱可能僅限于常規(guī)組織固定后的經驗總結，而冷凍后的組織經10%中性福爾馬林固定后收縮效果則不完全一致。

冷凍組織經AAF液(無水乙醇，冰醋酸，福爾馬林)4 ℃冰箱中過夜固定后的制片效果較常規(guī)固定后佳，原因主要有兩個方面：(1)4 ℃低溫固定是關鍵所在，有專家認為組織經低溫冷凍后(18～22 ℃)細胞內易產生冰晶，同時細胞內骨架及生物膜相系統(tǒng)會驟然發(fā)生改變，而冷凍切片后如直接回到室溫，細胞骨架及生物膜相系統(tǒng)易致?lián)p傷[5-6]，而4 ℃環(huán)境可作為一個緩沖，有效緩解組織因忽“冷”忽“熱”所致的損傷，但目前有關低溫冷凍后組織的損傷機制尚不完全清楚，還有待得到進一步的科學論證。(2)AAF液中固定劑配伍有一定奧妙，此三種液體均有組織固定作用，但固定的機制不完全一致，其中乙醇屬于凝固固定劑，其滲透性較強(比福爾馬林弱)，但組織收縮性強，主要用于糖原及高分子量蛋白質固定；福爾馬林屬于非凝固交聯(lián)固定劑，其滲透性較強，固定均勻，組織收縮性小，主要通過與蛋白質共價結合并促進蛋白質交聯(lián)而產生固定作用；乙醇福爾馬林混合液可保存像糖原這樣的分子，使組織收縮和變硬程度比單獨使用要小。乙酸屬于酸性固定劑，滲透性強，其組織膨脹性強，可凝固核酸，是染色質的良好固定劑，但不能使蛋白質固定和沉淀。因此，AAF液的配方可阻抗組織過度收縮[7]，同時4 ℃固定可防止細胞內骨架及生物膜相系統(tǒng)受到破壞，維持細胞結構的完整性。有研究表明，甲醇與乙醇的固定效果類似，而且甲醇比乙醇的組織收縮性更少[8-10]，如果將本組實驗中AAF液配方中的乙醇改成甲醇或許更佳。

總體來講，冷凍組織經改良固定處理后形態(tài)較常規(guī)固定者佳，甚至色澤也較之鮮艷，形態(tài)色澤較接近常規(guī)非冷凍組織，雖仍有差別，但形態(tài)已相對較為保真，易于觀察、診斷。在日常工作中，作者將所有行術中快速冷凍病理檢查的組織均進行了改良固定和常規(guī)固定的比對，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的冷凍組織(鱗狀上皮、腺上皮、軟組織等)經改良固定后制片的效果比常規(guī)固定佳，其中以腺源性標本差異性大，究其機制不甚清楚，估計其細胞內微細結構較其他組織具有一定差異性。當然，影響冰對組織制片質量不僅僅與冷凍后固定方法這一單一因素有密切關系，還與冷凍過程中包埋劑對組織是否覆蓋完全及冷凍時長等造成細胞內冰晶形成的因素密切關聯(lián)。與其同時本組實驗發(fā)現(xiàn)，組織冷凍后再固定，固定時長似乎要比常規(guī)組織固定要短，但仍需積累大樣本實驗進一步驗證和探究。

①②③④⑤⑥