非小細胞肺癌組織中HAb18G、MMP-9和MMP-2表達與預后的相關性

趙天源，張艷敏，常延河

近年隨著空氣污染、人口老齡化等原因的日漸加重，肺癌患病率和病死率位居惡性腫瘤的首位[1]。肺癌中最常見病理類型為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，其惡性程度較高，侵襲和轉移是造成預后不良的主要原因，因此探討與腫瘤侵襲和轉移的相關分子指標具有重要的意義。在多種腫瘤中HAb18G能夠誘導MMP-9、MMP-2表達等，從而促進腫瘤細胞的浸潤和轉移[2]，但在肺癌中的表達鮮見報道。本文著重探討HAb18G、MMP-9和MMP-2的表達與NSCLC轉移和預后的關系，為NSCLC的早期診斷和預后判斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2002年1月～2013年5月河北省唐山市開灤總醫(yī)院手術切除的原發(fā)性NSCLC石蠟標本121例，其中男性98例，女性23例；≤50歲者45例，>50歲者76例；腫瘤直徑≤3 cm者86例，>3 cm者35例；病理類型：鱗癌61例，腺癌60例；組織學分化程度：高+中分化89例，低分化32例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期65例，Ⅲ+Ⅳ期56例；無淋巴結轉移者54例，有淋巴結轉移者67例。所有患者均經(jīng)病理確診，臨床病理資料均完整，術前患者均未行放、化療及免疫治療。

1.2 主要試劑HAb18G單抗和相關免疫組化試劑盒，購自江蘇太平洋美諾克公司。鼠抗人MMP-9單克隆抗體和免疫組化試劑盒，購自福州邁新公司。鼠抗人MMP-2單克隆抗體和免疫組化試劑盒，購自武漢博士德公司。

1.3 方法采用免疫組化SP法染色，將121例NSCLC石蠟包埋塊常規(guī)脫蠟、水化，3%H2O2，微波抗原修復，10%正常羊血清封閉。分別滴加HAb18G(1 ∶200)、MMP-9(1 ∶200)和MMP-2(1 ∶200)抗體，4 ℃過夜，滴加辣根過氧化酶標記兔抗鼠IgG，37 ℃ 1 h，DAB顯色，蘇木精復染，透明樹膠封固。用PBS代替一抗作陰性對照，取陽性對照片同步操作做陽性對照。通過查閱病案資料、電話等方式對患者進行術后5年生存期調查，利用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗分析三者的表達水平與患者生存期的關系。

1.4 結果判讀HAb18G、MMP-9和MMP-2的陽性細胞為腫瘤細胞膜或胞質呈棕黃色，在高倍鏡視野下選取4個不同視野，分別計數(shù)200個細胞，無陽性細胞為(-)；陽性細胞<30%為(+)；30%～50%為()；>50%為()。以(～)為陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。免疫組化結果采用χ2檢驗和Fisher確切概率法進行分析，利用GraphPad Prims軟件繪制Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗分析患者HAb18G、MMP-9和MMP-2表達水平與生存期的關系，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2表達與臨床病理特征的關系HAb18G(圖1、2)、MMP-9(圖3、4)和MMP-2(圖5、6)在NSCLC組織中的陽性率分別為71.07%、41.32%和55.37%。HAb18G蛋白表達與患者性別、年齡和病理類型無關(P>0.05)；在腫瘤直徑>3 cm組、低分化組、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移組表達分別高于腫瘤直徑≤3 cm組、高+中分化組、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組(P<0.05)。MMP-9和MMP-2蛋白表達與患者性別、年齡和分化程度無關(P>0.05)；在腫瘤直徑>3 cm組、腺癌組、低分化組、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移組中的表達分別高于腫瘤直徑≤3 cm組、鱗癌組、高+中分化組、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組(P<0.05，表1)。

①②③④⑤⑥

表1 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2表達與臨床病理特征的關系

2.2 NSCLC組織中HAb18G與MMP-9和MMP-2表達的相關性將NSCLC組織中HAb18G蛋白表達和MMP-9蛋白表達進行相關分析，結果顯示：HAb18G蛋白表達和MMP-9蛋白表達呈正相關(r=0.313，P<0.001)；將NSCLC組織中HAb18G蛋白表達和MMP-2蛋白表達進行相關分析，結果顯示：HAb18G蛋白表達和MMP-2蛋白表達呈正相關(r=0.268，P<0.05)。

2.3 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2的表達與預后的關系Kaplan-Meier生存分析結果顯示：高表達HAb18G患者術后5年生存率(12.79%)顯著低于低表達者(42.86%)(P<0.01)；高表達MMP-9患者術后5年生存率(14.00%)顯著低于低表達者(23.94%)(P<0.01)；高表達

圖7 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2的表達與預后的關系

表2 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2的表達與預后的關系

3 討論

肺癌作為全球高發(fā)惡性腫瘤，相關調查研究結果顯示其生存率不足20%[3]，因此對其侵襲及轉移機制的研究成為當今熱點之一。腫瘤的侵襲、轉移相關機制是由多因素、多步驟、多基因共同參與的復雜過程。

基質金屬蛋白酶是一組與鋅結合的內肽酶，能降解大部分細胞外基質成分，促進腫瘤細胞突破正常組織學屏障，侵襲鄰近組織和發(fā)生遠處轉移。其中，MMP-2和MMP-9與腫瘤的侵襲轉移關系最為密切。MMP-2(又稱Ⅳ型膠原酶)與MMP-9均由腫瘤細胞和間質細胞以酶原形式分泌，共同參與降解Ⅳ型膠原及纖維黏連蛋白等基膜和細胞外基質成分，其中MMP-9對腫瘤細胞的黏附能力也具有一定的作用[4]。兩者在多種腫瘤中均有表達。Liu等[5]研究表明，抑制MMP-2的通路與前列腺癌患者病情進展及預后密切相關。Ciuc?等[6]的研究結果表明，在54例舌鱗癌組織中，MMP-9和MMP-2在轉移淋巴結中強表達，提示它們在局部浸潤和轉移過程中有著重要意義。Jeleniewicz等[7]發(fā)現(xiàn)對MMP-9和MMP-2 mRNA表達水平的檢測可對卵巢癌患者的化療效果進行評價。本組實驗發(fā)現(xiàn)，MMP-9和MMP-2在腫瘤直徑>3 cm組、腺癌組、低分化組、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移組的表達分別高于腫瘤直徑≤3 cm組、鱗癌組、高+中分化組、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組(P<0.05)。這與Zhang等[8]的研究結果一致。Ni等[9-10]的研究結果均證實高水平的MMP促使腫瘤細胞發(fā)生浸潤與轉移，并與患者的生存期密切相關。

HAb18G是肝癌單克隆抗體HAb18的相應膜抗原(是一種高度糖基化、相對分子質量為5.8×104的跨膜蛋白)，作為新型腫瘤抗原之一，屬于免疫球蛋白家族成員，在人體中分布廣泛，參與胚胎發(fā)育、器官形成及炎癥反應，并在多種上皮組織起源的腫瘤中表達，進而參與腫瘤的侵襲和轉移等病理過程。其作用機制為誘導腫瘤細胞和間質成纖維細胞產(chǎn)生多種基質金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-11等)使細胞外基質降解，從而促進腫瘤細胞的浸潤和轉移。本實驗顯示，HAb18G在腫瘤直徑>3 cm組、低分化組、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移組中的表達分別高于腫瘤直徑≤3 cm組、高+中分化組、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組(P<0.05)，且低表達患者生存率明顯高于高表達組(P<0.05)。崔麗萍等[11]的研究結果亦顯示，HAb18G的表達與腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期密切相關，證實NSCLC中HAb18G表達與其病理特征、轉移及預后有一定的關系，可作為疾病發(fā)生、發(fā)展的重要參考指標。因此，可將HAb18G作為判斷NSCLC的預后情況指標。

本實驗結合HAb18G、MMP-9和MMP-2三種檢測指標，彌補單一指標易出現(xiàn)偏差性的缺點，且經(jīng)過相關性分析，驗證HAb18G與MMP-9和MMP-2表達呈正相關，綜合分析三者的表達水平與NSCLC的各項臨床病理特征及與預后的關系，為臨床提供了有價值的早期診斷與預后分析的參考指標，其相關分子通路問題有待于進一步分析。