電針和CO2激光灸對奧沙利鉑所致周圍神經(jīng)毒性大鼠的外周保護機制

施舍，范神棟，王鳳嬌，張雪慧，王珂，具紫勇

(1.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437)

奧沙利鉑(oxaliplatin， OXA)作為第三代鉑類抗腫瘤藥物，具有高效性、低毒性和安全性，廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌、胰腺癌和胃癌的治療[1]。然而，奧沙利鉑往往會引起周圍神經(jīng)病變，主要包括感覺異常，例如機械性異常性疼痛或冷異常性肢體感覺異常[2]。作為最主要的劑量限制性毒性，奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)病變(oxaliplatin-induced peripheral neuropathy，OIPN)嚴重影響了癌癥患者的生存質(zhì)量[3]。目前尚無確定的治療策略可預(yù)防這些不良反應(yīng)[4]。臨床研究表明，無論是針刺治療還是艾灸治療均能緩解奧沙利鉑所致的周圍神經(jīng)毒性[5-6]，但兩者之間是否具有相似的效應(yīng)和機制尚不明確。電針是在傳統(tǒng)手針基礎(chǔ)上發(fā)展起來，其刺激參數(shù)具有良好的可控性[7]。同樣，CO2激光灸是在傳統(tǒng)艾灸的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種光灸刺激方法，能較好地模擬傳統(tǒng)隔物灸的效應(yīng)發(fā)揮治療作用，同時具有較好的可重復性[8-10]。因此，為了探討電針和 CO2激光灸治療OIPN的可能機制，筆者進行了本項研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年健康清潔級雄性 SD大鼠 40只，體質(zhì)量(200±20)g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供[SCXK(滬)2013-0016]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心。自由進食飲水，每日光照 12 h。動物實驗倫理委員會批準編號為201710002。用SPSS21.0軟件產(chǎn)生隨機化分組方案。隨機取10只大鼠作為對照組;其余30只造模成功的大鼠隨機分為模型組、電針組、和CO2激光灸組，每組10只。

1.2 主要試劑與儀器

奧沙利鉑(南京制藥廠有限公司，批號H20000686);兔抗瞬態(tài)電壓感受電位錨定蛋白 1(transient receptor potential ankyrin 1， TRPA1)多克隆抗體(Thermo Fisher);鼠抗神經(jīng)生長因子(nerve growth factor， NGF)單克隆抗體(Santa Cruz);羊抗兔、羊抗鼠二抗(上海威奧生物科技有限公司);Von-Frey纖維絲(DanMic Global，美國LLC公司);冷熱板測痛儀(YLS-21A，濟南益延科技發(fā)展有限公司);針灸毫針(GB2024-94，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(HANS-200E，南京濟生醫(yī)療科技有限公司);CO2激光灸療儀(SX10-C1，上海萬奇光電技術(shù)有限公司);透射電子顯微鏡(JEM-1230，日本電子株式會社廣州事務(wù)所)。

1.3 模型制備

將奧沙利鉑溶液充分溶解于 5%的葡萄糖溶液，濃度為 1 mg/mL;除空白組外，其余大鼠每隔 1 d以2 mg/kg劑量給予共4次腹腔注射(第1天，第3天，第5天和第7天)，建立OIPN模型[11]，對照組采用相同的造模方法用等體積的5%葡萄糖溶液進行腹腔注射。

1.4 干預(yù)方法

大鼠最后一次奧沙利鉑注射后，第2天開始治療，隔日 1次，共 7次。電針組取雙側(cè)足三里穴，使用0.25 mm×13 mm毫針直刺大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處，深度7 mm，針刺完畢后，針灸針與韓氏電針儀相連，頻率為2 Hz，電流強度為1 mA，選連續(xù)波，每穴每次30 min。CO2激光灸組使用CO2激光灸療儀灸雙側(cè)足三里穴，功率80 mV，每穴每次15 min。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 大鼠機械性痛覺敏化測試

各組大鼠于造模前、造模后、電針和 CO2激光灸第4次和第7次治療后進行機械性痛覺敏化測試。將各組大鼠分別放于測試架的金屬網(wǎng)上，測試前將大鼠放于金屬網(wǎng)上 15 min。參考之前的報道[12-13]，采用“up-down”的方法測定大鼠 50%縮足閾值(paw withdrawal threshold， PWT)。采用 1 g、4 g、10 g、15 g、26 g、60 g的Von-Frey纖維絲進行刺激，以纖維絲呈現(xiàn)“S”形為度，每次持續(xù)5 s，大鼠的每側(cè)足底分別測量 6次，每一次測量需要和上一次測量時間間隔6 s以上，大鼠在刺激時間內(nèi)或在移開纖維絲時所立即出現(xiàn)的快速的抬足反應(yīng)記為陽性反應(yīng)。

1.5.2 大鼠冷刺激敏感度測試

各組大鼠于造模前、造模后、電針和 CO2激光灸第4次和第7次治療后進行測試。打開冷熱板測痛儀，將溫度設(shè)定在 4℃，待板上溫度恒定并達到設(shè)定溫度時，將大鼠置于冷板上，記錄5 min內(nèi)大鼠抬足或舔足的次數(shù)，連續(xù)測定3次，取平均值為最后結(jié)果[14]。

1.5.3 大鼠坐骨神經(jīng)電鏡下組織形態(tài)學觀察

于最后一次痛閾測試結(jié)束后，各組大鼠腹腔注射深度麻醉，俯臥位固定，鈍性分離坐骨神經(jīng)2 cm左右。將用于Western blot檢測的坐骨神經(jīng)用錫箔紙包裹迅速凍于液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。而用于透射電鏡觀察實驗的坐骨神經(jīng)則置于 4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛緩沖液中固定，按照說明操作進行清洗、固定、滲透等步驟，最后在透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.4 TRPA1、NGF蛋白表達檢測

對坐骨神經(jīng)組織進行蛋白上清液的制備和濃度測定。每個樣本取30 μg蛋白上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，分別加入一抗 TRPA1、NGF(濃度分別為1:1000和1:1200)和GAPDH，4℃孵育過夜，加二抗孵育。超敏ECL化學發(fā)光液與膜反應(yīng)2 min，然后在暗室中利用X膠片進行感光、顯影和定影。

1.6 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用 SPSS21.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，對于不同時間點的比較，采用重復測量的方差分析;對于多組間比較方法，釆用單因素方差分析，均繼以LSD進行兩兩比較。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PWT值比較

與對照組比較，模型組造模后各時間點 PWT值顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，電針組治療4次和7次后大鼠PWT值顯著上調(diào)(P＜0.01)。但CO2激光灸組大鼠 PWT值與模型組比較，各時間點差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠PWT值比較 (±s)

表1 各組大鼠PWT值比較 (±s)

注:與對照組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 造模前 造模后 第4次治療后 第7次治療后對照組 10 39.51±5.39 33.56±5.56 35.64±6.43 30.39±4.25模型組 10 36.23±6.32 5.04±1.771) 4.15±1.541) 2.52±1.131)電針組 10 35.82±6.17 4.67±1.841) 18.94±2.212) 19.34±2.642)CO2激光灸組 10 36.75±5.71 2.91±1.131) 3.73±1.731) 4.86±0.751)

2.2 各組大鼠冷刺激敏感度比較

與對照組比較，模型組造模后各時間點冷刺激抬足反應(yīng)率顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，電針組和CO2激光灸組在治療4次和7次后大鼠冷刺激抬足反應(yīng)率顯著下調(diào)(P＜0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠冷刺激敏感度比較 (±s)

表2 各組大鼠冷刺激敏感度比較 (±s)

注:與對照組比較1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較3)P＜0.01

組別 n 造模前 造模后 第4次治療后 第7次治療后對照組 10 1.83±0.43 2.01±0.51 1.65±0.41 1.07±0.32模型組 10 1.66±0.36 8.73±2.471) 10.76±2.092) 11.32±1.562)電針組 10 1.74±0.39 7.12±2.251) 1.85±0.453) 1.81±0.443)CO2激光灸組 10 1.59±0.41 5.83±1.191) 1.47±0.363) 1.76±0.463)

2.3 各組大鼠坐骨神經(jīng)電鏡下組織形態(tài)學比較

對照組大鼠坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維髓鞘致密均勻、結(jié)構(gòu)完整，中心為突觸，其外有明暗相間的同心板層髓鞘結(jié)構(gòu)，其內(nèi)有排列整齊的微絲、微管，無髓神經(jīng)纖維正常。模型組大鼠坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維髓鞘板層增厚、不均勻，排列略疏松紊亂，結(jié)構(gòu)分層變性溶解，偶見斷裂缺損，可見脫髓鞘，部分軸突有萎縮和變性的改變，也可見軸漿內(nèi)部分線粒體腫脹。電針組和 CO2激光灸組大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)較模型組有一定改善。詳見圖1。

2.4 各組大鼠坐骨神經(jīng)TRPA1和NGF蛋白表達的比較

與對照組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)區(qū)域 TRPA1的蛋白表達明顯上調(diào)(P＜0.01)，而NGF的蛋白表達明顯下調(diào)(P＜0.01)。電針或 CO2激光灸治療后，與模型組相比，電針組和CO2激光灸組TRPA1表達均明顯下調(diào)(P＜0.01)，而 NGF的表達明顯上調(diào)(P＜0.01，P＜0.05)。詳見圖2。

圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)電鏡形態(tài)

圖2 各組大鼠坐骨神經(jīng)TRPA1和NGF蛋白水平的比較

3 討論

奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)病變(OIPN)臨床以肢端感覺異常、刺痛、麻木、無力、遇冷誘發(fā)或加重，腱反射減退等為主要癥狀。在中醫(yī)學中屬“痹證”“血痹”范疇，其主要病機為氣血兩虛、瘀血阻絡(luò)[15]?！端貑枴の迮K生成》:“血凝于膚者，為痹。”汪機的《醫(yī)學原理》:“有氣虛不能導血榮養(yǎng)筋脈而作麻木者。有因血虛無以榮養(yǎng)筋肉。以致經(jīng)隧澀而作麻木者?！鄙蚪瘀椩凇峨s病源流犀燭》中指出:“麻，氣虛是本，風痰是標;木，死血凝滯于內(nèi)，而外挾風寒，陽氣虛敗，不能運動?！贬樉寞煼杉ぐl(fā)經(jīng)絡(luò)經(jīng)氣，達到舒筋活絡(luò)、調(diào)節(jié)陰陽的作用，進而緩解或改善OIPN的損傷[16]。電針和艾灸均能改善奧沙利鉑引起的神經(jīng)毒性[5，17]。本研究表明電針能夠有效改善大鼠奧沙利鉑所致的機械痛敏，同時改善異常的冷痛覺，CO2激光灸可有效改善其冷痛敏。研究發(fā)現(xiàn)電針可以有效降低大鼠奧沙利鉑所致痛覺過敏和超敏反應(yīng)，與改善OIPN大鼠的坐骨神經(jīng)傳導速度密切相關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)OIPN大鼠坐骨神經(jīng)損傷出現(xiàn)髓鞘變性為主的病理改變，提示OIPN可導致外周神經(jīng)的組織結(jié)構(gòu)變性和損傷。經(jīng)過電針和CO2激光灸干預(yù)后，坐骨神經(jīng)在神經(jīng)組織形態(tài)學上有一定程度的改善，表明電針和 CO2激光灸在治療奧沙利鉑所致周圍神經(jīng)病變中發(fā)揮著重要作用。本研究筆者采用了隔日1次進行干預(yù)的方式，主要是基于筆者前期臨床和實驗研究取得良好的效果[19-20]。間隔干預(yù)是一種有效的干預(yù)手段，如每周給予1～2次針刺刺激能明顯改善乳腺癌患者化療藥引起的周圍神經(jīng)病變[21]。連續(xù)每日刺激同樣能有效改善 OIPN[5，22]。但兩種刺激方式是否在療效上存在差異，有待后續(xù)的進一步臨床研究。

TRPA1是一種瞬間受體電位離子通道，作為環(huán)境刺激物傳感器，它可以將多種信號從外周傳遞至中樞，在冷覺、溫覺、機械刺激以及疼痛感受中發(fā)揮重要作用[23]。雪旺細胞作為一種周圍神經(jīng)的膠質(zhì)細胞，可為外周神經(jīng)軸突提供支持，并且形成髓鞘。雪旺細胞上TRPA1的異常激活與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)，沉默TRPA1可減弱異常性疼痛感知[24]。研究發(fā)現(xiàn)OIPN時大鼠背根神經(jīng)節(jié) TRPA1的表達增加，并認為這一改變與OIPN時的冷痛覺異常正相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示OIPN時大鼠坐骨神經(jīng)的TRPA1表達增加，且電針和CO2激光灸均可在一定程度上下調(diào) TRPA1表達的異常增高，與之前的報道相一致。NGF作為一種分泌型的多肽物質(zhì)，在調(diào)節(jié)和維持神經(jīng)元的存活、生長和分化等方面發(fā)揮重要作用[26]。本研究結(jié)果顯示電針和 CO2激光灸治療后可抑制坐骨神經(jīng) NGF表達的下調(diào)。臨床研究表明，外周血中NGF的表達水平與化療藥物導致的外周神經(jīng)病變呈負相關(guān)[27]。當外源性給予高劑量的NGF可以有效抵抗奧沙利鉑誘導的神經(jīng)元死亡[28]。最近研究發(fā)現(xiàn)，提高坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)的 NGF表達是丹參酮ⅡA抑制奧沙利鉑誘導的痛覺過敏和神經(jīng)元凋亡[27，29]，筆者研究結(jié)果與此相一致。提示奧沙利鉑誘導的外周神經(jīng)病變導致了NGF的下調(diào)，而通過電針和CO2激光灸等方法可能部分恢復 NGF的表達，從而改善了外周神經(jīng)病變的程度，進而改善了奧沙利鉑誘導的痛覺過敏。而NGF作為傳遞疼痛的重要分子，可以調(diào)控一些與疼痛相關(guān)的功能蛋白的表達從而誘發(fā)疼痛[30]。特別是在背根神經(jīng)節(jié)和脊髓 NGF介導的信號通路的改變，往往影響傳入感覺信號的調(diào)節(jié)，并最終導致神經(jīng)性疼痛的發(fā)展[31]。一項針對糖尿病性神經(jīng)病患者的Ⅱ期試驗發(fā)現(xiàn)，給予 NGF可減輕神經(jīng)性疼痛[32]，而Ⅲ期試驗卻發(fā)現(xiàn)與安慰劑相比，兩組神經(jīng)病變癥狀無差異[33]。可見 NGF信號與神經(jīng)保護及神經(jīng)性疼痛狀態(tài)之間關(guān)系極為復雜。坐骨神經(jīng)中NGF信號在OIPN中的作用有待進一步研究。

綜上，電針和CO2激光灸改善奧沙利鉑所致周圍神經(jīng)毒性，可能與調(diào)節(jié)坐骨神經(jīng)TRPA1和NGF水平有關(guān)。