毛細管電泳法基于Fe(Ⅱ)與Fe(Ⅲ)的比值識別簽字筆字跡的相對書寫時間

蔡 瑜, 曹成喜, 卓先義, 李紅根, 樊柳蔭

(1. 上海交通大學學生創(chuàng)新中心, 上海 200240; 2. 上海交通大學生命科學技術(shù)學院, 上海 200240; 3. 上海交通大學電子信息與電氣工程學院, 上海 200240; 4. 司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所, 上海 200063; 5. 上海交通大學物理與天文學院, 上海 200240)

文件形成時間的鑒定是法庭科學領(lǐng)域的熱點和難點問題[1]。在許多刑事案件或者民事糾紛中都會涉及文件形成時間的鑒定,比如在違法犯罪活動中,有的偽造早期的文件,以牟取他人的財物或其他權(quán)益;有的利用早期的或已經(jīng)失效的文件添加、改寫成有效的日期或內(nèi)容,以掩蓋其違法犯罪事實。在財產(chǎn)糾紛、合同糾紛、債務(wù)糾紛和詐騙、貪污、瀆職、保險理賠等案件中,為判斷文件真?zhèn)?對可疑文件上字跡形成時間的研究和建立可靠的鑒定方法是十分必要的。

書寫時間的鑒定分為絕對書寫時間鑒定和相對書寫時間鑒定[2]。前者是通過檢驗確定書寫文件的真實書寫時間,后者判斷同一文件上兩種或兩種以上筆跡的時間是否同時形成。由于影響書寫字跡的因素很多,判斷書寫絕對時間難度非常大,因此,相對書寫時間的鑒定比較常用。文件相對書寫時間的鑒定技術(shù)主要有擴散法[3,4]、色譜法[5-9]、光譜法[10-15]、毛細管電泳(CE)法[16,17]等,由于在實際案件中,可疑文件的形成條件和環(huán)境狀況比較復(fù)雜,大多數(shù)檢驗方法不可避免地有各種局限性,例如,檢材的取樣量、文件的存放環(huán)境等。如果能尋找一個不受取樣量等條件影響且能有效反映文件材料隨時間變化的指標,并從中找出其變化的規(guī)律就非常有意義。

早在1940年,Rhodes等[18]發(fā)現(xiàn)Fe(Ⅱ)書寫在紙張上容易被氧化成Fe(Ⅲ),因此,筆跡中Fe(Ⅱ)的氧化可能為鑒定文件中字跡的相對時間提供一種可能,但由于當時沒有合適的分離方法和樣品提取方法,無法準確測定筆跡墨水中Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的原始含量,也無法準確鑒定Fe(Ⅱ)的氧化程度,即筆跡的相對時間。更重要的是,Rhodes等沒有研究墨水瓶中的Fe(Ⅱ)是否容易被氧化,這對于字跡相對時間的鑒定至關(guān)重要。

本文建立了一種基于CE法鑒定字跡相對時間的新方法,通過比較從可疑筆跡中提取的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的峰面積比與從整個文檔中提取出的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的峰面積比,就可以判斷整篇文件是否同時書寫。該方法具有快速、樣品需要量少等特點,對于鑒別可疑文件中偽造插入的字跡,鑒別真?zhèn)喂P跡的相對年代具有重要的指導(dǎo)意義。

1 實驗原理

鞣酸鐵墨水中含有硫酸亞鐵、鞣酸、沒食子酸,根據(jù)它們之間的顯色反應(yīng),當墨水書寫在紙張上暴露在空氣中時,Fe(Ⅱ)及其Fe(Ⅱ)絡(luò)合物氧化成Fe(Ⅲ)。隨著時間的推移,Fe(Ⅱ)的量不斷減少,Fe(Ⅲ)的量不斷增加。因此,墨水中Fe(Ⅱ)的氧化程度可以成為鑒定墨水字跡相對時間的依據(jù)。如果可以準確地測定其濃度,那么就可以確定墨水字跡的相對時間。

實驗中選擇鄰菲羅啉(1,10-phen)和反式-1,2-環(huán)己二胺四乙酸(CDTA)兩種不同特異性結(jié)合的絡(luò)合劑,1,10-phen特異性絡(luò)合Fe(Ⅱ),形成[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+; CDTA特異性絡(luò)合鐵離子,形成[Fe (Ⅲ)-CDTA]-。然后用毛細管區(qū)帶電泳分離檢測并通過兩種絡(luò)合物峰面積的比值(R)作為評判Fe(Ⅱ)氧化程度的評價標準,即字跡相對時間的評判標準,評判公式如下:

(1)

式中,A[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+為[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+的峰面積,A[Fe(Ⅲ)-(CDTA)]-為[Fe (Ⅲ)-CDTA]-的峰面積,R為兩者比值。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

P/ACETMMDQ型毛細管電泳系統(tǒng)(Beckman Coulter Co.,美國),該系統(tǒng)配有32 Karat軟件分析系統(tǒng)、紫外檢測儀、液態(tài)恒溫裝置以及自動進樣器,可以提供高至30 kV的電壓。CE檢測波長設(shè)置為254 nm。所有的實驗溫度均控制在25 ℃。未涂層熔融石英毛細管柱,內(nèi)徑75 μm(外徑375 μm),總長40.2 cm,有效長度30 cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠),超純水裝置(Millipore,美國), 320 pH酸度計(Mettler Toledo,瑞士),高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠), DHG-9070A電熱常溫干燥箱(易盛科學技術(shù)有限公司,上海), HS-120D超聲波清洗儀(Scientz生物科技有限公司,寧波)。

硫酸亞鐵銨((NH4)2SO4·FeSO4·6H2O,純度99%),氯化鐵(FeCl3·6H2O,純度99%),苯甲酸(C7H8O2,純度99.5%),四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O,純度99.5%),硼酸(H3BO3,純度≥99.5%),抗壞血酸(C6H8O6,純度99%)試劑購自上?；瘜W試劑公司,CDTA(C14H22N2O8,純度99%),1,10-phen(C12H8N2·H2O,純度99%)試劑購于國藥集團化學試劑有限公司,藍黑墨水購于上海墨水廠。

2.2 溶液配制

標準溶液的配制方法如下:分別配制20 mmol/L的CDTA和5 mmol/L的1,10-phen標準溶液并室溫保存。每天使用前新鮮配制10 mmol/L的硫酸亞鐵銨溶液,每周配制10 mmol/L的氯化鐵溶液。配制的溶液于4 ℃低溫保存。

本實驗選用Na2B4O7-H3BO3作為背景緩沖液,緩沖液的配制方法如下:首先分別配制100 mmol/L的Na2B4O7溶液和100 mmol/L的H3BO3溶液,然后用100 mmol/L H3BO3溶液將100 mmol/L的Na2B4O7溶液pH調(diào)至9.2,并在緩沖液中加入少量的CDTA和1,10-phen絡(luò)合劑。

2.3 樣品前處理條件

剪取1 cm長的墨水跡線,剪碎后放入2 mL的EP管中,然后加入0.5 mL 5 mmol/L的1,10-phen萃取1 min,然后再加入0.5 mL 20 mmol/L的CDTA并用渦旋混勻儀振動10 min,最后,以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min,取上清液用于CE分離檢測。

2.4 CE程序及分離條件

電泳開始前,新的毛細管用137.9 kPa壓力,按照1.0 mol/L氫氧化鈉沖洗5 min,超純水5 min, 1.0 mol/L鹽酸5 min,超純水5 min,電泳緩沖液5 min的順序進行處理和平衡,每次進樣前用電泳緩沖液沖洗2 min。

CE條件為:熔融石英毛細管(40.2 cm×75 μm i.d.,有效長度30 cm),100 mmol/L硼酸-硼砂緩沖溶液(pH 9.2),分離電壓20 kV,壓力上樣(1.379 kPa,上樣時間5 s),檢測波長254 nm,分離溫度25 ℃,苯甲酸作為內(nèi)標。同時,為了確保[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+和[Fe(Ⅲ)-CDTA]-在分離過程中的穩(wěn)定性,在分離緩沖溶液中加入了一定量1,10-phen和CDTA(濃度為0.1 mmol/L)避免絡(luò)合物解離。

3 結(jié)果與討論

3.1 Fe(Ⅱ)在墨水瓶中氧化速率的研究

要以Fe(Ⅱ)與Fe(Ⅲ)的峰面積比作為鑒定墨水字跡相對時間的指標,首先必須確認Fe(Ⅱ)在鋼筆墨盒或墨水瓶中的氧化與在文件字跡中發(fā)生的氧化相比可以忽略不計。如果鋼筆墨盒或墨水瓶中的Fe(Ⅱ)有明顯的氧化,那么檢測字跡中Fe(Ⅱ)的氧化對確定文件中字跡的相對時間就沒有意義。

鞣酸鐵墨水儲存在密閉的墨水瓶中,與外界空氣隔絕,局部氧分壓對Fe(Ⅱ)的氧化影響非常小,且商用墨水的pH值約為2.0,在pH小于3時,Fe(Ⅱ)的氧化速率非常低[19],此外,鞣酸鐵墨水中含有大量的鞣酸、沒食子酸,這些物質(zhì)可以與Fe(Ⅱ)形成絡(luò)合物有效延緩Fe(Ⅱ)的氧化,從理論上講,Fe(Ⅱ)在墨水瓶中的氧化可以忽略,為了證實此假設(shè),我們對鋼筆墨盒和墨水瓶中可能存在的Fe(Ⅱ)的氧化進行了如下實驗:首先,每隔幾天,從墨水瓶中取出50 μL墨水,經(jīng)絡(luò)合劑處理后經(jīng)CE檢測,持續(xù)3個月,Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的峰面積比R如圖1所示,在大約兩個月的時間里,R值從0.3略微下降到0.27,從兩個月到3個月甚至更多的時間里,R值幾乎保持不變。這意味著Fe(Ⅱ)在墨水瓶中的氧化速率確實較慢,尤其是在使用新墨水兩個月后。

圖 1 Fe(Ⅱ)在墨水瓶中的氧化Fig. 1 Oxidation of ferrous ions in the gall ink bottle

然而,當墨水暴露在紙張上時,墨水中的硫酸會逐漸被紙張的纖維素所消耗,從而導(dǎo)致Fe(Ⅱ)在紙張中被逐漸氧化,因此,可以通過檢測Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的峰面積比R來估計墨水字跡的相對時間。

3.2 CE分離檢測Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)

3.2.1Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)與絡(luò)合劑的特異性絡(luò)合

Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)無紫外吸收,因此無法直接用紫外進行檢測。需要在鐵離子溶液中加入絡(luò)合劑生成具有紫外吸收的絡(luò)合物。據(jù)文獻報道,1,10-phen可以特異性地結(jié)合Fe(Ⅱ)(Fe(Ⅱ)與1,10-phen的穩(wěn)定常數(shù)為21.3,與CDTA的穩(wěn)定常數(shù)為18.2), CDTA可以特異性地結(jié)合Fe(Ⅲ)(Fe(Ⅲ)與CDTA的穩(wěn)定常數(shù)為29.3,與1,10-phen的穩(wěn)定常數(shù)為14.1),本研究采取1,10-phen和CDTA為絡(luò)合劑與兩種金屬離子進行絡(luò)合后進行CE分離檢測。

運用CE分離金屬離子絡(luò)合物,絡(luò)合劑的選擇無疑是實驗設(shè)計中非常重要的部分,絡(luò)合劑必須要與待測金屬離子具有絕對的特異性和高度的結(jié)合穩(wěn)定性,避免在毛細管分離過程中解離。因此,需要對兩種絡(luò)合劑與Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的特異性結(jié)合進行研究。首先,將1,10-phen和CDTA的混合溶液加入Fe(Ⅱ)標準溶液中,實驗過程中為了避免Fe(Ⅱ)被氧化,Fe(Ⅱ)溶液中加入抗壞血酸抑制氧化,加入苯甲酸作為內(nèi)標,然后進行CE分離檢測,結(jié)果見圖2a,從圖中可以看出,只出現(xiàn)Fe(Ⅱ)與1,10-phen絡(luò)合物的峰,而不出現(xiàn)Fe(Ⅱ)與CDTA的絡(luò)合峰,說明在兩種絡(luò)合劑同時出現(xiàn)時,Fe(Ⅱ)首先與1,10-phen特異性絡(luò)合。然后將1,10-phen和CDTA的混合溶液加入Fe(Ⅲ)標準溶液中進行CE分離,結(jié)果如圖2b所示,只出現(xiàn)Fe(Ⅲ)和CDTA絡(luò)合物的峰,而不出現(xiàn)Fe(Ⅱ)與1,10-phen的絡(luò)合物峰,說明在兩種絡(luò)合劑同時存在時,Fe(Ⅲ)與CDTA特異性絡(luò)合。

圖 2 兩種絡(luò)合劑與Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)的特異性結(jié)合Fig. 2 Specific binding between two complexing agents and Fe(Ⅱ), Fe(Ⅲ) ions a. 1,10-phen and Fe(Ⅱ): 40 μL of 10 mmol/L standard Fe(Ⅱ) solution with a small amount of ascorbic acid (antioxidant) with the simultaneous addition of 1.0 mL of 5.0 mmol/L 1,10-phen and 1.0 mL of 10 mmol/L CDTA; b. CDTA and Fe(Ⅲ): 50 μL of 10 mmol/L standard Fe(Ⅲ) solution with the simultaneous addition of 1.0 mL of 5.0 mmol/L 1,10-phen and 1.0 mL of 10 mmol/L CDTA. Conditions: 40.2 cm (effective length 30 cm)×75 μm i.d. (375 μm o.d.) capillary; 100 mmol/L pH 9.2 sodium borate acid buffer; voltage, 20 kV; injection, 1.379 kPa 5 s; detection wavelength, 254 nm; temperature, 25 ℃. Peak identifications: 1. [Fe(phen)3]2+; 2. free 1,10-phen; 3. [Fe(Ⅲ)-CDTA]-; 4. benzoic acid; 5. ascorbic acid.

圖 3 1,10-phen和CDTA的添加順序?qū)j(luò)合效果的影響Fig. 3 Influence of addition order of 1,10-phen and CDTA on the complexation of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) a. Addition of 1.0 mL of 10 mmol/L CDTA to the mixture of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) (solution A); b. subsequent addition of 1.0 mL of 5.0 mmol/L 1,10-phen to solution A; c. addition of 1,10-phen, followed by CDTA. Conditions: mixed standard solution: 40 μL of 10 mmol/L Fe(Ⅱ) and 50 μL of 10 mmol/L Fe(Ⅲ); other conditions are the same as those in Fig. 2. Peak identifications: 1. [Fe(phen)3]2+; 2. free 1,10-phen; 3. [Fe(Ⅲ)-CDTA]-; 4. benzoic acid.

3.2.2絡(luò)合劑添加順序?qū)j(luò)合效果的影響

絡(luò)合劑的加入會影響Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)之間的平衡,因此絡(luò)合劑的添加順序有可能對絡(luò)合選擇性有一定影響,為此,我們對Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)混合標準溶液中絡(luò)合劑的添加順序進行了研究。將CDTA加入鐵離子和Fe(Ⅱ)的混合溶液,然后進行CE分離,電泳圖譜如圖3a所示,結(jié)果只出現(xiàn)[Fe(Ⅲ)-CDTA]-的峰,之后在此溶液中加入1,10-phen后再進行電泳分離,結(jié)果如圖3b所示,出現(xiàn)[Fe(Ⅲ)-CDTA]-的峰和1,10-phen的峰,但并未出現(xiàn)[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+的峰,說明溶液中Fe(Ⅱ)都被氧化成Fe(Ⅲ)。如果在Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)標準混合液中先加入1,10-phen,然后再加入CDTA進行CE分離檢測,結(jié)果如圖3c,出現(xiàn)了[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+, 1,10-phen和[Fe(Ⅲ)-CDTA]-的峰及內(nèi)標峰。

將1,10-phen加入Fe(Ⅲ)和Fe(Ⅱ)的標準混合溶液,然后進行CE分離檢測,結(jié)果如圖4a,只出現(xiàn)Fe(Ⅱ)和1,10-phen的絡(luò)合物[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+的峰,然后再在圖4a的樣品溶液中加入CDTA,則會出現(xiàn)Fe(Ⅱ)和1,10-phen的絡(luò)合物[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+的峰以及Fe(Ⅲ)與CDTA的絡(luò)合物[Fe(Ⅲ)-CDTA]-的峰。圖4說明在同時存在兩種價態(tài)鐵離子時,1,10-phen首先絡(luò)合Fe(Ⅱ)。

圖 4 1,10-phen和CDTA的添加順序?qū)e(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)絡(luò)合效果的影響Fig. 4 Influence of addition order of 1,10-phen and CDTAon the complexation of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) a. Addition of 0.5 mL of 5 mmol/L 1,10-phen to the mixture standard solution of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) (20 μL of 10 mmol/L Fe(Ⅱ) and 40 μL of 10 mmol/L Fe(Ⅲ), solution A); b. subsequent addition of 1.0 mL of 10 mmol/L CDTA to solution A. The separation conditions are the same as those in Fig. 2. Peak identifications: 1. [Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+; 2. free 1,10-phen; 3. [Fe(Ⅲ)-CDTA]-; 4. benzoic acid.

圖3和圖4結(jié)果進一步證實了1,10-phen和CDTA對Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的特異性絡(luò)合。此外,實驗結(jié)果表明,兩種絡(luò)合劑的添加順序?qū)煞N鐵離子的檢測有較大的影響?？赡苁且驗榻j(luò)合劑的加入會影響Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)之間的動態(tài)平衡,先加入CDTA可能會導(dǎo)致Fe(Ⅱ)的反應(yīng)向氧化方向進行。

3.2.3兩種絡(luò)合劑添加時間間隔對絡(luò)合效果的影響

既然絡(luò)合劑添加順序?qū)煞N鐵離子的平衡會有影響,那么添加的時間間隔是否會對反應(yīng)平衡有影響?為此,本研究選取了10、30、60、180和300 s 5個不同的時間區(qū)間,考察了兩種絡(luò)合劑加入的時間間隔對兩種鐵離子測定的影響。從表1可以看出,隨著時間間隔的逐漸延長,A1/A2(A1、A2分別為[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+和[Fe(Ⅲ)-CDTA]-的峰面積)的值逐漸緩慢增加。結(jié)果表明,先用1,10-phen處理后再用CDTA處理的樣品確實使平衡向Fe(Ⅲ)還原的方向移動,但移動速度要慢得多。由表1進一步可以看出,當時間間隔設(shè)置在60 s以內(nèi)時,時間間隔對A1/A2比值的影響很小。然而,如果間隔設(shè)置為180 s以上,影響就會變得非常強。因此,兩種絡(luò)合劑添加的時間間隔控制在60 s。

表 1 絡(luò)合劑添加時間間隔對絡(luò)合平衡的影響(n=3)

3.3 實際樣品分析

為了評價所建立方法的適用性,本研究對兩種鞣酸鐵墨水字跡中的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)進行了檢測。圖5為CE分離譜圖,可以看出:用該方法可以檢測到兩種鐵離子的絡(luò)合物[Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+和[Fe(Ⅲ)- (CDTA)]-的峰,并且隨著書寫時間的延長,A1/A2的比值變小,證實了Fe(Ⅱ)逐漸被氧化成Fe(Ⅲ),墨水1和墨水2的A1/A2分別從1.79降到0.45和從2.67降到0.3。兩種墨水從書寫到書寫后75天A1/A2的變化證實所建立的方法可以用于鞣酸鐵墨水字跡相對時間的鑒定,墨水1和墨水2中兩種鐵離子峰面積比值不同的原因可能是兩種墨水的成分不同。圖5的結(jié)果簡單地證明了本研究所建方法可以用于鞣酸鐵墨水字跡相對時間的鑒定。

圖 5 兩種墨水字跡的電泳譜圖Fig. 5 Electropherograms of two gall ink handwriting samples a. sample of gall ink handwriting written on 26th Sept., 2018; b: sample of gall ink handwriting written on 10th Dec., 2018. The conditions are the same as those in Fig. 2. Peak identifications: 1. [Fe(Ⅱ)-(phen)3]2+; 2. [Fe(Ⅲ)-(CDTA)]-.

4 結(jié)論

本文建立了一種簡便、快速測定鞣酸鐵墨水字跡中Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的CE技術(shù)。通過比較從可疑筆跡中提取的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)峰面積的比值與從整個文檔中提取出的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)峰面積的比值,就可以判斷整篇文字是否同時書寫,對于鑒別可疑文件中偽造插入的字跡,鑒別真?zhèn)喂P跡的相對年代具有重要的指導(dǎo)意義。如果能進一步研究字跡相對時間的曲線及其影響因素,例如環(huán)境溫度、濕度、光線等,便可以測定不同文件字跡的相對時間,相關(guān)研究正在進行中。