基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的高靈敏度蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展

楊 云, 田瑞軍

(1. 南方科技大學(xué)化學(xué)系, 廣東 深圳 518055; 2. 香港科技大學(xué)化學(xué)及生物工程學(xué)系, 香港 999077)

近年來,隨著高靈敏度和高分辨質(zhì)譜儀的快速發(fā)展,以及相應(yīng)的樣品前處理技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法的進(jìn)步,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了長足的發(fā)展和成熟,并成為系統(tǒng)生物學(xué)研究的一門重要學(xué)科。細(xì)胞是生物體基本的結(jié)構(gòu)和功能單位,每個細(xì)胞都是不同的,通常采用大量細(xì)胞樣品整體分析的蛋白質(zhì)組學(xué)分析得到的是平均值,這會掩蓋單個細(xì)胞間的差異,也不能反映單個細(xì)胞的動態(tài)變化。而蛋白豐度與信使RNA水平表達(dá)僅有不到50%的一致性,因此單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞間異質(zhì)性和細(xì)胞動態(tài)變化的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。最近已經(jīng)有個別研究初步實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)[1]。類似地,每一塊組織內(nèi)部也是異質(zhì)的,組織的不同區(qū)域內(nèi)細(xì)胞種類和功能等方面也千差萬別,病人細(xì)胞分型或組織分型的蛋白質(zhì)組學(xué)能對疾病做更精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)組分型并指導(dǎo)預(yù)后和治療。另外,稀有細(xì)胞如血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞等樣品總蛋白含量非常少,只能依靠更高靈敏度的檢測分析方法。近年來,隨著單細(xì)胞基因組學(xué)技術(shù)的日益完善和成功應(yīng)用,精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)藥研究對蛋白質(zhì)組學(xué)提出了更高的期望。伴隨著對單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞分型或組織分型的蛋白質(zhì)組學(xué)等的需求增加,高靈敏度蛋白質(zhì)組學(xué)得到了高度重視和快速發(fā)展。

主流的蛋白質(zhì)組學(xué)方法均采用的是鳥槍法,即需要將復(fù)雜的蛋白樣品先酶解為多肽,然后經(jīng)過色譜或電泳分離,再進(jìn)入質(zhì)譜檢測。除納升液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(nanoLC-MS)外,毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)也已經(jīng)成功地應(yīng)用于微量樣品的鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)分析。相比常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)分析,單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)等前沿應(yīng)用需要實(shí)現(xiàn)數(shù)量級的靈敏度提升,這對蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程的各種步驟都提出了巨大的挑戰(zhàn)。從樣品前處理、多肽分離、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜接口設(shè)計(jì)、質(zhì)譜檢測到數(shù)據(jù)分析方面,每一步都需要進(jìn)行細(xì)致的方法學(xué)改進(jìn)以盡可能減少樣品損失和提高靈敏度。本文將對基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的高靈敏度蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的近期進(jìn)展,包括樣品前處理、毛細(xì)管電泳分離、CE-MS接口、質(zhì)譜檢測及應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述,并對其面向單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)等前沿應(yīng)用的機(jī)遇和挑戰(zhàn)進(jìn)行簡要評述。

1 微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)集成化前處理

目前主流的鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)均需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理,極易造成微量樣品的缺失并降低相關(guān)生化反應(yīng)的效率。為解決上述技術(shù)難題,國內(nèi)外多個團(tuán)隊(duì)開發(fā)了相關(guān)的集成化樣品前處理技術(shù)。例如,復(fù)旦大學(xué)張祥民教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了同步裂解少量活細(xì)胞和蛋白酶解的集成化樣品前處理方法iPAD-100(integrated proteome analysis device for 100 living cells)[2]和iPAD-1 (integrated proteome analysis device for single-cell analysis)[3]。通過將含有鹽酸胍和胰蛋白酶的緩沖液直接加入含有細(xì)胞樣品的液相色譜的樣品環(huán)中,在升溫至50 ℃和超聲條件下實(shí)現(xiàn)了1 h內(nèi)細(xì)胞裂解和蛋白酶解的同步操作?；谠摵诵脑?iPAD-100技術(shù)可從100個人大腸癌細(xì)胞中平均鑒定635種蛋白。iPAD-1技術(shù)則進(jìn)一步將樣品前處理改為在22 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管中進(jìn)行,反應(yīng)器體積減少到了2 nL,樣品前處理時(shí)間壓縮到了30 min。通過進(jìn)一步改進(jìn)納升液相色譜分離、高分辨質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)處理方法,作者從單個Hela細(xì)胞中最多鑒定到328種蛋白。中科院大連化學(xué)物理研究所張玉奎院士和張麗華研究員團(tuán)隊(duì)在集成化在線蛋白質(zhì)組學(xué)分析系統(tǒng)構(gòu)建方面具有長期積累,開發(fā)了一種基于固定化酶反應(yīng)柱的自動化蛋白組學(xué)分析平臺[4],可實(shí)現(xiàn)對最低125 ng大腸桿菌蛋白樣品的全自動化酶解和在線質(zhì)譜分析,并鑒定到接近300種蛋白。

浙江大學(xué)方群教授和北京大學(xué)黃超蘭教授聯(lián)合團(tuán)隊(duì)在國際上率先開發(fā)了基于液滴微流控芯片的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理技術(shù)[5]。通過將相關(guān)生化試劑不斷滴加到反應(yīng)體系中,細(xì)胞從裂解到酶解的前處理過程都可在總體積約550 nL的液滴內(nèi)完成。通過將酶解后的多肽樣品直接以氣壓方式上樣到納升分離色譜柱中,可以實(shí)現(xiàn)單個細(xì)胞內(nèi)蛋白的高分辨質(zhì)譜分析。基于Orbitrap Elite高分辨質(zhì)譜儀,作者從單個、10個、50個和100個HeLa細(xì)胞中分別鑒定到了51種、192種、612種和1 360種蛋白。美國西北太平洋國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室Kelly教授團(tuán)隊(duì)也開發(fā)了類似的液滴微流控芯片技術(shù)nanoPOTS (nanodroplet processing in one pot for trace samples)[6,7]?；诟鼮殪`敏的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀,作者從單個Hela細(xì)胞中平均鑒定到了670種蛋白,并從約10個Hela細(xì)胞中平均鑒定到了2 674種蛋白。但基于液滴微流控芯片的樣品前處理方法不能與nanoLC-MS在線連接,這會導(dǎo)致微量樣品在上樣過程中的損失并降低重現(xiàn)性。

本組近年來開發(fā)了一系列適用于微量生物樣品蛋白質(zhì)組深度覆蓋分析的、基于離心式微流控器件的集成化樣品前處理技術(shù)SISPROT(simple and integrated spintip-based proteomics technology)[8]。在200 μL至10 μL微流控器件內(nèi)先填入C18膜再在上面填入離子交換填料即可制成SISPROT器件。不同于通常使用的表面活性劑十二烷基磺酸鈉,我們采用一種溫和且質(zhì)譜兼容性好的表面活性劑十二烷基-β-D-麥芽糖苷進(jìn)行細(xì)胞裂解。該表面活性劑能很好地溶解疏水性的膜蛋白,從而使膜蛋白鑒定量增加至總體蛋白鑒定量的40%左右[8]。蛋白樣品首先吸附到離子交換填料上;經(jīng)過蛋白富集和雜質(zhì)洗脫后,蛋白的二硫鍵還原、烷基化封閉以及關(guān)鍵的蛋白酶解反應(yīng)可以在納升級別體積內(nèi)高效地完成。酶解生成的多肽樣品可以被方便地洗脫并轉(zhuǎn)移至同一微流控器件內(nèi)的C18膜上完成除鹽或高pH反相液相色譜分級。通過進(jìn)一步利用單一離子交換填料[9]或者混合模式的離子交換填料[10]進(jìn)行第一維多肽分級,再進(jìn)行基于高pH反相填料的第二維分級,我們成功地實(shí)現(xiàn)了微量蛋白樣品的深度覆蓋蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

基于SISPROT技術(shù),我們從2 000個293T人胚腎細(xì)胞中鑒定到了1 270種蛋白,我們進(jìn)一步從10萬個人牙髓干細(xì)胞中鑒定到了9 078種蛋白,其中包含3 771種膜蛋白[8]。另外,我們建立了最大的腸道微菌群蛋白數(shù)據(jù)庫,共從單個人糞便約10 μg蛋白樣品中鑒定到約20 558種腸道微菌群蛋白[11]。通過結(jié)合親和富集技術(shù),我們發(fā)展了基于SISPROT技術(shù)的微量蛋白親和富集-質(zhì)譜聯(lián)用分析流程,并精確地定量分析了生長因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2, Grb2)的動態(tài)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)[12]。在液體活檢應(yīng)用方面,通過結(jié)合使用SISPROT技術(shù)和數(shù)據(jù)非依賴型質(zhì)譜采集模式(data-independent acquisition, DIA),我們從1 μL血清樣品中鑒定到了超過300種蛋白,其中包含近50種美國FDA批準(zhǔn)的疾病標(biāo)志物[13]。另外,從2 mL腎癌病人尿樣中,我們能重復(fù)定量到約1 000種蛋白,并找到了125種具有顯著性表達(dá)差異的蛋白[14]。通過進(jìn)一步結(jié)合使用混合模式離子交換填料作為反應(yīng)器,我們實(shí)現(xiàn)了血漿蛋白樣品的中性條件上樣,并進(jìn)一步將整體樣品前處理時(shí)間壓縮到30 min。基于該技術(shù)的集成化二維色譜分級,我們成功地將來源于1 μL血漿的酶解多肽進(jìn)行11個組分的分級并鑒定到862種蛋白[10]。在組織活檢方面,我們采用激光顯微切割技術(shù)對人腸癌和癌旁組織的4種細(xì)胞類型進(jìn)行單細(xì)胞分辨率的捕獲并實(shí)現(xiàn)了基于SISPROT技術(shù)的細(xì)胞分型蛋白質(zhì)組學(xué)分析[15]?；诖?我們進(jìn)一步將糖蛋白富集功能集成到SISPROT技術(shù)中,對鼠腦的4種不同區(qū)域分別進(jìn)行了激光顯微切割和規(guī)?；堑鞍捉M分析[16]。

在在線高靈敏度蛋白質(zhì)組學(xué)分析方面,我們早期開發(fā)了可實(shí)現(xiàn)少量細(xì)胞集成化處理和在線質(zhì)譜分析的RCPR技術(shù)(rare cell proteomic reactor)[17]?；贚TQ質(zhì)譜儀,我們分別從500、5 000和50 000種人胚干細(xì)胞樣品中鑒定到了68、409和2 281種蛋白。最近,基于該技術(shù)并進(jìn)一步結(jié)合SISPROT技術(shù)原理和先進(jìn)的Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀,我們可以穩(wěn)定地從100個細(xì)胞中鑒定超過2 000種蛋白(未發(fā)表數(shù)據(jù))。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)與毛細(xì)管電泳的聯(lián)用,我們設(shè)計(jì)開發(fā)了一種基于微流控器件的SISPROT技術(shù)(相關(guān)文章已經(jīng)投稿至Analytical Chemistry雜志)。該技術(shù)可以直接與分析柱連接,通過毛細(xì)管電泳儀的氣壓驅(qū)動裝置全自動化完成集成化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理和多肽分級,為后續(xù)實(shí)現(xiàn)與CE-MS的全流程在線集成化操作奠定了基礎(chǔ)。

基于CE-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析需要先進(jìn)行樣品前處理得到酶解后的多肽樣品。但當(dāng)前CE-MS領(lǐng)域的樣品前處理基本仍在使用離心管做溶液內(nèi)酶解,僅到了使用固相微萃取、瞬間等速電泳(transient isotachophoresis, tITP)或動態(tài)pH調(diào)節(jié)進(jìn)樣的預(yù)濃縮階段才與CE-MS在線連接。溶液內(nèi)酶解時(shí)間長、效率低、樣品轉(zhuǎn)移多且接觸面積大,進(jìn)而樣品損失大,并不適合微量樣品的前處理。nanoLC-MS領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)了比較成熟的針對激光顯微切割的微量組織樣品和流式細(xì)胞儀分選的少量甚至單個活細(xì)胞樣品的集成化前處理方法,為基于CE-MS技術(shù)的高靈敏度蛋白質(zhì)組學(xué)分析奠定了基礎(chǔ)。美國Dovichi教授團(tuán)隊(duì)曾報(bào)道將胰蛋白酶固定在毛細(xì)管整體柱上實(shí)現(xiàn)了少量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的在線高效酶解[18],后來又使用強(qiáng)陽離子交換整體柱作為蛋白樣品酶解的微反應(yīng)器[19],實(shí)現(xiàn)了蛋白樣品的二硫鍵還原、烷基化封閉以及蛋白酶解的在線集成化前處理,并能與CE-MS在線連接。他們將前處理時(shí)間從溶液內(nèi)酶解的24 h壓縮到了40 min,從起始50 ng蛋白樣品中鑒定到了975類蛋白和3 749條多肽,是樣品前處理方面的一個重要進(jìn)展。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)多肽樣品的毛細(xì)管電泳分離

蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理后得到的多肽樣品由于太過復(fù)雜,需要經(jīng)過納升液相色譜或毛細(xì)管電泳分離后再進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析。納升液相色譜分離中通常使用的反相液相色譜是基于多肽的疏水性質(zhì)差別實(shí)現(xiàn)分離的,而毛細(xì)管電泳是基于多肽的荷質(zhì)比的不同實(shí)現(xiàn)分離的。多肽在毛細(xì)管內(nèi)的運(yùn)動速度由電滲流速度和電泳速度共同決定,是兩者的矢量之和。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis, CZE)是CE-MS中最主要使用的多肽分離方法,多肽在其中的峰展寬僅由軸向擴(kuò)散引起[20]。相比納升液相色譜分離,基于CZE的多肽分離可實(shí)現(xiàn)更窄的峰寬和更高的柱效。這主要是因?yàn)镃ZE可實(shí)現(xiàn)扁平的“活塞式”溶液流形,而納升液相色譜中的壓力驅(qū)動會形成拋物線形溶液流形,因而會引起溶質(zhì)的擴(kuò)散。美國Dovichi教授團(tuán)隊(duì)是國際上最早且最為深入地開展基于CZE-MS聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析團(tuán)隊(duì)。在該團(tuán)隊(duì)針對酶解多肽樣品的分析中,CZE在10 min的分離時(shí)間內(nèi)平均峰寬僅2.8 s,平均理論塔板數(shù)達(dá)到了30萬以上[21]。相比而言,采用2 h反相色譜梯度的納升液相色譜分離平均峰寬一般為18.92 s[22]。通過延長CZE的分離時(shí)間至2 h以上可以大大提高其峰容量和蛋白鑒定數(shù)量,最高可從220 ng蛋白樣品中鑒定約4 400種蛋白[23-25]。然而,毛細(xì)管電泳柱容量有限是其開管模式分離的弊端。在此方面,毛細(xì)管電色譜(capillary electrochromatography, CEC)是一種兼顧毛細(xì)管電泳高柱效和液相色譜高柱容量的分離方法。例如,通過采用基于0.4 μm粒徑的新型介孔微球,我們早在2006年即可實(shí)現(xiàn)對多種藥物分子的快速毛細(xì)管電色譜分析,平均理論塔板數(shù)達(dá)到了14.9萬以上,最小理論塔板高度僅為2.0 μm[26]。由于該電驅(qū)動色譜分離方式,仍存在毛細(xì)管電泳固有的技術(shù)壁壘,例如重復(fù)性分析需要較高技術(shù)要求等,但其在高靈敏度蛋白質(zhì)組學(xué)分離領(lǐng)域的應(yīng)用值得期待。

另外,在線色譜分離流速對質(zhì)譜檢測的離子化效率和檢測靈敏度也有著決定性的影響。一方面,通過降低色譜分離流速可以大大降低樣品的溶劑稀釋效應(yīng),從而顯著地提高質(zhì)譜檢測的靈敏度[27,28]。納升高效液相色譜儀在近年來獲得了高速發(fā)展,無論在流速范圍還是在梯度分離穩(wěn)定性上都有了長足的進(jìn)步。然而,目前的商品化納升液相色譜僅能提供50 nL/min以上的流速。相比而言,毛細(xì)管電泳可以穩(wěn)定地提供1～10 nL/min范圍的流速,從而顯著地降低樣品的溶劑稀釋效應(yīng)。另一方面,通過顯著性地降低色譜流速可以顯著地提高質(zhì)譜對離子化多肽的采集效率,因而也能增加質(zhì)譜分析的靈敏度。因此,毛細(xì)管電泳在微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)方面具有天然優(yōu)勢。雖然毛細(xì)管電泳因上樣體積小和柱容量有限,導(dǎo)致單針的最大蛋白鑒定量一直遜于nanoLC-MS。但針對微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析恰好可以充分利用毛細(xì)管電泳上樣量低、峰寬窄、柱效高、流速低和靈敏度高的優(yōu)勢。雖然CE-MS相對于nanoLC-MS定量分析重復(fù)性重現(xiàn)性要差一些,而單細(xì)胞和極少量細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究目前還主要處在定性研究層面,毛細(xì)管電泳的此劣勢也大可規(guī)避。另外,毛細(xì)管電泳技術(shù)的定量重復(fù)性的劣勢也可通過進(jìn)一步結(jié)合穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(例如tandem mass tags標(biāo)記技術(shù))加以解決。

3 CE-MS接口

在CE-MS應(yīng)用中,電噴霧離子化(electrospray ionization, ESI)是最主要使用的多肽離子化方法。基于毛細(xì)管電泳的電驅(qū)動原理,CE-MS的離子化無需額外引入導(dǎo)線,從而可以簡化離子化裝置。然而,由于毛細(xì)管電泳流速極低,易降低ESI離子化效率,從而影響質(zhì)譜檢測靈敏度。目前,CE-MS的ESI離子化接口主要分為兩大類:無鞘液接口和鞘液接口。雖然無鞘液接口是最早出現(xiàn)的(1987年),但目前鞘液接口更為常用。這主要是因?yàn)楹笳呔哂懈玫募嫒菪院虴SI噴霧穩(wěn)定性。同軸流出的鞘液能在電極和毛細(xì)管內(nèi)的緩沖液之間建立電接觸,且能改變毛細(xì)管電泳緩沖液的組成從而提高ESI離子化和質(zhì)譜檢測的兼容性。但鞘液的稀釋效應(yīng)會降低靈敏度,且鞘液與霧化氣引起的抽吸效應(yīng)可能會降低柱效[29]。Dovichi教授團(tuán)隊(duì)在鞘液接口的設(shè)計(jì)方面做出了主要貢獻(xiàn)[21,30,31]。他們設(shè)計(jì)的第一代接口簡化了鞘液接口組成,直接將分離毛細(xì)管柱穿入發(fā)射器里面,通過在毛細(xì)管入口端施加高電壓和在距發(fā)射器一小段距離處施加另一較低的高電壓,不需要額外的機(jī)械泵即可在低鞘液流速下形成穩(wěn)定的電噴霧,消除了發(fā)射器里面的電解作用并且減少了氣泡的形成;第二代接口采用的氫氟酸蝕刻后的毛細(xì)管末端距離發(fā)射器開口更近(約200 μm),使靈敏度提升了約10倍;第三代接口將發(fā)射器開口增加到了約35 μm,解決了前二代接口容易堵塞的問題,極大地延長了接口的壽命,且靈敏度仍與第二代相當(dāng)。他們設(shè)計(jì)的第三代接口已經(jīng)被商品化(EMASS-Ⅱ離子源,CMP Scientific公司)[32]。

相對地,無鞘液接口是將電壓直接加在背景電解質(zhì)上,避免了鞘液的稀釋效應(yīng)?；诖?無鞘液接口可以降低背景信號,并相比鞘液接口提高靈敏度10倍以上[33]。上述特點(diǎn)對于微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析更為重要。然而,這種接口顯而易見的挑戰(zhàn)是在不破壞毛細(xì)管電泳液流的情況下,在ESI噴針上建立起穩(wěn)定的電接觸。目前,建立電接觸主要有兩種方法[20]:一種方法是在不導(dǎo)電的發(fā)射器尖端外面涂上導(dǎo)電涂層,如金、銀、銅、鎳、石墨等,或套上可拆卸的導(dǎo)電的多孔發(fā)射器。然而,由于導(dǎo)電涂層在高壓下的壽命往往較短,大多數(shù)情況下僅能連續(xù)使用數(shù)天。另一種方法是Moini團(tuán)隊(duì)發(fā)明的基于多孔噴針的無鞘液接口[34],是蛋白質(zhì)組學(xué)分析中廣泛使用的無鞘液接口類型。這種接口通過將多孔噴針與加電的背景電解質(zhì)直接接觸即可建立起穩(wěn)定的電接觸。這種多孔噴針的無鞘液接口也已經(jīng)被Sciex公司商品化并應(yīng)用于CESI 8000系列CE-MS儀器上[35]。

另外,如同納升液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用,如何提高CE-MS中的離子化效率以及進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子比例一直是高靈敏度蛋白質(zhì)組學(xué)分析的一大挑戰(zhàn)。一般而言,真正通過ESI電噴霧離子化進(jìn)入質(zhì)譜儀的多肽分子極少,可能低于總樣品量的1%。加拿大UBC大學(xué)的Chen教授團(tuán)隊(duì)發(fā)明了一種加在質(zhì)譜儀入口前端的微型漏斗形裝置[36]。該裝置能將羽狀噴霧下發(fā)散開的霧化離子重新收斂聚集后再進(jìn)入質(zhì)譜儀,從而大大增加進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子數(shù)量,并提高靈敏度2～8倍。類似的裝置若能與無鞘液接口搭配使用,有望進(jìn)一步提高CE-MS的檢測靈敏度。

4 鳥槍法質(zhì)譜分析

2011年,德國馬普生化所Mann教授團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)分析了串聯(lián)質(zhì)譜儀對離子化多肽分子的一級譜采集效率、高豐度離子的在線捕獲效率、碰撞解離效率和二級譜采集以及多肽解析效率[37]。通過系統(tǒng)分析LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù),作者將質(zhì)譜采集的有效梯度時(shí)間內(nèi)一價(jià)以上信號分成了3類:第一類是成功地被一級譜檢測到的多肽特征信號;第二類是所有被一級譜檢測到且被捕獲進(jìn)行了二級譜采集的信號;第三類是在第二類多肽特征信號中具有高質(zhì)量二級譜圖且成功被鑒定多肽序列的信號。令人驚訝的是,在101 726種被質(zhì)譜成功檢測到的第一類多肽特征信號中只有16%(16 924)的多肽分子被成功地捕獲并進(jìn)行二級譜掃描;而所采集的二級譜圖中也只有58%(9 797)的二級質(zhì)譜譜圖可以被成功地用于肽段鑒定。近年來,該團(tuán)隊(duì)在更先進(jìn)的Q Exactive和Q Exactive HF質(zhì)譜儀上進(jìn)行了類似的分析,但獲得了類似的結(jié)論[38]。最近,本團(tuán)隊(duì)也采用具有更高掃描速度的OrbitrapFusion和Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn),也獲得了類似的結(jié)論(未發(fā)表數(shù)據(jù))。盡管過去10年高分辨質(zhì)譜在掃描速度、二級譜采集效率和靈敏度方面都有了飛速的發(fā)展,但相比復(fù)雜度巨大的蛋白質(zhì)組樣品仍然只能捕獲并鑒定很低比例的多肽。

表 1 蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域主要質(zhì)譜儀的最大掃描速度

2016年,美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校Coon團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)地分析了主流納升液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)應(yīng)用于復(fù)雜酶解多肽的分析效率,并獲得了極為不同的結(jié)論[39]。他們發(fā)現(xiàn)在過去的十幾年時(shí)間里,質(zhì)譜硬件有了很大改進(jìn),掃描速度增加了很多倍,但能鑒定到的多肽和蛋白數(shù)量并未有相應(yīng)倍數(shù)增加。Coon等認(rèn)為導(dǎo)致這一現(xiàn)狀的主要原因是復(fù)雜多肽樣品的納升液相色譜分離方面基本沒有改進(jìn),無法進(jìn)一步降低色譜峰寬,從而充分利用先進(jìn)質(zhì)譜儀的高速掃描。表1總結(jié)了到目前為止的蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域主要質(zhì)譜儀的最大掃描速度?；趻呙杷俣葍H有約7 Hz的LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù),Mann等[37]曾預(yù)測質(zhì)譜掃描速度增加到25 Hz以后,樣品中的所有多肽特征信號理論均能被質(zhì)譜儀捕獲并采集二級譜。但事實(shí)上,即使質(zhì)譜掃描速度增加到40 Hz甚至更高,仍然有很大比例的多肽信號沒有被采集二級譜。在動態(tài)排除時(shí)間設(shè)置分別為5 s、15 s和30 s情況下,7 Hz時(shí)質(zhì)譜掃描速度的利用率均為99%左右,但40 Hz時(shí)質(zhì)譜掃描速度的利用率則分別下降到了73%、54%和38%。Coon等[39]認(rèn)為質(zhì)譜高掃描速度下利用率低的原因是質(zhì)譜找不到足夠多可以檢測到的肽段信號,而最有希望解決此問題的方法是改善多肽的分離情況。Coon等進(jìn)一步分析了峰容量與掃描速度間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在低掃描速度下,隨著峰容量提高,多肽鑒定量增加緩慢;而在高于20 Hz的高掃描速度下,多肽的鑒定量很大程度上依賴于多肽分離情況的好壞。例如,在41.3 Hz時(shí),峰容量從接近400增加到略高于1 000時(shí),多肽鑒定量從約15 000增加到了約31 000。在多肽分離得不好時(shí),峰太寬會導(dǎo)致質(zhì)譜只能重復(fù)采集高豐度峰的信號,而低豐度峰由于被排除在數(shù)據(jù)依賴型采集模式(data dependent acquisition, DDA)的TopN序列之外,或由于離子抑制強(qiáng)度低于設(shè)定的強(qiáng)度閥值而不被采集二級譜。正如之前提到的,毛細(xì)管電泳分離所具有的高柱效有望大大降低質(zhì)譜的冗余采集率,進(jìn)而增加對低豐度峰多肽特征信號的捕獲和二級譜采集效率,并最終增加多肽和蛋白的鑒定量。

5 CE-MS應(yīng)用于微量樣品蛋白質(zhì)組學(xué)分析的研究進(jìn)展

在Dovichi等團(tuán)隊(duì)的推動下,CE-MS近年來在微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面展現(xiàn)出了良好的潛力和發(fā)展前景。使用Q Exactive HF質(zhì)譜儀,Dovichi團(tuán)隊(duì)從25 ng HeLa細(xì)胞裂解物中平均鑒定到10 005條多肽和2 158種蛋白[25]。最近,該團(tuán)隊(duì)采用10 μm內(nèi)徑毛細(xì)管進(jìn)行CZE分離和基于Q Exactive HF的平行反應(yīng)監(jiān)測模式檢測(parallel reaction monitoring, PRM),對混于0.25 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)酶解物中的不同濃度的血管緊張肽進(jìn)行分析,檢出限達(dá)到了1 zmol[40]。在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方面,喬治·華盛頓大學(xué)的Nemes團(tuán)隊(duì)分析了單個非洲爪蟾卵裂球的樣品,從20 ng樣品中鑒定到500～800種蛋白[41]。

6 總結(jié)和展望

總之,基于本文的調(diào)研和論述,我們認(rèn)為面向高靈敏度蛋白質(zhì)組學(xué)分析的CE-MS技術(shù)應(yīng)當(dāng)在集成樣品前處理、CE-MS和數(shù)據(jù)分析等多方面進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。集成化在線樣品前處理能減少樣品損失和提高酶解效率,有助于實(shí)現(xiàn)微量蛋白樣品的全流程自動化處理和高靈敏度質(zhì)譜分析。CE-MS領(lǐng)域應(yīng)借鑒nanoLC-MS領(lǐng)域開發(fā)的針對微量樣品的集成化在線樣品前處理方法,盡快實(shí)現(xiàn)對激光顯微切割的微量組織樣品和流式細(xì)胞儀分選的少量甚至單個活細(xì)胞樣品的集成化前處理,以避免微量樣品的轉(zhuǎn)移和盡量減少損失。相比納升液相色譜分離,CE分離峰寬更窄、柱效更高、靈敏度更高,因此高效在線CE分離有望進(jìn)一步提高高分辨質(zhì)譜對微量蛋白質(zhì)組學(xué)樣品中多肽的鑒定效率。毛細(xì)管電色譜所兼具的高柱效和高柱容量有望實(shí)現(xiàn)與生物質(zhì)譜高掃描速度和高靈敏度的完美結(jié)合。DIA和PRM等更高靈敏的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式和match between runs等算法有助于進(jìn)一步提高微量樣品的蛋白鑒定量和定量準(zhǔn)確度。另外,在自頂向下的蛋白質(zhì)組學(xué)方面,密歇根州立大學(xué)的孫良亮組最近報(bào)道了,當(dāng)單針進(jìn)樣量低至1 μg蛋白時(shí),CZE-MS/MS相比nanoRPLC-MS/MS具有明顯的優(yōu)勢[42]。CE-MS應(yīng)用于單細(xì)胞等微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)方面有獨(dú)特優(yōu)勢和良好前景。若能結(jié)合使用適合微量樣品的集成化樣品前處理、無鞘液接口、更高靈敏度的質(zhì)譜,并進(jìn)一步針對微量樣品優(yōu)化質(zhì)譜的參數(shù)和數(shù)據(jù)處理方法,CE-MS應(yīng)用于微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)將能取得更好的應(yīng)用效果和前景。