超重現(xiàn)毛細管電泳的理論與例證

陳 義

(淮陰工學院, 江蘇 淮陰 223001; 中國科學院化學研究所, 中國科學院活體分析化學重點實驗室, 北京 100190;中國科學院大學, 北京 100049; 北京分子科學國家實驗室, 北京 100190)

毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)有豐富的分離模式[1],可從純電泳過渡到純色譜,適用面廣,加上其綠色經(jīng)濟、微量高效、簡便多用等諸多特點,本當前程無量,可事實卻不盡然:CE頗受詬病,多責其不穩(wěn)或不重現(xiàn)。然重現(xiàn)(reproducibility)與重復(repeatability)并不同義。重復對應于精度,多以日內(nèi)、日間相對標準偏差考量;重現(xiàn)乃指變參數(shù)測量,除質(zhì)譜(MS)等少數(shù)方法外,皆不重現(xiàn),非CE之弊。但不重現(xiàn)之CE,有損其定性能力,頗有貽害。因作者長期經(jīng)營CE,不忍其受貶,嘗多方挖掘解決之法,亦作經(jīng)年理論推演,稍有發(fā)現(xiàn),乃作此文。

1 時間測量模式

CE如色譜,皆以時間為變量構(gòu)建測量模式,源頭可能出自牛頓力學第二定律。用其推得電動分離方程為:

(1)

式中m為離子質(zhì)量,μ為淌度,E為電場強度,Fi為阻力,q為離子所帶有效電荷,它們皆與t時間變量關聯(lián)。時間測量自然天成,但貽害不淺。

考慮溶液阻力源于對抗速度,或有∑Fi=fυ,則式(1)解為:

(2)

時間顯于指數(shù),對應于加速。當t>τ后,指數(shù)項可略,μ保持不變。在CE介質(zhì)中,τ僅在皮秒級,所以CE實際是恒速電泳,但須受電泳、電滲和相分配機制共同控制,各有權重加到實測淌度上[1]:

(3)

式中n為溶質(zhì)分子數(shù),μem為離子有效淌度,μos為電滲率,下標sum表示相加、p指相數(shù)。若管中只有兩相,則上式變?yōu)?

(4)

式中下標L表示緩沖液,P表示固定相。CE中的固定相可能是準固定相,也會電泳或隨電滲遷移。k為保留因子,定義為:

(5)

可用離子或中性組分測定。對于中性分子,若固定相不動(tP=∞)并令tos=t0,則k=(tR-t0)/t0,與色譜無異。依公式(3)或(4), CE當作加權淌度譜,但現(xiàn)實CE卻換測時間:

(6)

式中LR為遷移長度,從而忽略了淌度、電場隨距離、時間的變化,引入許多誤差。CE多用弱電解質(zhì)緩沖溶液作介質(zhì),若價數(shù)z+=|z-|=z,則由溶液歐姆定律有:

(7)

式中I為電流強度,S為毛細管內(nèi)橫截面積,F=96 487 C·mol,σ為緩沖液電導率。cefb是緩沖液中電解質(zhì)折合成1-1價后的活度,是解離度α、濃度c(mol/m3)、活度系數(shù)γ和價數(shù)z的乘積。μ0為絕對淌度,下標b表示緩沖液,正負號指示離子。合并式(6)與(7),整理得:

(8)

式中VR=SLR,叫遷移體積。該式清楚顯示,tR與毛細管(S、LR或VR)、電場(E、I、V等)、緩沖液(σ或α、γ、c、z、μ0等)、樣品等4類參數(shù)有關。樣品還受緩沖液影響,它們共同受制于介電常數(shù)、黏度、溫度等;樣品淌度還受電滲和固定相控制。有如此眾多且互相制約因素的影響,tR很難精密,遑論重現(xiàn)。比如改變電壓或毛細管參數(shù)等其他因素,出峰位置即隨之改變。不少文獻報道過用無緩沖能力的“緩沖液”做CE,其α不定,出峰必無法重現(xiàn)。

國內(nèi)外為解決上述問題,提出過不少方法,首要者是穩(wěn)定電滲[2]。電滲遠快于離子淌度,并與管壁狀態(tài)、緩沖液組成、樣品性質(zhì)等都有關系。樣品的非特異性吸附會改變管壁狀態(tài),影響電滲。緩沖液種類、濃度、pH、黏度、介電常數(shù)皆影響管壁基團解離和雙電層結(jié)構(gòu),直接影響電滲。另外,緩沖液濃度等還影響電流和焦耳熱,間接影響電滲,再影響tR。為此,要確保有足夠的緩沖容量并惰化管壁。除規(guī)范清洗毛細管的程序、穩(wěn)定緩沖液pH、黏度等[3-5]外,還可對毛細管壁做專門處理,如加載鍵合[6-9]或動態(tài)涂層[10-14]、施加橫向電磁場[15-18]等。拋光管口、穩(wěn)定進樣也有一定效果。然此類研究至多能提高CE精度,無法改變重現(xiàn)性。管壁涂層因有壽命問題,反而可能降低精度。能在一定程度上改變重現(xiàn)性的方法,是做出峰時間比例譜Rt=tR/tos[9,19]。它以電滲為參考點,能抵消所有影響電滲的因素,但無法作實時測量,需事后分析。一言以蔽之,在時間概念內(nèi)改造CE,至今不太顯效?？磥硇璧锰鰰r間藩籬,發(fā)展非時間測量之法了。

2 非時測量模式

為推導非時間測量方案,需把公式(6)中忽略的因素找回。用式(7)把式(6)變?yōu)?

(9)

若認為遷移距離變量l與σS無關,僅電流密度I/S與t關聯(lián),則：

(10)

這便是遷移指數(shù)即MI法[9],式中i為電流密度。上述假設明顯不太合適,更為普適的假設應為:管內(nèi)灌有均勻的緩沖液做恒溫CE。此時只有αγ、σ、μ的變化微小因而可略,故有:

(11)

式中VR為有效遷移體積,積分了管徑隨距離的變化,可用已知σ和μ體系表征測得。QR是可實時測量的非分析型時間函數(shù),靜電學中叫電量,CE文獻中誤為電通量[20],本文稱其為遷移電量或出峰電量。將式(7)代入并整理得:

(12)

其中ρR=QR/VR為出峰電荷密度或電密度,它與MI類似但隱含條件不同;gR=ρR/cefb是等效于1-1價電介質(zhì)的出峰摩爾電荷密度,簡稱摩爾電密度。公式(12a)與(12b)等價,適用于所有樣品成分,包括離子和分子。若中性分子只隨電滲遷移,可得電滲率測量公式:

(13)

顯然QR、ρR、gR皆可與μ互換,與樣品本質(zhì)屬性關聯(lián),可用于構(gòu)造新的CE測量方式。已知離子有效淌度μem是擴散系數(shù)D、離子半徑r或質(zhì)量m的函數(shù),它們也能用CE測量或反過來構(gòu)造測量模式。由此可以推得至少以下新的CE測量模式:加權淌度譜(weighted mobility spectrometry, WMS)、遷移電量譜(migrated charge spectrometry, MCS)、電密度譜(charge density spectrometry, CDS)、摩爾電密度譜(molar charge density spectrometry, MCDS)、擴散系數(shù)譜(diffusion coefficient spectrometry, DCS)[22]、液相質(zhì)譜(liquid-phase mass spectrometry, LMS)等。下面分別作簡要推導并予例證。

2.1 淌度譜和淌度比例譜

WMS按公式(3)和(12)以加權淌度分離分子和離子,由實時測量Q值作圖,因此與文獻之有效淌度譜[21]不同:后者只針對離子,以μem=μsum-μos繪制譜圖,由時間譜轉(zhuǎn)換而來;前者以實測Q繪制μ的實時譜,不分離子、分子。為高精度測得μ-譜,應棄用μ=LR/(Et)測量而改用μ=σVR/Q測量,其中σVR亦須用已知μ之組分表征測得。與時間譜圖(見圖1a、圖2a)不同,WMS能抵抗E的變化(見圖1b),但不能抵抗管參數(shù)VR等(見圖2b)的變化。

進一步提高淌度譜重現(xiàn)性的方案是做加權淌度比例譜(weighted mobility ratio spectrometry, WMRS):

(14)

式中下標IS表示內(nèi)標,最后一項表明可以直接用電滲做內(nèi)標。比例譜能抵消對分子和分母有相同程度影響的各種因素,但不能抵消影響程度不同的因素。另外,比例譜是非實時的,除非QIS超穩(wěn)定且能事先表征出來。

圖 1 電場強度對CE-LIF之(a)時間、(b)加權淌度、(c)遷移電量和(d)電荷密度譜圖的影響Fig. 1 Impact of electric field strength on (a) time, (b) weighted mobility, (c) migrated charge and (d) charge density spectra measured by CE-LIF CE-LIF: capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence detection. Capillary: 7 cm/13 cm (LR/total length)×50 μm ID; buffer: 5 mmol/L borax at pH 9.20; sample: fluorescein (FITC)-derived amino acids. The time spectra were measured in my lab by Dr. GUO Chao while the others were recalculated and replotted according to equation (12).

圖 2 (a)時間、(b)加權淌度、(c)遷移電量和(d)電荷密度譜隨毛細管和電場的變化Fig. 2 Changes of (a) time, (b) weighted mobility, (c) migrated charge and (d) charge density spectra with capillary size and electric fieldThe conditions are the same as in Fig. 1.

圖 3 電泳緩沖液濃度對(a)加權淌度譜、(b)遷移電量譜、(c)電密度譜和(d)摩爾電密度譜的影響Fig. 3 Impact of buffer concentration on (a) weighted mobility, (b) migrated charge, (c) charge density and (d) molar charge density spectraThe other conditions are the same as in Fig. 1.

2.2 遷移電量譜、電密度譜和摩爾電密度譜

加權淌度譜定義明確,但需經(jīng)Q計算,不如直接做電量譜或Q-譜簡便。由公式(12)可知,Q和μ數(shù)學等價,亦可抗拒電場影響。比較圖1c與圖1b可見,Q-譜比μ-譜精密,因為μ除Q外還受其他參數(shù)精度影響。注意,Q-譜也抵抗不了毛細管和緩沖液參數(shù)的變化。比較圖2c與圖2b及圖3b與圖3a可見,Q-峰變化還遠大于μ-峰,但更有規(guī)律,或許更適合于研究管參數(shù)和緩沖體系對分離的影響。

比Q-譜更穩(wěn)定的是電密度譜(ρ-譜)和摩爾電密度譜(g-譜)。若需更換毛細管,則宜用ρ-譜;若需變化緩沖液,則得換用g-譜。由式(12)可知,ρ-譜已從Q-譜中除去了遷移體積,出峰不再受管參數(shù)和電場強度的影響(見圖2d),但還受緩沖液影響,唯g-譜能抵抗電場、毛細管、緩沖液全部3類因素的影響(比較圖3a、b、c與圖3d)。由式(12b)可知,gR只與緩沖液中的參數(shù)有關,突出了樣品μ的變化,更適合于研究分離效果如何隨緩沖液參數(shù)的影響。實時測量g-譜需要事先表征或計算cefbVR參數(shù)。

g-譜尚未見文獻報道,而ρ-譜有類似的MI譜[11]。不過比較公式(12)和(10)可知,MI僅考慮了i隨時間的變化,而ρ-譜考慮l、t的關聯(lián)變化。

由ρ≈μb/μ可知,凡影響有效淌度的因素必會完全或大部分互相抵消,比如溶液黏度、介電常數(shù)、環(huán)境溫度等。實測表明,ρ-譜受溫度影響不到時間譜的一半(見圖4)。這種對溫控的低要求,有利于CE儀器研制的發(fā)展。但需注意,樣品和緩沖液電解質(zhì)的解離與pH和溫度的關系甚為復雜,不可能完全抵消,圖3d也部分反映了這種差異。

與淌度譜類似,Q-、ρ-和g-譜亦可用比例譜來進一步提高譜圖穩(wěn)定,且互相等價,它們都是淌度比例譜的倒數(shù):

(15)

2.3 擴散系數(shù)譜[22]

將愛因斯坦擴散公式:

(16)

代入公式(4),整理得:

(17)

再由公式(12)得:

(18)

即擴散系數(shù)D正比于T,但T對kB、σ的影響可被q和QR部分抵消。又電滲已被扣減,故在給定溫度時,可測得穩(wěn)定的擴散譜(見圖5)。為簡化測量,一般取k=0做純電泳。更精密重現(xiàn)的測定是擴散系數(shù)比例譜:

圖 4 溫度對遷移時間和遷移電荷密度的影響Fig. 4 Changes of migration time and migrated charge density with temperature Capillary: 50 cm/56.8 cm (LR/total length)×50 μm ID; buffer: 3 mol/L acetic acid and 0.1% (w/v) hydroxyethyl cellulose; sample: 3.0 mg/mL human hemoglobin. The other conditions are the same as in Fig. 1.

圖 5 混合樣品測得的毛細管電泳擴散譜[22]Fig. 5 Diffusion coefficient spectrum measured from a mixed sample by capillary electrophoresis[22] Capillary: 37 cm/55 cm (LR/total length)×75 μm ID; buffer: 10 mmol/L 3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid at pH 9.00; voltage: 10 kV.

(19)

只需向樣品加入一已知擴散系數(shù)的內(nèi)標IS即可。擴散系數(shù)譜和擴散系數(shù)比例譜均需事后重建。但對于給定系統(tǒng),若電滲為零或已知,亦可實時測量擴散系數(shù)譜。

2.4 液相質(zhì)譜

由斯托克斯剛性球黏滯阻力系數(shù)和質(zhì)量密度d關系式,可將式(6)變成:

(20)

假設各離子在同種溶液中密度差異可略,則在給定電泳條件下,可以直接實現(xiàn)LMS測量:

(21)

有電滲和相分配時:

(22)

依據(jù)上式作LMS需事先用標準樣品校正CE系統(tǒng)。為獲得高穩(wěn)定結(jié)果,可換做質(zhì)量比例譜:

(23)

欲使LMS更像MS,可設法“電離”樣品成分(A)。容易設想的液相離子化方法是化學衍生離子化(liquid-phase deriving ionization, LDI)。若忽略衍生對A結(jié)構(gòu)的影響,得到的是啞鈴型產(chǎn)物A-B,則由式(2)與(20)有:

(24)

式中qA和qB分別為A和衍生基團B所帶電荷,rA和rB為兩者單獨時的溶劑化半徑。代入公式(4)并整理后得:

(25)

該公式顯示,A-B的大小可由CE直接測得,若rB已知則可求得rA。CE中的樣品濃度一般很低,多為良溶液,故高分子會無規(guī)卷曲,其溶劑化半徑可由Flory公式給出[23,24]:

rA=2Nnrmo

(26)

式中N是單體數(shù)目,rmo是單體半徑。N與單體之間的斥力有關,無斥力時n=1/2,否則n=3/5。由此可計算A的質(zhì)量mA:

(27)

圖 6 聚乙二醇(5 kD)的(a)LMS和(b)MS譜圖Fig. 6 (a) LMS and (b) MS spectra of polyethylene glycol (5 kD)a. recalculated from the data in ref. [25]; b. replotted from ref. [25].

式中mmo是單體殘基平均質(zhì)量。圖6顯示,LMS(見圖6a)與MS(見圖6b)[25]完全可比。

3 結(jié)論

經(jīng)理論推導和簡明實驗例證,可以肯定CE不僅能精密測量,還能像MS一樣,做高重現(xiàn)測量。關鍵在于思路,要采用非時CE測量方案。本文基于電量Q測量,推導并驗證了加權淌度譜、電量譜、電密度譜、摩爾電密度譜能做實時測量,而擴散系數(shù)譜、液相質(zhì)譜以及各類比例譜一般須實驗后重構(gòu)。這些方法都在一定條件下能成為超穩(wěn)定CE,很有發(fā)展前景和應用潛力,值得深入研究。

致謝 感謝郭超、郭振朋博士提供有關實驗的原始數(shù)據(jù)。