毛細管電泳藥物篩選方法與技術

錢 鑫, 田 晏, 羅欣欣, 潘靜苗, 鄧蘇雅, 黃一可, 付琦峰, 夏之寧*

(1. 重慶大學藥學院, 重慶 401331; 2. 重慶醫(yī)科大學藥學院, 重慶 400016; 3. 西南醫(yī)科大學藥學院, 四川 瀘州 646000)

藥物篩選是使用適當?shù)姆椒ê图夹g,從眾多化合物中篩選出具有藥理活性的化合物的新藥研發(fā)過程。藥物篩選的數(shù)量越大,范圍越廣,發(fā)現(xiàn)新藥的概率也就越大,因此研究人員不斷地對藥物篩選方法和技術提出新要求。

藥物篩選方法之一是以藥代動力學為基礎[1],通過對候選化合物在人體吸收、分布、代謝和排泄的性質以及化學毒性等因素進行綜合評估,篩選出更有開發(fā)價值的化合物。另一種是以藥理活性為基礎的篩選[2],其基本方法是評價藥物與靶點的結合能力以及對靶點功能的影響,從而篩選出具有一定藥理活性的化合物。藥物篩選的方法主要是以相互作用研究為基礎，建立以酶、受體、核酸等化合物為靶點的藥物篩選模型，從而進行化合物的活性評價。

藥物篩選技術較多,目前依靠儀器手段的藥物篩選主要有高通量篩選、高內涵篩選以及微流控芯片篩選等。毛細管電泳(CE)依靠的研究介質體系是水溶液,可以模擬生命介質環(huán)境而進行藥物篩選,且篩選過程不引入其他干擾作用,即能比較準確地反映藥物與靶點的相互作用,又具有效率高、通量可擴展以及試樣量小等優(yōu)點,已成為潛力較大的藥物篩選方法。

1 CE藥物篩選的基本原理

1.1 以藥代動力學相關性質為基礎的篩選

對于結構非特異性藥物,弱酸候選藥物的酸平衡性質(pKa值)以及候選藥物的油水分配系數(shù)(Po/w值)直接影響其藥代動力學參數(shù),從而影響藥效。傳統(tǒng)測定pKa值或Po/w值的方法建立在對候選化合物兩相平衡濃度的測定之上。CE相對于傳統(tǒng)的測定方法,具有速度快、操作簡便、試樣消耗量小等特點,且對化合物的純度要求不高,有多種模式可供選擇,因而在pKa值和Po/w值的測定中展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[3]。

當候選化合物具有弱酸性或弱堿性時,在生物體內將部分解離形成離子型和分子型兩種狀態(tài)。分子型穿過生物膜后解離成離子型發(fā)揮藥理作用,因此藥物篩選的目標是篩選出具有適當解離度的化合物。使用CE測定pKa值基于的是有機酸堿的電離平衡理論,其利用了有效電泳淌度與氫離子濃度[H+]之間的非線性關系[4]。

對于一元弱酸(HA)化合物,溶質的有效淌度(μeff，cm2/(V·s))和緩沖溶液[H+]之間的非線性關系為:

(1)

式中,μA-為藥物離子淌度(cm2/(V·s)),可由候選藥物遷移時間(s)和毛細管的長度(cm)等參數(shù)獲得;Ka為弱酸解離常數(shù)。CE可測得一系列不同酸度下藥物的μeff值,然后通過線性回歸求得Ka值。

藥物Po/w值的測定主要采用膠束或微乳電動色譜法(MEEKC)。該法不受藥物溶解度的局限,并適應任何pH條件,可以通過對一系列已知Po/w的標準品進行MEEKC分析來測定Po/w[5],依據的理論公式為:

(2)

1.2 以相互作用為基礎的CE篩選

運用CE方法分析藥物與靶點的相互作用獲得結合常數(shù)Kb值的藥物篩選方法分為兩類:一類是根據藥物的電泳淌度在受體存在后發(fā)生變化來測定Kb值,方法有親和毛細管電泳法(ACE)[7]和空位親和毛細管電泳法(VACE)[8];另一類是根據配受體結合物離解后的平衡濃度求得Kb,方法主要包括配體分離法(LS)[9]、空位峰法(VP)[8]、Hummel-Dreyer法(HD)[10]和前沿分析法(FA)[11]。

1.2.1親和毛細管電泳

ACE是研究分子間相互作用最常用的方法,該法基于配體-受體相互作用原理進行藥物篩選。1992年,Chu等[12]使用CE對萬古霉素和多種肽進行相互作用研究,從中篩選出了與萬古霉素相互作用最強的肽。隨后,該團隊[7]將這種對物質間相互作用進行研究的方法正式命名為親和毛細管電泳法,同時建立了基于Scatchard方程的分析方法。在此基礎上,Zhang等[13]對該分析方法進行了改進,利用淌度比對Kb值進行求解,這一改進消除了毛細管長度、黏度與運行電壓對測定結果的影響,從而提高了ACE在藥物篩選中的重現(xiàn)性。

ACE依據受體或配體在發(fā)生親和作用后有效電泳淌度的變化進行Kb值的求解。可供選擇的受體-配體體系有:蛋白質(P)與藥物(D)、DNA與藥物、抗體與抗原、酶與底物等。

(3)

經過推導后,可得到Scatchard方程:

(4)

對其進行變形可得到:

(5)

(6)

公式(4)、(5)、(6)分別為雙倒數(shù)法、y-倒數(shù)法和x-倒數(shù)法。μD代表游離藥物淌度(cm2/(V·s)),μPD代表復合物淌度(cm2/(V·s)),μP-PD代表游離和結合兩種形態(tài)蛋白質共同貢獻的淌度(cm2/(V·s))。采用以上3種方法作圖均可求得結合常數(shù)Kb值:雙倒數(shù)法以1/(μP-PD-μD)對1/[P]作圖,所得直線的截距與斜率之比為Kb值;y-倒數(shù)法以[P]/(μP-PD-μD)對[P]作圖,所得直線的斜率與截距之比為Kb值;x-倒數(shù)法以(μP-PD-μD)/[P]對μPD-μD作圖,所得直線的斜率即為Kb值。利用此方法,Li等[14]對布洛芬和阿司匹林與血清白蛋白之間相互作用進行了研究,比較了它們的Kb值;Katriina等[15]也研究了載脂蛋白B與6-硫酸軟骨素的相互作用。

1.2.2動力學毛細管電泳(KCE)

在藥物篩選的過程中,結合常數(shù)Kb、配受體的正向結合速率常數(shù)Kon和反向解離速率常數(shù)Koff是3個有意義的參數(shù)。其中,Kon和Koff是表征配體和受體間結合速率、指導藥物在體內藥代動力學應用,以及藥物起效快慢、對機體作用程度的參數(shù)。ACE只能測定結合常數(shù)Kb值。2005年,Krylov團隊[16]提出了動力學毛細管電泳,除了可以測定Kb,還能測得動力學常數(shù)Kon和Koff。

藥物靶分子(T)與配體分子(L,生物大分子)首先進行親和相互作用,隨后通過電泳將具有不同遷移速率的藥物靶分子、配體分子和結合物(C)進行分離,通過建立數(shù)學方程式描述KCE的傳質過程,并求解出動力學參數(shù)Kon、Koff和Kb等。按照不同的初始條件和邊界條件,將KCE分為7種模式[17],如表1所示,即平衡混合物的非平衡CE(NECEEM)、平衡混合物的平衡CE(ECEEM)、掃集CE(Sweep CE)、區(qū)帶順進CE(ppKCE)、連續(xù)平衡混合物之非平衡CE(cNECEEM)、短掃集CE(sSweep CE)和平衡混合物之短掃集CE(sSweep CEEM)。表中均假設T的遷移速率大于L的遷移速率。

表 1 7種動力學毛細管電泳示意圖

1.2.2.1NECEEM與ECEEM

NECEEM最早用于蛋白質-DNA相互作用的研究[18],其過程包括將靶標、配體事先混合孵育,使其達到平衡狀態(tài)后進樣,根據混合物中T、L以及T-L復合物淌度的不同進行電泳分離,背景緩沖液中不存在T,造成T-L復合物在電泳過程中不斷解離,該分離在非平衡狀態(tài)下進行。該方法可通過一次電泳測定Kb和Koff,進一步求得Kon。

NECEEM可以作為一種單通量的藥物篩選方法,以法尼基轉移酶(PFTase)為模型靶標蛋白,通過NECEEM方法測得篩選前DNA文庫的解離常數(shù)Kd值,然后將平衡混合物中PFTase的濃度改為nmol/L級別,使用該法在一輪篩選后得到了Kd值為nmol/L級別的DNA適配體,篩選前后DNA文庫的整體親和力增加了200倍,該報道[19]首次將NECEEM方法引入核酸適配體的篩選中,高效、準確的特點令其成為篩選核酸適配體的主要方法。

與NECEEM不同,ECEEM的分離是在運行緩沖液中含有相同濃度T的條件下進行的,即T-L復合物在分離過程中始終保持平衡狀態(tài)。ECEEM的獨特之處在于,具有不同Kd值的配體以不同且可預測的遷移率遷移。因此,選擇具有不同遷移率的組分會得到具有不同且可預測的Kd值的配體[20],能在復雜的候選藥物共存體系中發(fā)揮篩選評價作用。

除了單獨使用,也可以將NECEEM和ECEEM結合,用于DNA編碼化合物的篩選[21]。以碳酸酐酶Ⅱ(CA Ⅱ)為模型靶蛋白,模型庫中包含與CA Ⅱ親和力強(Kd=490 nmol/L)的DNA編碼苯甲酰胺(DNA-BSB)和親和力弱(Kd?100 μmol/L)的DNA編碼色胺(DNA-tryptamine),其比例為1∶105。在兩輪篩選后,成功將混合庫中DNA-BSB與DNA-tryptamine的比例升至11∶1,且DNA-tryptamine的量低于聚合酶鏈式反應(PCR)的檢出限,與預測情況相符。該報道[21]證明了使用NECEEM和ECEEM結合的方法不僅可以對篩選的配體進行定性,還可對其定量,有望用于篩選海量的DNA編碼化合物庫。

1.2.2.2Sweep CE

與NECEEM不同,Sweep CE不用預先孵育平衡混合物,而是使毛細管內都具有L,并將T裝于入口瓶中。由于L的電泳淌度小于T,電泳開始后,T不斷穿過L并與之形成C。Sweep CE主要研究的是L、T的結合過程,因此可直接測定Kon。Krylov課題組[22]利用該法研究了單鏈DNA結合蛋白和15聚體DNA寡核苷酸之間的相互作用,并測得Kon。

1.2.2.2ppKCE

ppKCE與NECEEM類似,但沒有預先注入平衡混合物,而是將T和L以區(qū)帶的形式注入充滿運行緩沖液的毛細管中。電泳開始后,T穿過L形成C,并伴隨有C的解離。因此ppKCE可通過一次過程直接測定Kon和Koff[16,23]。ppKCE主要用于考察蛋白質和DNA間的相互作用,本課題組[24,25]在前人的基礎上將ppKCE擴展到蛋白質與小分子間相互作用的研究上,研究了其與西酞普蘭、依匹斯汀、加替沙星及羅沙替丁間的相互作用,并測定了Kon、Koff及Kb值。其他諸如cNECEEM、sSweep CE和sSweep CEEM等方法也都各有特色,并成為潛在的CE藥物篩選方法。

1.2.3配體分離法

Heegaard等[9]曾使用另一種方法對結合常數(shù)進行求解,并將其稱為配體分離法。LS與ACE和KCE最大的區(qū)別是其依據濃度變化進行相互作用分析。該方法的運行緩沖液中不含有蛋白質或者藥物,而是將相同濃度的蛋白質和藥物預先混合作為樣品,待結合達到平衡后進入毛細管。游離藥物和結合物的濃度隨蛋白質濃度的變化而變化,根據這些變化便可計算得到蛋白質和藥物之間的結合常數(shù)Kb值。對蛋白質純度的要求較低是LS的主要優(yōu)點。利用此方法,Wang等[26]測定了牛血清白蛋白(BSA)與其單克隆抗體的Kb值;張勃等[27]也測定了抗真菌藥物棘球白素B的母核與其多克隆抗體之間的結合常數(shù),并建立了以結構為基礎的藥物篩選模型。該法存在一定的局限性,因為要求配體與受體的結合能力足夠強,生成的結合物足夠穩(wěn)定,以保證使用該方法時不會因為結合藥物的解離而對游離藥物含量的測定產生影響。

表 2 毛細管電泳相互作用分析方法

1.2.4其他方法

VACE與ACE原理基本相同,區(qū)別在于VACE依據兩個負峰遷移時間的變化計算結合常數(shù)[28]。Busch等[29]曾將VACE用于萬古霉素與N-Ac-d-丙氨酰-d-丙氨酸組成的體系進行相互作用的研究,其結果與ACE所得結果具有良好的一致性。VP與VACE的操作類似,不同的是VP法要求溶質和配體有相近的淌度[8]。Busch等[8]利用此方法研究了華法林與BSA的相互作用,并測定了Kb值。HD主要是通過測定游離藥物負峰的面積得到游離藥物的濃度,從而計算得到Kb值[10]。Quaglia等[30]用該法測定了α-酸性糖蛋白(AGP)與頭孢曲松之間的Kb值。FA通過向毛細管中注入藥物、蛋白質及藥物-蛋白質復合物形成的平衡樣品混合物,依據遷移率的不同進行分離[11]。Ding等[31]用該法研究了堿性藥物與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用,并測得結合常數(shù)Kb值與結合位點數(shù)n。

這些方法各有特點,應依據研究中的不同情況選擇適宜的方法,表2為這些分析方法的匯總。

1.3 CE篩選應用體系

CE藥物篩選中，與藥物作用的對象有許多,如核酸、蛋白質(包括抗體和酶等)等生物分子和細胞膜、細胞(細菌),其中一些價格昂貴,難以獲得。CE的樣品用量在nL級別,能在類似于生命介質的環(huán)境下運行,已應用于生物分子與配體的相互作用研究和篩選。

1.3.1以蛋白質為作用對象

以蛋白質為受體的CE藥物篩選技術包括以下幾類體系:

第一類是血漿蛋白。由于藥物進入人體發(fā)揮藥理作用的過程中需要與血漿蛋白結合,因此對蛋白質與藥物的結合特性，諸如結合位點數(shù)、結合常數(shù)等進行研究對新藥的篩選具有較大意義。郭寶元等[32]在CE相互作用分析中發(fā)現(xiàn),采用峰漂移法對藥物與蛋白質進行相互作用研究比其他方法效果更好。在此基礎上,該團隊對麻黃堿、咖啡因、撲熱息痛與BSA的相互作用進行了研究。Jiao等[33]綜述了中藥有效成分與血漿蛋白結合的常用分析方法,總結了不同類型中藥活性成分與血漿蛋白結合的規(guī)律。

第二類是抗原(Ag)。建立在抗體(Ab)和抗原間特異性免疫反應的方法稱為免疫分析,將CE應用于免疫分析領域,便形成了一種新型的免疫分析技術,即CE免疫分析法(CE immunoassay, CEIA)。Hurrell等[34]于1986年便將CE用于免疫分析領域研究中。Luo等[35]對CEIA進行綜述,并將CEIA分為競爭性與非競爭性兩種。競爭免疫分析法通過對受標記的抗原-抗體復合物[Ag*-Ab]和[Ag*]兩個峰的信號進行比較,可計算得到[Ag]的含量。而在非競爭免疫分析則通過檢測[Ab*-Ag]與過量的[Ab*]的峰信號實現(xiàn)定量分析,抗原、抗體的標記物可為放射性同位素、酶、化學發(fā)光劑等。競爭性分析適用于低分子量的抗原或抗體分子;而非競爭性分析適用于分子量較大的蛋白質。利用CEIA法,Liu等[36]對阿霉素及其單克隆抗體進行了研究,建立了依據熒光特性的抗癌藥物分析方法。張勃等[27]將CE技術與結構篩選結合起來,建立了以結構為基礎的藥物篩選模型,用于具有抗原類似結構的化合物的篩選。該藥物篩選模型具有高特異性、高篩選效率的優(yōu)點。

第三類是具有催化功能的酶,當前對酶抑制劑的活性評價與篩選逐漸成為研究熱點之一?？到浳涞萚37]綜述了CE在天然產物中酶抑制劑篩選的研究進展,并總結了轉移酶、水解酶及氧化還原酶的抑制劑在CE篩選中的研究成果。在CE篩選中,酶抑制劑的篩選主要有柱前酶反應模式和在柱酶反應模式這兩種不同的分析方法。而根據是否將酶固定在毛細管中,在柱酶反應模式又可分為電泳中介微分析(EMMA)與固定化酶微反應器(IMER)兩種模式。

EMMA技術于20世紀90年代初期,由Bao等[38]首次提出:利用游離的酶與底物在電場下具有不同的遷移速度,通過擴散作用,使其混合均勻,并根據電泳淌度的差異進行分離。王海榮等[39]采用該技術對抗癌藥物的熱門靶點進行了研究,建立了氨肽酶N抑制劑的篩選模型,為抗癌藥物的篩選提供了新的方法。

IMER技術通過適宜的方法將酶固定于毛細管內壁,將待篩選的樣品與底物混合后進樣,測定產物的峰面積并將其與僅底物進樣時的產物峰面積進行對照，判斷樣品對酶的抑制能力,以此達到對酶抑制劑進行篩選的目的。該法將酶固定于毛細管中,因此具有良好的穩(wěn)定性,此外還有可重復利用以及樣品消耗少等優(yōu)勢。Cheng等[40]采用IMER法對胰蛋白酶進行固定化并實現(xiàn)了對15種中藥成分進行酶抑制劑的在線篩選,證實了黃芩苷對凝血酶的抑制活性。

1.3.2以細胞(細菌)為作用對象

CE在細胞水平上的藥物篩選體系主要包括細胞-配體[41],細菌-配體[42]以及細胞膜-配體[43]。CE以水溶液為介質,接近人體真實環(huán)境,并具有微型化和高通量等特點,已成為細胞水平上藥物篩選的有力工具。夏之寧等[32]使用ACE方法對細胞和藥物進行了研究,對麻黃堿、咖啡因和腎上腺素與紅細胞的相互作用進行了比較。Li等[44]研究了喹諾酮類藥物與細菌之間的相互作用,基于細菌與抗菌對映體的立體選擇性和親和性,建立了一種細菌手性選擇分離氧氟沙星的新方法,為對映體分析、手性藥效學和手性藥代動力學研究提供了新途徑。Xia等[43]將細胞膜作為假固定相采用CE峰漂移法測定了西酞普蘭和兔紅細胞膜的Kb值,后又以ppKCE為理論基礎測定了多種藥物與紅細胞膜的相互作用[24]。

1.3.3以核酸為作用對象

絕大部分藥物都是以受體分子、酶、離子通道為作用靶標,以核酸(DNA或RNA)為靶標的藥物主要包括抗菌藥、抗病毒藥及抗腫瘤藥物。以核酸為靶標的藥物篩選技術有濾膜結合試驗、凝膠滯后試驗、表面等離子共振以及基于熒光的高通量篩選技術等,目前尚無CE應用于以核酸為靶標的藥物篩選相關報道,但由于CE可在類似于生命介質的環(huán)境下進行并具有微量快速分析的特點,可以預見該類藥物的CE篩選將很快出現(xiàn)。

1.4 CE篩選藥物的類型

1.4.1核酸適配體

核酸適配體是從大量的核酸分子文庫中篩選出的短鏈寡核苷酸,能與許多目標物特別是蛋白質特異性結合,而且穩(wěn)定性好,容易制備及修飾,被廣泛應用于各個領域。指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(SELEX技術)是篩選適配體的經典方法,但在配體靶標復合物與游離配體分離技術上遇到了瓶頸。CE篩選過程是在溶液相中完成,無須介質固定,且篩選成本低,速度快。自2004年Bowser等[45]首次將CE和SELEX技術結合,該技術不斷發(fā)展并在核酸適配體篩選上展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢,被認為是核酸適配體篩選的最高效方法。

基于CE-SELEX，有3種主要的動力學篩選模式:NECEEM模式、ECEEM模式和non-SELEX模式。Berezovski團隊[19]采用NECEEM模式對8種適配體進行了藥物篩選。在這些適配體中,獲得了對PFTase具有nmol/L級親和力的最佳適配體,其Kd值為0.5 nmol/L。這些結果證明了NECEEM可以作為開發(fā)和利用寡核苷酸適配體的通用工具。隨后,該團隊進行了h-Ras蛋白的核酸適配體篩選,證明了基于NECEEM的non-SELEX篩選技術無須PCR擴增,且篩選效率高[46]。

屈鋒團隊[47,48]自2007年開展CE-SELEX以來,已用多種CE-SELEX篩選模式成功篩選出多尺度靶標(如小分子、蛋白質、細胞和微生物)的核酸適配體,并對篩選核酸適配體的CE方法進行了系統(tǒng)綜述。楊歌等[49]將80 nt的單鏈DNA庫與鹽酸克倫特羅混合孵育,篩選出親和力較強的3條序列,為小分子靶標的核酸適配體篩選奠定了基礎;同樣,他們[50]也用CE-SELEX技術篩選出了人免疫球蛋白G(IgG)Fc片段的核酸適配體,該適配體未來可能用于IgG效應功能的調控。

1.4.2天然藥物

天然藥物可能具有十幾種甚至更多成分,往往不易進行分離分析,這給單獨活性評價帶來困難。而CE具有對多成分復雜體系分離的能力,因此使用CE對天然藥物進行研究十分普遍,且分離分析的同時可進行活性篩選。Huang等[51]利用CE分離和鑒定油菜提取物，并評價了其中酚酸和類黃酮物質的抗氧化活性。Tsukagoshi等[52]、Yang等[53]和夏之寧等[54]均使用基于魯米諾反應的CE-CL聯(lián)用技術對天然藥物中抗氧化活性進行了研究,豐富了天然藥物抗氧化劑的CE篩選基礎工作。

2 CE藥物篩選相關技術

2.1 化合物庫篩選技術

DNA編碼化合物庫(DECL)技術是一種在分子水平進行藥物發(fā)現(xiàn)的高效方法,具有海量化合物成員數(shù)量、超高效篩選速度等特點,被制藥界公認為近年來創(chuàng)新藥物領域發(fā)展最快速且最重要的手段之一[55]。迄今,通過DECL技術已成功篩選出若干臨床化合物。例如葛蘭素史克公司的針對可溶性環(huán)氧化物水解酶的抑制劑GSK2256294[56],以及針對受體相互作用蛋白I的首創(chuàng)新藥GSK2982772[57]。Drabovich等[58]充分利用DECL在藥物篩選中高通量、高效率的優(yōu)勢,將這種先進的DECL技術與CE技術進行結合。利用CE中DNA-小分子耦合物、靶標蛋白、DNA-小分子耦合物與靶標蛋白復合物這3類物質間的電泳淌度不同來分離,從而達到在同相中進行藥物篩選的目的。

2.2 餾分收集技術

雖然試量小是毛細管電泳的優(yōu)點,但是極微量的樣品經分離后的餾分收集是CE的一大問題,因此關于CE的餾分收集鮮有報道。在使用CE進行藥物篩選的過程中,需要將毛細管內特定區(qū)域的餾分收集起來進行二次鑒定,如未知成分需進行MS檢測,未知序列的DNA需經PCR后測序等。

應用CE餾分收集技術,得以將CE和SELEX結合,成為篩選親和力為nmol/L級別的抗IgE適配體技術[45]。采用傳統(tǒng)的SELEX技術,與靶標蛋白結合緊密的DNA很難從色譜柱上洗脫下來,SELEX與CE結合后,DNA復合物與游離DNA淌度有明顯差異而得以分離,再應用CE餾分收集技術回收篩選出的DNA。non-SELEX方法[19]以確定收集窗的方式收集餾分,進行多次NECEEM分離,將ssDNA庫的親和力提高了5個數(shù)量級,篩選效率大大提升。羅昭鋒等[59]將餾分收集毛細管電泳(fraction collection CE, FCE)與SELEX技術結合提出了FCE-SELEX方法,他們將收集窗分成小段,分開收集,根據逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的循環(huán)次數(shù)確定結合復合物的位置,僅用一輪篩選就獲得了親和力為nmol/L級別的鏈霉親和素適配體。該方法一改前面大范圍收集的作風,提出了分段收集的新概念,是CE藥物篩選餾分收集方法的新舉措。

2.3 CE-CL聯(lián)用技術

將CE與自由基氧化發(fā)光反應體系進行結合,便可構建毛細管電泳-化學發(fā)光聯(lián)用裝置[60],該裝置的原理是自由基可使發(fā)光試劑氧化發(fā)光,而抗氧化劑對自由基的清除作用可造成化學發(fā)光受到抑制,通過對抑制程度進行測定，實現(xiàn)抗氧化活性的評價。在CE-CL基礎上進一步發(fā)展,構建紫外吸收-化學發(fā)光雙檢測系統(tǒng),可以實現(xiàn)對多組分復雜樣品的篩選。因此可將其應用到中藥復雜體系中,對篩選天然產物中的抗氧化劑具有重要的應用價值。

2.4 CE-MS聯(lián)用技術

毛細管電泳-質譜聯(lián)用技術不僅具有CE對復雜體系的高效分離能力,同時具有質譜對組分的強大鑒定能力。CE可以將眾多化合物成分進行分離,同時根據化合物之間的相互作用能力差異,篩選出候選化合物。MS能將這些候選化合物進行定性,有利于微量，甚至超微量的組分鑒定。因此,這種雙重功能使CE-MS技術成為一種有潛力的藥物篩選手段。例如,對酶的活性評價及酶抑制劑篩選中,Hoffmann等[61]基于CE-ESI-MS/MS研究了α-胰凝乳蛋白酶(α-CT)與5種酶抑制劑的相互作用,并對其親和力進行了比較,MS的高靈敏性以及對目標化合物的識別能力彌補了CE無法定性的問題。兩者的配合使用使得基于相互作用所篩選的候選藥物更加有效和準確。Langmajerova[62]利用毛細管的層流剖面橫向擴散原理,使CE-MS聯(lián)用中的毛細管兼具酶反應器和分離柱兩個功能。在一次實驗中對細胞色素P450酶(CYP2C9)與底物的反應產物進行了定性和定量分析,這種方法可作為新藥開發(fā)早期篩選潛在候選藥物的有效工具。Li等[63]首次采用ACE分析方法,利用CE-MS技術建立了快速篩選并在線測定結構的方法,成功地在甘草提取物中發(fā)現(xiàn)了兩種與包膜蛋白gp120的核心靶點R15K有顯著相互作用的化學成分,并在細胞水平的生物活性實驗中進一步證實了它們抗艾滋病(HIV)的活性。這為在天然產物中發(fā)現(xiàn)HIV抑制劑提供有利的篩選手段。

2.5 微流控芯片

微流控芯片(microfluidic chip)是將樣品制備、反應、分離及檢測集成于一體的分析裝置,其與CE的結合使之具備了高通量的優(yōu)勢,這是傳統(tǒng)CE不具備的。微流控芯片自開始就在DNA及蛋白質領域顯示出極強的功能,目前已被廣泛用于其他化合物的研究。Tokuyama等[64]利用微流控芯片，監(jiān)測肥大細胞的組胺釋放過程,并將其應用于抗過敏藥物的篩選。Wu等[65]開發(fā)了一種新型多層微流控裝置,用于表征人肝微粒體中的藥物代謝及細胞毒性,展示了微流控芯片在藥物開發(fā)中進行高通量藥物篩選的潛力。

3 結論與展望

回顧歷史,人們利用CE技術進行藥物篩選的研究已經走過了30年的路程。隨著藥物篩選的需求不斷擴大,基于CE的藥物篩選技術具有潛在的優(yōu)勢和廣闊的應用前景。但是因為CE試樣用量小的特點和餾分收集困難等缺點,使之與HPLC相比一路走來顯得進展緩慢,應用范圍及效果不盡人意。然而,隨著多種聯(lián)用技術的發(fā)展,包括聯(lián)用進樣技術、聯(lián)用檢測技術和餾分收集技術等,CE在藥物篩選中嶄露出新的頭角。更重要的是,CE與其他手段相比具有獨特的優(yōu)勢,包括篩選環(huán)境更接近于生命介質體系、藥物與靶點間的相互作用受外力影響較小、有較多靈活的評價與篩選的方法。這使得CE在藥物篩選領域的應用潛力不斷增加,目前已出現(xiàn)了許多可以借助CE優(yōu)勢的藥物篩選探索,例如適配體篩選、中藥等復雜多組分體系篩選和DNA編碼化合物庫藥物篩選等。相信利用CE進行藥物篩選的良好前景盡在眼前。