膠束電動(dòng)色譜柱上酶反應(yīng)測(cè)定低分子量肝素的抗凝血活性

張明瑜, 康經(jīng)武

(生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 上海 200032)

肝素是臨床上廣泛使用的抗凝血藥物。低分子量肝素(LMWHs)是普通肝素通過化學(xué)或酶解方法解聚得到的[1]。肝素與抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)結(jié)合后引起ATⅢ構(gòu)象的改變,從而將ATⅢ抗凝血酶活性提高1 000倍[2]。與普通肝素相比,低分子量肝素的抗凝血因子10(FXa)與抗凝血酶比例增大,其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)更易預(yù)測(cè),半衰期較長(zhǎng),且副作用較小。因此,LMWHs逐漸取代了普通肝素成為臨床抗凝血藥物的首選[3]。對(duì)于某些特殊的患者,如孕婦、兒童、腎衰竭患者、肥胖癥患者及肝素耐受患者,在使用LMWHs治療時(shí)需要監(jiān)測(cè)血液中藥物的抗凝血活性[4]。

肝素抗凝活性的測(cè)定方法有很多種。傳統(tǒng)方法是凝血實(shí)驗(yàn),包括活化部分凝血時(shí)間測(cè)定實(shí)驗(yàn)(activated partial thromboplastin time, APTT)、活化凝血時(shí)間測(cè)定實(shí)驗(yàn)(activated clotting time, ACT)和凝血酶原時(shí)間測(cè)定實(shí)驗(yàn)(prothrombin time, PT)。這些方法在監(jiān)測(cè)異常出血征兆及抗凝血治療過程中發(fā)揮了重要作用。但是采用凝血實(shí)驗(yàn)測(cè)定肝素的抗凝活性時(shí),不同實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定的結(jié)果往往有較大偏差[5]。與之相比,基于分光光度法的生色底物法靈敏度高,且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,已成為臨床測(cè)定LMWHs抗凝血活性的黃金標(biāo)準(zhǔn)[6]。雖然如此,但這個(gè)方法仍然有其局限性。不同批次的生化試劑間活性差異會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差[7];在檢測(cè)全血樣品時(shí),樣品基質(zhì)會(huì)影響分光光度法檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。此外,該方法所需樣品量和試劑量相對(duì)較大,也增加了測(cè)試成本。Harris等[8,9]為了消除樣品基質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響,發(fā)展了測(cè)定LMWHs抗凝血活性的熒光方法,顯著提高了靈敏度。色譜可以將反應(yīng)混合物分離后進(jìn)行在線檢測(cè),是研究酶活及酶抑制劑篩選的強(qiáng)有力工具。2013年,我們課題組發(fā)展了體積排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)測(cè)定LMWHs的抗凝血活性[10]。這一方法實(shí)現(xiàn)了在線混合、反應(yīng)、分離及檢測(cè)的一體化和自動(dòng)化,顯著減少了樣品量和試劑用量,提高了靈敏度。毛細(xì)管電泳(CE)是一種與HPLC互補(bǔ)的液相分離技術(shù),其中膠束電動(dòng)色譜(MEKC)是CE的一種分離模式。MEKC采用膠束電解質(zhì)溶液,實(shí)現(xiàn)了毛細(xì)管電泳對(duì)電中性樣品的分離分析。與HPLC相比,CE分離時(shí)間短,樣品和試劑消耗量少,更容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。

本工作的目的是發(fā)展膠束電動(dòng)色譜結(jié)合柱上酶微反應(yīng)的方法用于測(cè)定低分子量肝素(依諾肝素鈉)的抗凝血活性。該方法以毛細(xì)管進(jìn)樣端作為微量的酶反應(yīng)器,將依諾肝素鈉、ATⅢ、FXa和生色肽底物(CPS)溶液依次進(jìn)樣,分別采用自由擴(kuò)散、層流橫向擴(kuò)散及電壓混合模式,實(shí)現(xiàn)反應(yīng)物間的混合。待孵育反應(yīng)結(jié)束后,直接進(jìn)行電泳分離和檢測(cè)。為避免緩沖溶液中十二烷基磺酸鈉(SDS)對(duì)ATⅢ和FXa活性的影響,實(shí)驗(yàn)采用了部分填充膠束電動(dòng)色譜模式。采用柱上酶反應(yīng)不僅降低了樣品和試劑的消耗量,還實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的自動(dòng)化。MEKC可以將酶反應(yīng)產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺(p-NA)與樣品中的其他物質(zhì)分離,因此可以在對(duì)硝基苯胺的最大吸收波長(zhǎng)(380 nm)下進(jìn)行測(cè)定,提高了測(cè)試的靈敏度。為了保證方法的重復(fù)性和定量準(zhǔn)確性,實(shí)驗(yàn)使用呋喃妥英(NF)作為內(nèi)標(biāo)。通過方法的驗(yàn)證,證明了該方法具有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和材料

磷酸氫二鈉·12H2O、氯化鈉、二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na·2H2O)、聚乙二醇6000 (PEG 6000)、SDS和氫氧化鈉(NaOH)均購(gòu)自阿拉丁有限公司(上海)。鹽酸購(gòu)自上海第四試劑廠(江蘇昆山)。依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)藥典(USP); CPS(序列:CH3OCO-D-Val-Gly-Arg-para nitroaniline)、p-NA、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二甲亞砜(DMSO)和NF均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó))。ATⅢ(1×25 IU)和FXa(10×71 nkat)購(gòu)自Chromogenix公司(意大利)。甲醇(HPLC級(jí))購(gòu)自Fisher Scientific公司(美國(guó))。兩個(gè)批次的LMWHs(依諾肝素鈉)分別來(lái)源于賽諾菲-安萬(wàn)特(Sanofi Aventis公司,法國(guó))和杭州九源基因工程有限公司。

1.2 溶液的配制

分別配制2 mol/L Tris、2 mol/L NaCl、0.5 mol/L磷酸氫二鈉、0.5 mol/L SDS、1 mol/L HCl、0.5 mol/L EDTA和10%(v/v)PEG 6000儲(chǔ)備液。

使用上述儲(chǔ)備液分別配備分離緩沖液(40 mmol/L磷酸鹽緩沖液,其中含有25～45 mmol/L SDS, pH 7.4)、反應(yīng)緩沖液(50 mmol/L Tris-H3PO4,含有150 mmol/L NaCl, pH 7.4)和用于產(chǎn)生橫向擴(kuò)散的Tris PEG 6000緩沖液(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl和0.1%PEG 6000, pH 7.4)。以上溶液均使用1 mol/L H3PO4調(diào)節(jié)pH值。

使用水-乙醇(90∶10, v/v)配制5 mmol/L對(duì)硝基苯胺儲(chǔ)備液,使用DMSO-水(10∶90, v/v)配制0.1 mol/L呋喃妥英儲(chǔ)備液。對(duì)硝基苯胺和呋喃妥英工作液在使用前由儲(chǔ)備液稀釋而得?？鼓窤TⅢ溶液溶解為5.0 IU/mL的儲(chǔ)備液,然后使用含有PEG 6000的Tris緩沖液稀釋為1.0 IU/mL的工作液。配置7.1 nkat/mL的凝血因子FXa溶液作為工作液。首先用水配制3 mmol/L的生色肽底物儲(chǔ)備液,使用前用pH 7.4反應(yīng)緩沖液稀釋得到0.5 mmol/L的生色肽底物工作液。用水溶液配制1.0 IU/mL的依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(S),然后按0.78的劑間比,用pH 7.4反應(yīng)緩沖液分別稀釋至0.087、0.111、0.143和0.183 IU/mL，分別用S1～S4表示。首先對(duì)供試品預(yù)估一個(gè)效價(jià),按照標(biāo)準(zhǔn)品配制的方法,配制含量為0.087、0.111、0.143、0.183 IU/mL的依諾肝素鈉工作溶液，分別用T1～T4表示。所有溶液均由超純水配制(Millipore超純水系統(tǒng),Millipore公司,USA),配制好的溶液置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存,所有緩沖溶液在使用前用0.45 μm濾膜過濾。

1.3 CE分離條件

所有的CE實(shí)驗(yàn)均在配有UV檢測(cè)器的P/ACE MDQ CE系統(tǒng)(Beckman Coulter公司,美國(guó))上進(jìn)行。熔融石英毛細(xì)管柱:50 μm i.d.、365 μm o.d.、總柱長(zhǎng)30 cm、有效長(zhǎng)度19.5 cm,購(gòu)自邯鄲鑫諾光纖色譜。新的毛細(xì)管柱用0.1 mol/L NaOH溶液活化30 min,再用超純水和電泳緩沖液分別沖洗2 min。每一次分析前用0.1 mol/L NaOH、超純水和電泳緩沖液分別沖洗2 min。毛細(xì)管柱溫為25 ℃,分離電壓為15 kV。除非另外說(shuō)明,UV檢測(cè)波長(zhǎng)均為380 nm。

圖 1 反應(yīng)物在毛細(xì)管內(nèi)的層流橫向擴(kuò)散混合示意圖Fig. 1 Schematic presentation for mixing reactants inside the capillary by transverse diffusion of laminar flow a. two reactants are injected; b. apply a short-time injection with high pressure; c. let stand to mix the two reactants completely.

柱上酶反應(yīng)進(jìn)樣步驟如下:(1)依次將依諾肝素鈉待測(cè)溶液和ATⅢ溶液以壓力140 Pa進(jìn)樣3 s,靜置1 min使兩種溶液通過自由擴(kuò)散混合;(2)隨后以壓力140 Pa導(dǎo)入FXa溶液3 s,在200 Pa壓力下進(jìn)樣含有PEG 6000的Tris緩沖液(pH 7.4)3 s,使FXa溶液以圖1所示的層流橫向擴(kuò)散的方式與依諾肝素鈉和ATⅢ復(fù)合物混合,靜置1 min; (3)將CPS溶液以壓力140 Pa進(jìn)樣15 s后,施加3 kV電壓0.3 min,使FXa與ATⅢ進(jìn)一步混合,靜置4 min; (4)最后,在優(yōu)化好的條件下分離檢測(cè),記錄對(duì)硝基苯胺與內(nèi)標(biāo)NF的峰面積。值得注意的是,需要在方法中設(shè)定進(jìn)樣程序,使得每次進(jìn)樣后將毛細(xì)管柱進(jìn)樣端浸入水中洗去黏附的試劑,以預(yù)防各個(gè)試劑間的交叉污染。

2 結(jié)果與討論

2.1 MEKC方法的建立和優(yōu)化

在測(cè)定低分子量肝素抗凝血活性的方法中,將柱上酶反應(yīng)與MEKC分離檢測(cè)集成為一體。測(cè)定依諾肝素鈉抗凝血活性的柱上酶反應(yīng)方法是將毛細(xì)管柱端作為酶微反應(yīng)器,依次導(dǎo)入依諾肝素鈉、ATⅢ、FXa和CPS溶液,在柱內(nèi)實(shí)現(xiàn)混合、反應(yīng)、分離和檢測(cè)一體化,最大限度地實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化。由于生成的對(duì)硝基苯胺為電中性,只能通過MEKC進(jìn)行分離測(cè)定。我們對(duì)MEKC方法進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)采用30 cm總長(zhǎng)的石英毛細(xì)管、含20 mmol/L SDS的40 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)、分離電壓15 kV、柱溫20 ℃時(shí),能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)硝基苯胺和內(nèi)標(biāo)的最佳分離。

2.2 在線酶反應(yīng)進(jìn)樣順序、混合方式和反應(yīng)條件的選擇

由于分離緩沖液中的SDS會(huì)影響酶的活性,實(shí)驗(yàn)在進(jìn)樣前后均進(jìn)一段反應(yīng)緩沖液(200 Pa×3 s)隔離酶反應(yīng)器。為避免試劑的交叉污染,在進(jìn)樣程序中設(shè)定毛細(xì)管在每進(jìn)一個(gè)試劑后在反應(yīng)緩沖液瓶中浸洗,洗掉毛細(xì)管柱和電極上的試劑。在肝素類藥物抗凝血活性測(cè)試的實(shí)驗(yàn)中,試劑的穩(wěn)定性對(duì)最終測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性影響很大。因此,我們首先考察了FXa在測(cè)試條件下的穩(wěn)定性。將FXa從4 ℃冰箱中取出后,室溫下放置20 min,然后以140 Pa的壓力依次導(dǎo)入FXa 3 s和CPS 15 s,自由擴(kuò)散混合,靜置4 min后電泳分離。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),FXa在室溫下放置200 min,活性基本保持不變,200 min之后,FXa活性衰減較為明顯。但是在室溫下,ATⅢ的活性會(huì)發(fā)生明顯的衰減,因此在測(cè)試依諾肝素鈉抗凝血活性時(shí)每分析8個(gè)樣品更換一次FXa,但是ATⅢ溶液需要每次更換。兩種生化試劑在每次從冰箱取出時(shí),均在室溫下放置20 min以恢復(fù)酶的活性。

樣品和試劑在毛細(xì)管柱端的混合程度直接影響酶與底物的混合效果和反應(yīng),從而對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。毛細(xì)管中一般不存在湍流,因此混合的過程主要通過電泳淌度差和分子擴(kuò)散兩種方式[11,12]。當(dāng)以較低壓力進(jìn)樣時(shí),反應(yīng)物區(qū)帶界面能夠保持較平整,反應(yīng)物間的混合是通過分子的縱向擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)的。擴(kuò)散是所有分子的基本性質(zhì),因此可適用于具有相同電泳淌度的反應(yīng)物的混合。縱向擴(kuò)散混合不會(huì)造成反應(yīng)物的區(qū)帶發(fā)生大的移動(dòng),因此混合后的反應(yīng)物仍然在毛細(xì)管柱頭保持較小的區(qū)帶,從而利于高的分離柱效。但是使用這種混合方式不適于多種反應(yīng)物參與的反應(yīng)。橫向擴(kuò)散方式發(fā)生在混合界面間有橫向接觸面的反應(yīng)物區(qū)帶間[12]。橫向界面只有在短時(shí)間內(nèi)施加高壓力進(jìn)樣時(shí),由于產(chǎn)生了拋物線形的流速輪廓,使進(jìn)樣后的各個(gè)反應(yīng)物在橫向發(fā)生接觸。然而,為了保證樣品區(qū)帶處于層流狀態(tài),所使用的壓力也不能太高。圖1所示即為利用層流橫向擴(kuò)散的方法實(shí)現(xiàn)反應(yīng)物的混合。在這種方法中不同反應(yīng)物的溶液依次以較高壓力、較短時(shí)間進(jìn)樣,使所有反應(yīng)物之間均有較大的橫向接觸面積,從而通過擴(kuò)散達(dá)到混合的目的。

依諾肝素鈉與ATⅢ的進(jìn)樣體積均相對(duì)較小,這兩種試劑進(jìn)樣后靜置1 min,即采用自由擴(kuò)散混合并反應(yīng);為使依諾肝素-ATⅢ復(fù)合物與FXa混合均勻,使用層流橫向擴(kuò)散混合方式, FXa的等電點(diǎn)(pI 5.68)比CPS(pI 6.74)小,因此在反應(yīng)條件下(pH 7.4), FXa帶更多負(fù)電荷,為了使游離的FXa與CPS混合,實(shí)驗(yàn)在這一步采用電壓混合。固定混合電壓為3 kV,實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了混合時(shí)間對(duì)混合情況的影響。游離的FXa與CPS混合越充分,產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺也就越多,根據(jù)圖2可以看出,當(dāng)混合時(shí)間為0.3 min時(shí),產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺最多,因此最終確定電壓混合條件為3 kV、0.3 min。

圖 2 FXa與CPS混合時(shí)間對(duì)p-NA反應(yīng)產(chǎn)率的影響Fig. 2 Effect of the mixing time of anti-factor Xa (FXa) and chromogenic peptide substrate (CPS) on the reaction yields of p-nitroaniline (p-NA)

2.3 方法驗(yàn)證

在優(yōu)化的電泳條件下,考察了方法的重復(fù)性。對(duì)硝基苯胺的遷移時(shí)間以及經(jīng)內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)的峰面積在日內(nèi)和日間的重復(fù)性列于表1?？梢钥闯?經(jīng)過內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)后對(duì)硝基苯胺峰面積的重復(fù)性得到明顯改善。隨后我們對(duì)線性范圍進(jìn)行了考察,如圖3所示,在0.025～1.0 mmol/L的對(duì)硝基苯胺濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。測(cè)得方法的檢出限(LOD)(3倍信噪比)為0.025 mmol/L,定量限(LOQ)(10倍信噪比)為0.075 mmol/L。如圖4所示,在MEKC的分離條件下,CPS、FXa、ATⅢ和依諾肝素鈉均不會(huì)在4 min內(nèi)出峰,因此不干擾對(duì)硝基苯胺的測(cè)定。

表 1 對(duì)硝基苯胺遷移時(shí)間、峰面積以及峰面積比的 日內(nèi)和日間精密度

圖 3 對(duì)硝基苯胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=3)Fig. 3 Standard curve of p-NA (n=3) Concentrations of p-NA: 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 mmol/L; concentration of nitrofurantoin (NF): 0.1 mmol/L; Injection: 140 Pa×10 s. y: peak area ratios of p-NA to NF; x: concentration, mmol/L; R2: correlation coefficient.

圖 4 依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液抗FXa活性測(cè)試電泳圖Fig. 4 Electropherograms for the determination of anti-FXa activity of enoxaparin sodium (E) Contents of E: S1, 0.087; S2, 0.111; S3, 0.143; S4, 0.183 IU/mL.

2.4 LMWHs抗FXa活性的測(cè)試

由于FXa溶液是過量的,依諾肝素介導(dǎo)的ATⅢ對(duì)凝血因子活性的抑制作用可以通過測(cè)定產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺含量獲得,這樣也就獲得了依諾肝素的抗凝血活性。對(duì)硝基苯胺是中性分子,實(shí)驗(yàn)采用MEKC分離模式。為了保證定量的準(zhǔn)確性及良好的方法重復(fù)性,采用NF作為內(nèi)標(biāo)。在常用的生色肽底物分光光度法中,為了避免發(fā)色肽底物和樣品基質(zhì)對(duì)硝基苯胺檢測(cè)的影響，通常選擇檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm。由于這個(gè)波長(zhǎng)不是對(duì)硝基苯胺的最大吸收波長(zhǎng)，因此分光光度法的檢測(cè)靈敏度較低。我們的方法由于能夠?qū)?duì)硝基苯胺與酶反應(yīng)液中其他成分分開，可以在其最大吸收波長(zhǎng)380 nm處檢測(cè)，以獲得最佳的檢測(cè)靈敏度。

圖 5 依諾肝素鈉峰面積比-濃度對(duì)數(shù)值線性校準(zhǔn)曲線Fig. 5 Calibration curve of E constructed by peak area ratio vs log concentration value

以依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液含量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),對(duì)硝基苯胺與NF的峰面積比為縱坐標(biāo)分別作線性回歸曲線,并按照生物鑒定統(tǒng)計(jì)法測(cè)量反應(yīng)平行線測(cè)定法(4×4法)計(jì)算效價(jià)和實(shí)驗(yàn)誤差。使用本文方法測(cè)試了兩批分別來(lái)源于賽諾菲和杭州九源公司的依諾肝素鈉藥物。將所得數(shù)據(jù)以標(biāo)準(zhǔn)品(或供試品)溶液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以相應(yīng)的校正峰面積為縱坐標(biāo)分別做線性回歸,結(jié)果見圖5。所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)生物鑒定統(tǒng)計(jì)法(4×4法)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算得到兩個(gè)批次樣品的效價(jià)如表2所示,平均可信限率(FL)小于5%,均通過可靠性檢測(cè)。試品間、劑間回歸顯著,偏離平行、二次曲線、反向二次曲、區(qū)組間不顯著(見附表1和附表2,詳見http://www.chrom-China.com)?；贛EKC法測(cè)得的兩批依諾肝素的效價(jià)與它們的標(biāo)示效價(jià)一致(標(biāo)示效價(jià)為廠家標(biāo)注)。

表 2 兩個(gè)批次樣品的效價(jià)結(jié)果Table 2 Potency results of two batches of samplesSampleAssumed potency/(IU/mL)Determined potency/(IU/mL)SM/%FL/%E-110000 120280.904.9E-212000132820.734.0 SM: standard error; FL: fiducial limit.

3 結(jié)論

本文發(fā)展了MEKC結(jié)合柱上酶反應(yīng)的方法用于測(cè)定低分子量肝素的抗凝血活性,實(shí)現(xiàn)了進(jìn)樣、混合、反應(yīng)及分離檢測(cè)一體化,顯著提高的檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)精度和自動(dòng)化程度,同時(shí)也降低了樣品和試劑的消耗量。方法可用于低分子量肝素生產(chǎn)和臨床應(yīng)用時(shí)測(cè)定抗凝血活性。