膠束電動毛細(xì)管色譜法分析玫瑰純露中的苯乙醇

王偉峰, 張 瑛,2, 楊軍麗*

(1. 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730000; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

玫瑰(Rosarugosa)是薔薇目、薔薇科、薔薇屬、落葉直立灌木。玫瑰花別名徘徊花、刺玫花,其性甘微苦,溫,無毒,入肝脾二經(jīng),廣泛地應(yīng)用于人們的日常保健中,在我國多個省份有食用玫瑰制品的習(xí)俗。明朝藥物典籍《食物本草》就有玫瑰入藥的記錄“主利肺脾、益肝膽,食之芳香甘美,令人神爽”。玫瑰花含揮發(fā)油、氨基酸、多酚、黃酮等多種化學(xué)成分,具有保護(hù)心血管[1,2]、抗細(xì)菌及病毒[3]、抗氧化[4]等生物活性。我國栽種的玫瑰品種主要有:甘肅苦水玫瑰、山東平陰玫瑰、大馬士革玫瑰及百葉玫瑰等。目前,玫瑰已發(fā)展為一種集觀賞、香料、食用、釀酒及藥用等多種用途于一身的植物資源。

玫瑰純露是玫瑰提取精油后的重要副產(chǎn)物,是玫瑰精油的飽和水溶液,不僅含有植物水溶活性成分,同時也保留精油的芳香成分,且含有礦物養(yǎng)分,具有抗衰老、清除自由基[5,6],抗過敏、抗菌、消炎、防紫外線損傷等功效[7,8]。目前,國內(nèi)外對玫瑰精油有著嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[9,10],但對于玫瑰純露的質(zhì)量則無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

毛細(xì)管電泳(CE)技術(shù)因其分離效率高、分析速度快、樣品量消耗少等優(yōu)點(diǎn),已發(fā)展成為分離科學(xué)領(lǐng)域最重要的分析技術(shù)之一。膠束電動毛細(xì)管色譜(MEKC)于1984年由Terabe等[11]建立,是依據(jù)表面活性劑形成膠束做為準(zhǔn)固定相,根據(jù)溶質(zhì)在膠束相和水溶液相間分配差異獲得對分析物的分離,其對非極性分子、弱極性分子、強(qiáng)極性分子具有良好的兼容性,極大地拓展了CE的應(yīng)用范圍[12-17]。特別地,在以長鏈脂肪酸及其鈉鹽為表面活性劑的膠束電動毛細(xì)管色譜對弱極性有機(jī)分子分離過程中呈現(xiàn)出類反相色譜洗脫次序的特征,使得MEKC在藥物分離分析研究中獲得廣泛應(yīng)用[18-23]。文獻(xiàn)中關(guān)于玫瑰制品中香氣成分苯乙醇類弱極性分子的CE分離分析研究鮮有報道[24],未見直接利用MEKC法進(jìn)行玫瑰精油或玫瑰純露樣品分析的文獻(xiàn)。

本文旨在發(fā)展一種簡單、靈敏、穩(wěn)定的CE方法用于玫瑰純露樣品中苯乙醇含量的測定。本方法中選擇表面活性劑十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)作為添加劑,硼砂為背景電解質(zhì),建立了一種MEKC法,可實(shí)現(xiàn)玫瑰純露中苯乙醇的快速、靈敏檢測。該方法有望應(yīng)用于玫瑰純露中苯乙醇的檢測,為玫瑰純露的質(zhì)量控制提供了一種簡單、快速、靈敏的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7100毛細(xì)管電泳儀配有二極管陣列(photo-diode array, PDA, 190～600 nm)檢測器(安捷倫科技公司),熔融石英毛細(xì)管(48.5 cm×50 μm,河北永年銳灃色譜器件有限公司)有效長度40 cm。PB-10 pH酸度計(賽多利斯,德國)。氫氧化鈉、硼砂、SDS、氯化鈉、鹽酸、甲醇均為分析純,購自百靈威公司。苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇、香茅醇均為分析純,購自上海國藥集團(tuán)。玫瑰購自當(dāng)?shù)厥袌霾凑账魵庹麴s提取及分液器分流制備玫瑰純露,蒸餾裝置由實(shí)驗(yàn)室自行組裝。其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(18.25 MΩ·cm),由萊科超純水系統(tǒng)制備(上海,萊科)。

1.2 緩沖溶液和樣品的配制

CE運(yùn)行的緩沖溶液由10 mmol/L的硼砂和15 mmol/L的SDS組成(pH=9.3)。精密稱取苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇和香茅醇,用分析純甲醇配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液,質(zhì)量濃度為1 g/L,常溫保存,使用時直接用超純水準(zhǔn)確稀釋使用;玫瑰純露樣品使用前均存放于4 ℃冰箱,經(jīng)CE分析時直接取出過濾使用。所有緩沖溶液使用前均用0.45 μm的醋酸纖維濾膜過濾兩次。

1.3 CE分離檢測條件

新毛細(xì)管首次使用前分別用甲醇、1 mol/L的氫氧化鈉、超純水沖洗10 min、60 min、30 min;每次使用前用0.5 mol/L的氫氧化鈉、超純水和運(yùn)行緩沖溶液依次沖洗2 min、2 min、3 min;兩次運(yùn)行過程之間用緩沖溶液平衡沖洗毛細(xì)管5 min。進(jìn)樣條件:5 kPa, 5 s。分離電壓為+20 kV;毛細(xì)管溫度為20 ℃;采用PDA檢測,檢測波長為208 nm。

2 結(jié)果與討論

玫瑰純露為玫瑰精油的飽和水溶液,苯乙醇為其指標(biāo)成分,還含有苯甲醇、芳樟醇、香茅醇、氨基酸、黃酮、酚酸、礦物質(zhì)、無機(jī)鹽等[25]。開展玫瑰純露及制品的質(zhì)量控制,要求對它們進(jìn)行有效的分離分析?？紤]到CE運(yùn)行模式眾多,需要兼顧到微溶性和可溶性物質(zhì),初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)常規(guī)毛細(xì)管區(qū)帶電泳法并不能滿足要求,MEKC法成為優(yōu)選模式。同時,考慮到玫瑰純露樣品中化合物類型復(fù)雜多樣,接下來的實(shí)驗(yàn)主要圍繞影響MEKC法分離度、靈敏度、穩(wěn)定性等的多個因素展開考察。

2.1 膠束對分離的影響

在MEKC法分析時,通常采用的膠束分子有陽離子、陰離子和中性分子表面活性劑。玫瑰純露樣品中分析物主要為羧酸、多酚、萜類物質(zhì),結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究經(jīng)驗(yàn),陰離子表面活性劑更適合它們的分離分析。研究表明,SDS具有較好的分離性能。實(shí)驗(yàn)中考察了SDS濃度對分離的影響。如圖1所示,表面活性劑濃度較低時對樣品的分離具有一定的改善作用,隨著其濃度的升高分離度明顯改善,當(dāng)SDS濃度達(dá)到15 mmol/L時樣品中各峰獲得良好分離。繼續(xù)增加SDS濃度,出峰時間較晚的幾個分析物出現(xiàn)明顯的峰展寬現(xiàn)象,這可能是由于膠束濃度過大導(dǎo)致分析物解離困難。綜合考慮,確定15 mmol/L為SDS的最佳濃度。

圖 1 SDS濃度對分離的影響Fig. 1 Effect of sodium dodecyl sulfate (SDS) concentration on the separation Capillary length, 48.5 cm; effective capillary length, 40 cm; sample injection, 5 kPa, 5 s; capillary temperature, 20 ℃; detection wavelength, 208 nm; separation voltage,+20 kV. Peak identification: 1. benzyl alcohol; 2. phenethyl alcohol; 3. linalool; 4. citronellol.

2.2 背景電解質(zhì)濃度的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中考察了背景電解質(zhì)溶液中硼砂濃度對分離的影響,如圖2所示,5 mmol/L硼砂條件下樣品中各分析物峰可以清晰辨認(rèn)。硼砂對分析物從SDS膠束團(tuán)的解離有輔助作用,硼砂濃度的升高有利于芳樟醇和香茅醇從SDS膠束團(tuán)中解離,它們的峰形變尖峰亦變高;持續(xù)增加硼砂濃度,SDS的臨界膠束濃度逐漸下降,SDS膠束團(tuán)對芳樟醇和香茅醇的助溶能力下降,引起吸附增強(qiáng)解離變?nèi)?從而出現(xiàn)峰高迅速降低的情況。通過對比發(fā)現(xiàn),硼砂濃度為10 mmol/L時樣品中各分析物可以獲得良好分離且檢測靈敏度最高。

圖 2 硼砂濃度對分離的影響Fig. 2 Effect of sodium borate concentration on the separation SDS concentration: 15 mmol/L. Other conditions were the same as in Fig. 1.

2.3 檢測波長、進(jìn)樣條件及分離電壓影響

實(shí)驗(yàn)對檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化,分別選擇208、214、254、280 nm進(jìn)行了考察。結(jié)果表明樣品中大多數(shù)分析物的紫外吸收較弱,在208 nm和214 nm處獲得較高的檢測靈敏度和平穩(wěn)的基線。經(jīng)過進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),208 nm作為檢測波長可獲得更優(yōu)的檢測信噪比。

實(shí)驗(yàn)還對進(jìn)樣條件進(jìn)行了優(yōu)化,分別采用電動進(jìn)樣(-10 kV, 5 s)、壓力進(jìn)樣(5 kPa, 5 s)、混合進(jìn)樣(-10 kV, 3 s; 5 kPa, 2 s)等模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),壓力進(jìn)樣具有更好的穩(wěn)定性,盡管其分析的靈敏度較單獨(dú)電動進(jìn)樣和混合進(jìn)樣較差?？紤]到該方法作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)一步推廣應(yīng)用的需要,選擇壓力進(jìn)樣為樣品引入方式。

表 1 本文方法與文獻(xiàn)方法的比較

分離電壓直接影響樣品中各組分的遷移時間和分離效果。在分離電壓為+15、+20、+25、+30 kV條件下對分離分析效果進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,隨著分離電壓的升高,各分析物遷移時間明顯縮短,分離度影響并不顯著,但運(yùn)行電流迅速增加,在+30 kV時出現(xiàn)“斷流”現(xiàn)象。綜合考慮分析速度、分離度、穩(wěn)定性等因素,確定+20 kV為本實(shí)驗(yàn)的分離電壓。

2.4 方法學(xué)評價

圖 3 優(yōu)化條件下苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品的重現(xiàn)性考察Fig. 3 Investigation of the repeatability of a standard sample under the optimum conditions Sodium borate concentration: 10 mmol/L; SDS concentration: 15 mmol/L. Other conditions were the same as in Fig. 1.

在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件下,考察了該方法的精密度、線性范圍、檢出限和定量限。以苯乙醇為標(biāo)準(zhǔn)樣品,重復(fù)運(yùn)行6次進(jìn)行精密度的考察。如圖3所示,經(jīng)6次平行運(yùn)行可以發(fā)現(xiàn)該方法具有非常好的穩(wěn)定性。進(jìn)一步通過日內(nèi)、日間測試對其重現(xiàn)性進(jìn)行了考察,分離時間、峰面積、峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為日內(nèi)(intra-day): 0.05%、1.10%、0.67%,日間(inter-day): 0.06%、1.40%、1.43%,表明該方法具有很好的穩(wěn)定性。對苯乙醇的質(zhì)量濃度(x, mg/L)與電泳圖中峰面積(y)進(jìn)行線性擬合,方程為y=1.36+0.55x,線性相關(guān)系數(shù)(r2)=0.999 0,苯乙醇的線性范圍為0.50～1 000 mg/L,基于3倍和10倍的信噪比(S/N)計算得到該方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.091 mg/L和0.35 mg/L。分別將本方法與文獻(xiàn)方法比較(見表1),結(jié)果表明本工作建立的MEKC方法分析時間較文獻(xiàn)方法明顯縮短,且檢測靈敏度較文獻(xiàn)方法提高30倍以上[24],為玫瑰純露樣品的質(zhì)量控制提供了一種有效的方法,具有實(shí)際應(yīng)用價值。

2.5 實(shí)際樣品測定

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,采用本方法對玫瑰純露實(shí)際樣品進(jìn)行了分析,采用遷移時間比對和分析物紫外吸收光譜圖對電泳圖中各峰進(jìn)行確認(rèn)(見圖4)。從圖4a可以清晰地看出,苯乙醇(峰2)與樣品中其他組分分離良好。在10、100、500 mg/L水平下進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn),每個水平進(jìn)行3次平行測定,其回收率分別為98.1%(RSD, 2.8%)、95.3% (RSD, 2.4%)、102.7% (RSD, 2.6%),證明該方法準(zhǔn)確性良好。

對實(shí)際樣品進(jìn)行了電泳分析(見圖5),遷移時間穩(wěn)定、峰形尖銳,表明該方法抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng),穩(wěn)定性佳。將本方法應(yīng)用于48個玫瑰純露樣品的分析(見表2),由表中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)各樣品中苯乙醇含量分布于0.17～4.52 mg/L之間,濃度水平存在較大差異,其主要原因?yàn)楦鹘M樣品玫瑰鮮花存放時間及存放條件不同(a組室溫下7天,b組4 ℃下1天,c組-20 ℃下1天)。這說明該法在玫瑰純露質(zhì)量控制方面具有潛在的應(yīng)用價值。

圖 4 優(yōu)化條件下(a)苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)樣品及實(shí)際樣品的電泳圖及(b)苯乙醇的紫外吸收光譜圖Fig. 4 Electropherograms of (a) a standard sample and a real sample, and (b) UV-Vis spectrum of phenylethyl alcoholConditions were the same as in Fig. 3.

表 2 玫瑰純露中苯乙醇含量測試結(jié)果(n=3)

圖 5 優(yōu)化條件下玫瑰純露樣品的電泳圖Fig. 5 Electropherograms of rose dew samples under the optimum conditionsConditions were the same as in Fig. 3.

3 結(jié)論

本文建立了一種用于玫瑰純露中苯乙醇檢測的MEKC方法。對影響實(shí)驗(yàn)的各因素進(jìn)行了詳細(xì)考察,在優(yōu)化條件下,7 min內(nèi)可以完成玫瑰純露樣品的高效分析,提高了分析速度、降低了分析成本。本方法在實(shí)際樣品分析中展現(xiàn)出良好的抗基質(zhì)干擾能力、穩(wěn)定性和靈敏性,為玫瑰純露及其制品的質(zhì)量控制研究提供了技術(shù)支撐。