基于DNA定向固定化技術(shù)構(gòu)建毛細(xì)管固定化酶微反應(yīng)器的研究進(jìn)展

宋佳一, 李夢(mèng)琦, 沈 昊, 周梓昕, 賀雯婷, 蘇 萍, 楊 屹

(北京化工大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 北京 100029)

酶廣泛分布于生命體內(nèi),影響著物質(zhì)代謝和質(zhì)能轉(zhuǎn)換等許多生命活動(dòng)[1]。生物體內(nèi)某些酶的活性變化會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生,例如,神經(jīng)間隙中乙酰膽堿酯酶活性過(guò)高會(huì)導(dǎo)致阿爾茨海默癥,α-葡萄糖苷酶的活性升高與糖尿病密切相關(guān),丙酮酸脫氫酶活性缺失會(huì)導(dǎo)致乳酸中毒等[2,3]。因此,發(fā)展新型的酶分析方法對(duì)酶活性和酶動(dòng)力學(xué)等性能進(jìn)行研究,對(duì)深刻理解生物代謝過(guò)程、疾病診斷和藥物研發(fā)具有重要意義。毛細(xì)管電泳(CE)具有樣品消耗量少、分析速度快、操作簡(jiǎn)便以及可以與多種檢測(cè)手段聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)發(fā)展成酶分析的重要工具[4]。

采用CE進(jìn)行酶分析主要包括兩種方式:離線模式和在線模式[5]。離線模式下,酶和底物在管外孵育后,再將酶反應(yīng)液導(dǎo)入毛細(xì)管進(jìn)行分析,CE僅作為分離工具;在線模式下,毛細(xì)管不僅作為分離通道,還作為酶反應(yīng)場(chǎng)所,從而實(shí)現(xiàn)在一根毛細(xì)管內(nèi)連續(xù)完成酶反應(yīng)、分離、檢測(cè)的分析步驟。在線模式又發(fā)展出均相分析方法-電泳中介微分析(electrophoretically mediated microanalysis, EMMA)和異相分析方法-固定化酶微反應(yīng)器(immobilized enzyme microreactor, IMER)[4]。IMER將天然酶固定在毛細(xì)管內(nèi),不僅顯著提高了酶穩(wěn)定性和重復(fù)使用性,而且可以實(shí)現(xiàn)納升規(guī)模溶液的自動(dòng)化酶分析,進(jìn)而顯著降低了酶分析成本[6,7]。因此,近年來(lái)基于IMER的CE酶分析(CE-IMER)已經(jīng)成為主流的酶分析方法[8]。在CE-IMER酶分析中,如何構(gòu)建性能良好、可再生使用、酶固載量大、自動(dòng)化程度高的IMER一直是該領(lǐng)域重點(diǎn)研究的問(wèn)題。隨著納米技術(shù)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的不斷發(fā)展,各種性能優(yōu)異的新型材料和固定化技術(shù)被用于IMER的構(gòu)建,顯著提高了CE-IMER在各個(gè)領(lǐng)域的分析性能[9-11]。本文將從DNA定向固定化技術(shù)的特點(diǎn)出發(fā),著重闡述基于DNA定向固定化技術(shù)構(gòu)建IMER,并應(yīng)用于CE酶分析的現(xiàn)狀和未來(lái)發(fā)展。

圖 1 DNA定向固定化流程圖[17]Fig. 1 Schematic representation of DNA-directed immobilization (DDI)[17]

1 DNA定向固定化技術(shù)的發(fā)展和特點(diǎn)

20世紀(jì)80年代人類基因組計(jì)劃的出現(xiàn)促進(jìn)了DNA微陣列技術(shù)的發(fā)展,隨后又衍生出復(fù)雜的DNA微陣列,成為當(dāng)今基礎(chǔ)和應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)研究中基因分型和基因組分析的常規(guī)工具[12]。此外,由于DNA分子具有較好的穩(wěn)定性,基于DNA微陣列還實(shí)現(xiàn)了多達(dá)數(shù)百萬(wàn)種不同寡核苷酸參與的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程[13]。然而,DNA相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用范圍。20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的DNA定向固定化(DNA-directed immobilization, DDI)技術(shù)[14]基于DNA微陣列的發(fā)展,通過(guò)載體表面DNA的有序排列實(shí)現(xiàn)了DNA芯片的研發(fā),為蛋白質(zhì)和其他非核酸分子的分析開(kāi)辟了新的途徑[15,16]。DDI利用載體表面結(jié)合的單鏈寡核苷酸片段,通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則(A-T, C-G),選擇性地結(jié)合帶有互補(bǔ)單鏈寡核苷酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)[16]。通過(guò)DNA雜交固定化的過(guò)程與蛋白質(zhì)的表面功能化過(guò)程分開(kāi)進(jìn)行,因此不會(huì)損害蛋白質(zhì)敏感的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu);同時(shí),DDI可以通過(guò)簡(jiǎn)單變性過(guò)程再生DNA表面[17](見(jiàn)圖1)。

近20多年來(lái),DDI相關(guān)技術(shù)在蛋白質(zhì)陣列分析、納米材料自組裝以及細(xì)胞生物學(xué)研究等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用[16]。例如,通過(guò)DDI將目標(biāo)蛋白質(zhì)固定在載體基質(zhì)上制備蛋白質(zhì)陣列,可廣泛應(yīng)用于檢測(cè)小分子[18]、電化學(xué)酶分析[19]、蛋白質(zhì)組學(xué)研究[20]以及蛋白質(zhì)和金屬之間的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程研究[21];通過(guò)將DDI技術(shù)與納米材料相結(jié)合,研究者開(kāi)創(chuàng)性地自組裝金納米粒子,衍生出了一整套用于檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)的生物分析方法[22-24];通過(guò)方式多樣的溫和化學(xué)方法,短鏈DNA寡核苷酸可以直接與活細(xì)胞膜結(jié)合,使細(xì)胞選擇性地附著在DNA表面,可用于細(xì)胞黏附[16,25]等。這些研究均表明DDI具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 DNA定向固定化技術(shù)用于IMER的制備與應(yīng)用

DDI可以充分利用DNA分子的堿基互補(bǔ)配對(duì)(A-T, C-G),在溫和的生理?xiàng)l件下特異性固定生物大分子[26]。由于短鏈雙螺旋DNA分子具有較強(qiáng)的機(jī)械剛性和物理化學(xué)穩(wěn)定性,因此通過(guò)DDI將酶固定在載體表面,可以形成酶微陣列,還可以充分暴露酶的活性位點(diǎn),有利于降低傳質(zhì)阻力,提高酶與底物的接觸能力[27,28]。另一方面,酶與載體之間的相互作用極易導(dǎo)致酶活性結(jié)構(gòu)的改變,最終導(dǎo)致酶活性損失,因此選擇合適的固定方法和策略對(duì)制備高穩(wěn)定性和高活性的固定化酶體系至關(guān)重要[29,30]。采用機(jī)械強(qiáng)度好的短鏈DNA,通過(guò)DDI技術(shù)將酶固定在毛細(xì)管內(nèi)壁,一方面有望降低酶與毛細(xì)管管壁的直接相互作用,提高穩(wěn)定性,另一方面有望提高酶與底物的接觸能力進(jìn)而提高IMER的催化能力。

圖 2 DNA定向固定化胰蛋白酶IMER流程圖[31]Fig. 2 Schematic of the process for trypsin IMER by DNA direct immobilization[31] APTES: 3-aminopropyltriethoxysilane; PAMAM: poly(amidoamine).

本課題組在利用DDI技術(shù)制備IMER方面進(jìn)行了初步的研究探索工作。Yang等[31]在硅烷化的石英毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合聚酰胺-胺樹(shù)枝狀大分子用于提供大量端氨基,采用戊二醛將單鏈DNA(ssDNA)修飾在毛細(xì)管內(nèi)壁,隨后將與ssDNA互補(bǔ)配對(duì)的DNA-胰蛋白酶復(fù)合物通過(guò)DDI技術(shù)固定在毛細(xì)管內(nèi),制備了離線模式和在線模式的胰蛋白酶IMER(見(jiàn)圖2)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),制備的IMER具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性,在4 ℃保存30天,仍可以保留70.16%的酶促活性,連續(xù)進(jìn)行11次酶解反應(yīng),考察其重復(fù)使用性,RSD值僅為2.91%。通過(guò)DNA雜交和去雜交實(shí)現(xiàn)DNA-胰蛋白酶復(fù)合物在毛細(xì)管內(nèi)壁的固定和移除,可以達(dá)到ssDNA功能化毛細(xì)管基體的多次再利用,顯著降低IMER制備的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本,提高了酶分析效率。將制備的胰蛋白酶IMER應(yīng)用于細(xì)胞色素C的酶切,與游離酶相比,在較短的酶切時(shí)間內(nèi)展現(xiàn)出較好的酶切效果。

圖 3 DNA定向固定化GOx和HRP雙酶IMER流程圖[32]Fig. 3 Schematic of the process for GOx and HRP IMER by DNA direct immobilization[32]

自然界中存在的大多數(shù)酶促反應(yīng)體系都需要兩種以上酶的共同參與,因此多酶反應(yīng)體系的構(gòu)建更能反映IMER在實(shí)際酶分析中的應(yīng)用潛力。目前大部分基于毛細(xì)管柱的IMER局限于單酶固定,在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。Yang等[32]通過(guò)設(shè)計(jì)DNA堿基序列,采用兩條互相不配對(duì)的ssDNA對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行修飾改性,隨后將與ssDNA互補(bǔ)配對(duì)的DNA-葡萄糖氧化酶(GOx)和DNA-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)復(fù)合物通過(guò)DDI固定在毛細(xì)管內(nèi),制備雙酶IMER(見(jiàn)圖3)。研究表明,制備的毛細(xì)管雙酶IMER具有較好的雙酶級(jí)聯(lián)酶促活性和突出的底物親和性。利用DDI可控制備酶陣列的優(yōu)勢(shì),通過(guò)調(diào)節(jié)兩條ssDNA的比例,在毛細(xì)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)GOx和HRP比例的調(diào)控,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高效率級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系的構(gòu)建。制備的雙酶IMER同樣通過(guò)DNA去雜交實(shí)現(xiàn)了DNA-酶的釋放和ssDNA功能化毛細(xì)管的再利用。研究表明,制備的雙酶IMER具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性,且均優(yōu)于通過(guò)非特異性吸附制備的雙酶IMER。將制備的IMER用于葡萄糖的靈敏性分析檢測(cè),展現(xiàn)出較好的酶促分析性能,在生命分析等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 總結(jié)與展望

與傳統(tǒng)的吸附、交聯(lián)、封裝和共價(jià)連接固定化酶方法相比,DDI可以在溫和的生理?xiàng)l件下進(jìn)行酶固定化,顯著降低固定化過(guò)程對(duì)酶活性構(gòu)象和穩(wěn)定性的影響;同時(shí),DDI的可逆固定化過(guò)程可以再生載體表面,顯著降低IMER制備的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本。因此,DDI是制備IMER的理想方法。

目前,基于DDI等DNA納米技術(shù)制備新型IMER的研究處于起步階段,還有很大的發(fā)展和研究空間。在前期研究基礎(chǔ)上,可以著重發(fā)展以下方面:(1)基于DDI在毛細(xì)管內(nèi)分區(qū)域固定目標(biāo)酶,構(gòu)建更加高效催化的IMER級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系;(2)針對(duì)目前IMER制備過(guò)程中存在的穩(wěn)定性、酶促活性以及酶固載量有待提高等問(wèn)題,充分利用DNA的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)優(yōu)勢(shì),并與納米材料的發(fā)展相結(jié)合,制備新型IMER,進(jìn)一步推進(jìn)CE-IMER在酶分析中的廣泛應(yīng)用。