芯片毛細(xì)管電泳用于人乳頭瘤病毒分析的研究進(jìn)展

林雪霞, 王晨境, 林金明

(1. 華僑大學(xué)化工學(xué)院, 福建 廈門 361021; 2. 微量分析測(cè)試和儀器研制北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 清華大學(xué)化學(xué)系, 北京 100084)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是一種常見的球形DNA病毒,屬于乳頭瘤病毒科,通過直接或間接接觸方式傳播并感染人體的皮膚與黏膜,從而引起一系列疾病,如宮頸癌、直腸癌、陰莖癌和疣等。目前已知的HPV亞型已經(jīng)超過200種,不同類型的HPV危險(xiǎn)程度有所不同。根據(jù)其致癌能力,分為高危型和低危型。高危型HPV(hrHPV)主要包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和70型,平均感染持續(xù)時(shí)間大約8個(gè)月。低危型HPV(lrHPV)包括HPV6、11、42、43、44型,感染平均持續(xù)時(shí)間為4～8個(gè)月。HPV感染后,感染者大多沒有臨床表現(xiàn),絕大部分感染會(huì)被機(jī)體免疫系統(tǒng)自動(dòng)清除,只有持續(xù)的hrHPV感染才會(huì)發(fā)生癌前病變或使感染者患宮頸癌等。因此,可以采用HPV分型檢測(cè)的方式區(qū)分持續(xù)(重復(fù))感染、多重感染和一次感染,明確治療方向;可以針對(duì)不同分型的感染采取不同的治療方案,有利于受檢者盡快恢復(fù)健康,避免過度治療，也有利于預(yù)測(cè)受檢者發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)度,確定篩查間隔。

在HPV疾病的診斷過程中,快速、可靠和準(zhǔn)確的樣品分析是患者、醫(yī)生以及檢測(cè)人員的要求和目標(biāo)。然而,由于大多數(shù)樣品都很復(fù)雜,在對(duì)樣品分析之前,分析工作者需要完成對(duì)樣品的充分處理和分離等一系列操作,步驟煩瑣。因此,在實(shí)際診斷分析中很難同時(shí)實(shí)現(xiàn)快速而可靠的檢測(cè)。分離是提高分析速度的一個(gè)難點(diǎn),也是分析信息的關(guān)鍵。微流控芯片(microfluidic chip)又稱微全分析系統(tǒng)或芯片實(shí)驗(yàn)室,其能夠在一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上高度集成化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元,獲得了人們的極大關(guān)注,并得到快速發(fā)展。微流控芯片技術(shù)的進(jìn)步也促進(jìn)了芯片毛細(xì)管電泳(microchip capillary electrophoresis, MCE)技術(shù)的誕生和發(fā)展。MCE是一種將傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳與微機(jī)電加工技術(shù)相結(jié)合,然后集成在一個(gè)芯片上的分離技術(shù)。在HPV的檢測(cè)中,MCE主要是利用玻璃、石英或各種聚合物材料加工成微米級(jí)通道,以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,利用分離緩沖液的篩分效應(yīng),根據(jù)DNA/RNA分子的大小進(jìn)行HPV核酸快速分離檢測(cè)。與傳統(tǒng)的凝膠電泳以及毛細(xì)管電泳相比,MCE具有高度集成以及自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn),可以將檢測(cè)時(shí)間縮短到幾分鐘,在分析速度方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。本文主要分為兩部分進(jìn)行綜述:(1)MCE系統(tǒng)和芯片的設(shè)計(jì)制作;(2)MCE在HPV核酸檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 芯片毛細(xì)管電泳

MCE是在制作好的芯片通道中進(jìn)行物質(zhì)的分離。它的分離原理與毛細(xì)管電泳類似,在電場(chǎng)的作用下,由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等差異,分子產(chǎn)生不同的遷移速度,經(jīng)過一定時(shí)間后,根據(jù)移動(dòng)距離不同而達(dá)到分離的效果。芯片通道的設(shè)計(jì)和電場(chǎng)的應(yīng)用不僅可以實(shí)現(xiàn)樣品的快速、高效分離,還可用于對(duì)樣品進(jìn)行前處理,比如樣品的純化和富集。HPV核酸的檢測(cè)也從傳統(tǒng)的PCR凝膠電泳分析向PCR-MCE轉(zhuǎn)化,極大地提高了HPV的檢測(cè)速度,節(jié)省了大量的勞動(dòng)力。

圖 1 芯片毛細(xì)管電泳用于人乳頭瘤病毒DNA/mRNA的檢測(cè)Fig. 1 Human papillomavirus (HPV) DNA/mRNA detection based on the microchip capillary electrophoresis (MCE) a. composition of the MCE system; b. schematic diagram of the MCE chip commonly used; c. test result report by MCE. S, SW, B and BW indicated sample solution, sample waste, buffer and buffer waste, respectively.

1.1 MCE系統(tǒng)

典型MCE裝置的核心單元包含微流控進(jìn)樣通道、分離通道、檢測(cè)單元和電源供應(yīng)等(見圖1a)。芯片電泳系統(tǒng)主要由高壓電源、芯片、電解液池、進(jìn)樣系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)等構(gòu)成。如圖1b所示,MCE芯片的微通道結(jié)構(gòu)一般包含了樣品流動(dòng)的微通道、樣品和緩沖液儲(chǔ)存池、分離緩沖液或者凝膠等。高壓電源是組成芯片電泳裝置的重要設(shè)備,是樣品在溶液中遷移的動(dòng)力來源。目前常用的進(jìn)樣系統(tǒng)為電動(dòng)或者動(dòng)液壓進(jìn)樣系統(tǒng)。不同的進(jìn)樣方式需要的通道結(jié)構(gòu)也不同。電動(dòng)進(jìn)樣操作簡(jiǎn)單，并適用于大多數(shù)微通道設(shè)計(jì),因此是MCE的首選進(jìn)樣方式。在電動(dòng)進(jìn)樣模式下,樣品的進(jìn)樣量主要取決通道交叉口的體積。動(dòng)液壓進(jìn)樣是通過樣品和樣品廢水池的液位差,或者施加壓力或抽真空來完成的。這種進(jìn)樣方式是通過輔助設(shè)備(如泵或移液管)實(shí)現(xiàn)樣品進(jìn)樣。因此,這種進(jìn)樣方式目前使用較少。新的動(dòng)液壓進(jìn)樣注射常通過噴墨和陣列技術(shù)控制液滴注射[1,2]。這種液滴注射法不僅能夠進(jìn)行高通量進(jìn)樣,而且能精確地控制體積為nL到pL的樣品進(jìn)樣。此外,目前商品化MCE儀器中檢測(cè)器主要以紫外-可見光檢測(cè)器和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器為主,也發(fā)展了發(fā)光二極管熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等多種其他檢測(cè)器,能夠獲得如圖1c所示的色譜分離圖。同時(shí),為了獲得足夠的光信號(hào),常常使用光電倍增管(PMT)或電荷耦合器件(CCD),提高檢測(cè)靈敏度。

常見制作MCE芯片的材料包括玻璃、陶瓷和各種聚合物。其中聚合物包含聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate, PMMA)、環(huán)烯烴共聚物、聚苯乙烯和聚碳酸酯等。通過光刻法制作的PDMS芯片由于價(jià)格低廉、光學(xué)透明、無毒、制作相對(duì)簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。然而,PDMS具有一定的疏水性,能夠在通道表面吸附疏水性物質(zhì),并且不容易控制電滲流,從而降低了芯片的分離效果。因此,一部分研究者一直致力于PDMS芯片表面的修飾。除了PDMS外,另一種常用的聚合物是PMMA,它主要是通過熱壓成型的方式來制作芯片。這種通過熱壓形成的PMMA芯片能夠?qū)崿F(xiàn)MCE芯片的快速、大規(guī)模生產(chǎn)。近年來,紙基芯片以及纖維芯片由于結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單和制造成本低廉等優(yōu)勢(shì)越來越受到人們的關(guān)注。與此同時(shí),芯片的制作技術(shù)也快速發(fā)展起來。噴墨法、繪圖法、等離子體法以及激光打印等一些其他制作工藝雖然沒有達(dá)到光刻的精度和分辨率,但是這些工藝的制作程序具有簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)點(diǎn)。盡管大規(guī)模芯片制作方法在一定程度上降低了生產(chǎn)成本,但是芯片電極的加入?yún)s大大提高了MCE器件的成本。Henderson等[3]通過激光焊接技術(shù)在聚苯胺導(dǎo)電膜上制備了一種用于電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)(capacitively coupled contactless conductivity detection, C4D)的電極。然后在PMMA基底上涂覆C4D電極涂層。最后將PMMA基底與帶有微通道的PDMS芯片鍵合，得到MCE芯片,極大地降低了芯片制造成本。Tang等[4]通過微接觸電化學(xué)蝕刻技術(shù),可以在不到2 min的時(shí)間內(nèi)完成MCE芯片的制作。盡管如此,玻璃仍然是MCE芯片制作最常用的理想基質(zhì)。Donora等[5]通過濕法刻蝕和激光雕刻燒蝕制作玻璃MCE芯片。這些芯片的分離效率明顯低于光刻蝕制作的芯片。與此同時(shí),使用玻璃芯片的商品化MCE系統(tǒng)也發(fā)展起來,如島津公司MutiNA MCE、安捷倫公司2100生物分析儀、Perkin Elmer公司LabChip?分離系統(tǒng)和Bio Rad公司ExperionTM自動(dòng)電泳系統(tǒng)。

1.2 MCE芯片結(jié)構(gòu)

MCE芯片結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì),最初是一條直微通道作為分離通道,后來出現(xiàn)了多種不同的通道設(shè)計(jì)。經(jīng)典的MCE芯片設(shè)計(jì)包括兩條交叉通道及4個(gè)緩沖池(樣品池、廢液池、陽極池和陰極池,見圖2a)。T型微通道可以進(jìn)行樣品富集,是MCE最常用的結(jié)構(gòu)(見圖2b)。商品化的島津MCE-202 MultiNA芯片就是采用這種通道[6]。它包含1個(gè)樣品槽、1個(gè)試劑和緩沖液入口槽、2個(gè)廢液槽。為了能夠開展多個(gè)樣品分析,系統(tǒng)可以允許同時(shí)使用4個(gè)芯片。為了能夠更好地進(jìn)行復(fù)雜樣品的研究,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品的高度分離,Bottenus等[7]和Zhuang等[8]設(shè)計(jì)了蛇形通道來增加分離通道的長(zhǎng)度,從而提高了樣品分離效果(見圖2c)。除此之外,還有雙T型、十字型以及其他類型的芯片(見圖2d和圖2e)[9,10]。雙T型芯片通道的設(shè)計(jì),使樣品可以在MCE芯片中連續(xù)流動(dòng),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的連續(xù)分析。同步循環(huán)MCE芯片的設(shè)計(jì)能夠使分子通過環(huán)形通道延長(zhǎng)遷移距離,獲得更好的分離度[11]。

圖 2 4種常見芯片通道的示意圖Fig. 2 Schematic diagrams of four common chip channels a. straight channel; b. T channel; c. serpentine channel; d. dual channel; e. double channels.

此外,通過對(duì)MCE芯片通道的設(shè)計(jì),能夠?qū)悠返那疤幚砑稍谝粡埿酒稀umar等[12]在MCE芯片上集成了固相萃取裝置。他們將聚合物溶液填充在芯片通道中,并通過原位光聚合制備芯片內(nèi)的固相萃取柱。制作的固相萃取柱不僅能夠進(jìn)行目標(biāo)物的萃取,還能將目標(biāo)物的濃度富集高達(dá)80倍。對(duì)于核酸檢測(cè),Ma等[13]在MCE芯片上集成等溫?cái)U(kuò)增單元,開展高靈敏檢測(cè)的研究。Liu等[14]在芯片上集成PCR單元,然后通過MCE分離進(jìn)行phiX174噬菌體序列和大腸桿菌PCR產(chǎn)物的高靈敏檢測(cè)。通過這種方法能夠?qū)崿F(xiàn)50拷貝DNA的樣品分析,而且整個(gè)樣品處理過程和樣品分析過程在45 min內(nèi)完成。通過對(duì)芯片結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和電極的應(yīng)用,在MCE芯片上集成不同樣品處理功能,不僅能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏、快速的樣品分析,而且易于自動(dòng)化和微型化,減少試劑使用量和降低成本。

1.3 芯片電泳分離方式

樣品的電泳分離是通過在通道上施加電場(chǎng)來實(shí)現(xiàn)的。電場(chǎng)的施加將促進(jìn)帶電分子的遷移。在MCE中,最常用的電泳方式是區(qū)帶電泳、凝膠電泳和介電泳。

在區(qū)帶電泳中,帶電物質(zhì)在電場(chǎng)作用下在背景溶液中遷移,并根據(jù)電泳遷移率的不同實(shí)現(xiàn)分離。待測(cè)物質(zhì)除了受到電場(chǎng)作用之外,還受到溶質(zhì)顆粒與固相載體吸附作用的影響。區(qū)帶電泳在藥物、代謝產(chǎn)物等小分子的分離方面有著廣泛的應(yīng)用。

介電泳,也稱雙向電泳,是介電常數(shù)較低的物體在非勻強(qiáng)電場(chǎng)中受力的現(xiàn)象,常用于顆粒和細(xì)胞的分離。Sun等[15]通過自組裝離子液體電極和介電泳技術(shù)將聚苯乙烯微球和PC-3細(xì)胞分離。

凝膠電泳技術(shù)發(fā)展歷史悠久。在凝膠電泳中,電場(chǎng)的施加是沿著篩分基質(zhì)進(jìn)行的。電泳中使用了無反應(yīng)活性的篩分基質(zhì),如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺膠等,從而提高了分析物的分離效果。同時(shí),電泳的遷移率同分子的大小、極性及介質(zhì)黏度、凝膠形狀的差異和分子所帶的凈電荷密切相關(guān)。隨著凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展,近年來基于凝膠電泳的微芯片裝置也逐步發(fā)展應(yīng)用。分離速度從原來的幾個(gè)小時(shí)縮短到10 min以內(nèi)。Lin等[6,16]通過使用商品化的島津MultiNA MCE分析儀開展了多種蛋白質(zhì)的分析和核酸分析。在核酸分析中,Lin等[6,16]針對(duì)經(jīng)過PCR擴(kuò)增后的短串聯(lián)片段和白血病相關(guān)的BCR-ABL片段進(jìn)行基于MCE的凝膠電泳分析,均可以在90 s內(nèi)完成分析。在多種蛋白質(zhì)的檢測(cè)中,主要是結(jié)合功能適配體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子的大小和改變凈電荷的數(shù)目進(jìn)行多種蛋白質(zhì)快速高靈敏的檢測(cè)[17]。隨著MCE的發(fā)展,各種不同的MCE分離技術(shù)被進(jìn)一步開發(fā)和利用。Wang等[18]將MCE與適配體技術(shù)相結(jié)合,對(duì)牛奶中的抗生素實(shí)現(xiàn)了快速高靈敏的檢測(cè)。Qin等[19]將MCE和熒光信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合,用于人血漿中γ干擾素(IFN-γ)的高靈敏檢測(cè)。

2 MCE在HPV檢測(cè)中的應(yīng)用

HPV是一種DNA病毒,感染人類表皮及黏膜組織,目前約有200種類型的HPV被鑒別出來。流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí),HPV病毒持續(xù)感染是引發(fā)癌變的主要原因。其中,16型(HPV16)和18型(HPV18)是世界范圍內(nèi)感染率最高的亞型。目前,HPV的商業(yè)化檢測(cè)方法主要包括德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的雜交捕獲Ⅱ代 (HC2) 檢測(cè)法和瑞士Roche 公司建立的酶切信號(hào)放大法(LA法)等。其中,HC2檢測(cè)是HPV檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而這兩種方法受到核酸探針的影響,成本較高,難以被大量推廣使用。此外,HPV分型檢測(cè)常用的方法還有細(xì)胞學(xué)檢查、PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、印跡雜交法等技術(shù)。細(xì)胞學(xué)檢查靈敏度低,觀察范圍有限,在病毒感染早期往往難發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)假陰性的概率較高。基于傳統(tǒng)PCR的HPV分型檢測(cè)和PCR產(chǎn)物常用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),耗時(shí)較長(zhǎng),操作也比較復(fù)雜。而MCE能夠在幾分鐘內(nèi)完成PCR產(chǎn)物鑒定,極大地降低了分析時(shí)間。本文主要介紹核酸擴(kuò)增技術(shù)和MCE技術(shù)用于HPV分型的檢查方法,其中包括PCR和MCE結(jié)合用于HPV的檢測(cè)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)的HPV檢測(cè)方法、基于PCR結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技術(shù)用于HPV分型的DNA檢測(cè)、基于核酸序列擴(kuò)增(nucleic acid sequence based amplification, NASBA)技術(shù)檢測(cè)HPV mRNA等。

2.1 PCR-MCE檢測(cè)的HPV分型

HPV分型的檢測(cè)經(jīng)歷了很長(zhǎng)的發(fā)展階段。由于存在許多不同的HPV亞型,近20多年來,HPV的檢測(cè)主要是利用PCR技術(shù)開發(fā)出在一次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)多種不同HPV亞型的檢測(cè)方法。這些檢測(cè)方法主要是在衣殼蛋白晚期轉(zhuǎn)錄期L1或早期轉(zhuǎn)錄期E1開放讀碼框中,通過選擇針對(duì)HPV基因組的高度保留序列的通用型引物來實(shí)現(xiàn)這一目的。最早的通用型PCR實(shí)驗(yàn)是IU/IWD0、MY09/11和GP5/6-PCR體系(PGMY體系),擴(kuò)增出包含450個(gè)或150個(gè)堿基對(duì)的目標(biāo)物。在此基礎(chǔ)上,建立了基于PGMY引物的第二代HPV的PCR檢測(cè)技術(shù)。近些年,出現(xiàn)了許多新的PCR HPV分型檢測(cè)技術(shù),包括把病毒的L1或E1區(qū)域內(nèi)其他保存區(qū)域作為目標(biāo)。針對(duì)不同HPV分型,以不同病毒區(qū)域?yàn)槟繕?biāo),研究者也開發(fā)了多種不同引物。然而,大多數(shù)HPV分型的PCR產(chǎn)物均通過凝膠電泳進(jìn)行分析,只有極少量的HPV PCR產(chǎn)物通過MCE進(jìn)行檢測(cè)分析。

圖 3 PCR-MCE用于HPV分型檢測(cè)Fig. 3 Detection of HPV types by PCR-MCE a. DNA extraction and PCR assay; b. HPV analysis based on MCE; c. simultaneous detection of HPV16 and HPV18. PCR: polymerase chain reaction.

基于PCR的HPV分型檢測(cè)方法多有報(bào)道。然而,利用GP5+/GP6+通用引物對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行擴(kuò)增,往往需要進(jìn)一步利用分型探針與PCR產(chǎn)物雜交,才能夠得到準(zhǔn)確的HPV分型[20-22]。目前HPV分型的探針并不能完全覆蓋HPV的所有分型。傳統(tǒng)的HPV分型檢測(cè)中,由于受到探針的影響,HPV檢測(cè)只能檢查出已知的HPV分型,不能達(dá)到預(yù)測(cè)其致病程度的作用,方法的使用也受到限制。為了避免受到探針的限制,一些研究者[23,24]通過MCE檢測(cè)HPV PCR產(chǎn)物的大小,進(jìn)行HPV16和HPV18分型的鑒定(見圖3)。為了能夠獲得準(zhǔn)確的PCR產(chǎn)物大小,在MCE檢測(cè)中使用2%羥乙基纖維素為篩分介質(zhì),Tris-硼酸(TBE)為緩沖液,通過在線混合方式對(duì)HPV PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)。同時(shí),為了提高分析的準(zhǔn)確度,以低片段和高片段DNA標(biāo)志物為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行擴(kuò)增片段大小的校正。與傳統(tǒng)的HPV分型檢測(cè)相比,此方法不需要檢測(cè)探針就可以實(shí)現(xiàn)HPV16和HPV18分型的檢測(cè)。同時(shí),MCE技術(shù)在HPV分型檢測(cè)中的應(yīng)用極大地簡(jiǎn)化了操作步驟,也縮短了分析時(shí)間,檢測(cè)靈敏度也比傳統(tǒng)染色方法高出10倍以上,檢測(cè)樣品所需的緩沖液及樣品量很少,大大降低了HPV檢測(cè)的成本。與細(xì)胞學(xué)檢查相比,此方法大大提高了檢測(cè)靈敏度,降低了檢測(cè)成本,有助于HPV相關(guān)癌癥的早期篩查,降低檢測(cè)的假陰性概率,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,林金明等[23]又提出了一種能夠同時(shí)檢測(cè)HPV16和HPV18,并且能夠有效區(qū)分兩種高危型HPV亞型的MCE檢測(cè)方法。該方法已成功應(yīng)用于HPV的檢測(cè),測(cè)序結(jié)果顯示了良好的可靠性。鑒于全球?qū)D女健康認(rèn)識(shí)的不斷提高,以及最近推出的宮頸癌疫苗,對(duì)于HPV的檢測(cè)將成為科研人員未來更加關(guān)注的研究方向。為了進(jìn)一步提高HPV檢測(cè)的靈敏度,Fan等[24]還提出了一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)的HPV檢測(cè)方法。該方法采用可視化方法,通過肉眼對(duì)HPV16和HPV18進(jìn)行鑒別,無須昂貴的專用儀器。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法具有良好的可靠性,與細(xì)胞學(xué)方法相比,假陰性率降低。相比之下,目測(cè)LAMP法的結(jié)果與PCR MCE法的結(jié)果一致,表明目測(cè)LAMP法可成功用于檢測(cè)兩種高危型HPV。因此,這種操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可以直接通過肉眼判斷的LAMP檢測(cè)方法可以用于宮頸癌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。由于減少了對(duì)儀器的依賴,這種方法更有利于偏遠(yuǎn)地區(qū)HPV的普查。

2.2 RFLP-MCE自動(dòng)分型法用于HPV分型篩查

圖 4 PCR-RFLP-MCE自動(dòng)HPV分型檢測(cè)示意圖[26]Fig. 4 Schematic diagram of PCR-RFLP-MCE for automatic detection of HPV[26] a. PGMY09/11 primes for the amplification of the potential multiple HPV DNAs; b. DNA analysis on MCE; c. the sites of different restriction endonucleases and the sizes of RFLP; d. automatic typing software for RFLP fragments. RFLP: restriction fragment length polymorphism.

基于PCR的HPV檢測(cè)方法雖然靈敏度高,但需要特異性的探針,成本相對(duì)昂貴,且只能檢測(cè)出已知分型,無法滿足實(shí)際需要。其中,采用常規(guī)PCR-MCE方法對(duì)HPV分型進(jìn)行檢測(cè),只能利用PCR引物和MCE檢測(cè)到PCR產(chǎn)物的大小,初步判斷HPV分型,無法進(jìn)行精準(zhǔn)判斷。因此,為了實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化快速HPV分型的篩查,近年來,發(fā)展了PCR-RFLP技術(shù)用于HPV分型的檢測(cè)。RFLP技術(shù)是通過將PCR產(chǎn)物酶切成不同長(zhǎng)度的DNA片段,然后通過篩分介質(zhì)或凝膠電泳分離進(jìn)行片段大小的分離。Tawe等[25]通過PCR-RFLP開展宮頸癌中HPV分型檢測(cè)。然而,這種RFLP常常只使用一種酶進(jìn)行少量HPV分型的酶切,無法對(duì)多種HPV分型進(jìn)行篩查。為了能夠?qū)崿F(xiàn)多種分型的篩查,Yi等[26]利用多種酶對(duì)HPV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切(見圖4),然后利用MCE分離得到HPV分型的指紋特征,再利用開發(fā)的HPV分型軟件,能夠一次實(shí)現(xiàn)47種HPV分型的識(shí)別。其中,多種酶和HPV指紋特征的應(yīng)用,極大地提高了HPV分型檢測(cè)的準(zhǔn)確度,降低了假陰性和假陽性概率。相比于傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)技術(shù)和PCR-MCE檢測(cè),PCR-RFLP-MCE的方法不僅可以檢測(cè)出已知HPV分型,還可以通過指紋特征檢查出未知的HPV分型。這種方法不需要特異性探針,可以進(jìn)行在線熒光標(biāo)記,具有更高的自動(dòng)化性能。此外,自動(dòng)化分型分析軟件的開發(fā)不僅節(jié)省了分析時(shí)間,而且減小了主觀誤差率,克服了傳統(tǒng)HPV分型分析煩瑣操作的缺點(diǎn),為HPV分型的全自動(dòng)化檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。Yi等[26]將PCR-RFLP-MCE自動(dòng)分型法獲得的結(jié)果與細(xì)胞學(xué)檢查和DNA測(cè)序方法對(duì)比,結(jié)果顯示陽性檢出率是傳統(tǒng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的4倍,檢測(cè)出單一感染占2/3,分型準(zhǔn)確度大于90%。證明了PCR-RFLP-MCE自動(dòng)分型方法的優(yōu)越性以及用于輔助宮頸癌早期診斷HPV篩查的可能性。

2.3 MCE用于HPV病毒mRNA的檢測(cè)

對(duì)于HPV感染相關(guān)疾病的分子生物學(xué)檢測(cè),最直接的方法莫過于直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。這樣不僅能進(jìn)行HPV分型的確認(rèn),還可以發(fā)現(xiàn)新的亞型。該方法對(duì)測(cè)序樣品的純度要求高,一般的PCR擴(kuò)增體系成分復(fù)雜,容易導(dǎo)致測(cè)序有誤。充分利用酶切技術(shù),根據(jù)不同類型HPV DNA特定內(nèi)切酶的酶切片段長(zhǎng)度的不同,也可實(shí)現(xiàn)HPV的篩査和分型。但多種酶的使用容易產(chǎn)生大量的DNA短片段,使HPV分型難以確定。此外,有研究表明基于PCR的HPV DNA檢測(cè)無法識(shí)別轉(zhuǎn)錄活性病毒,是引起假陰性的一個(gè)重要原因。據(jù)報(bào)道[27],有14% HPV DNA檢測(cè)陽性的口咽和舌根鱗狀細(xì)胞癌在hrHPV E6/E7 mRNA的檢測(cè)中表達(dá)為陰性和低的HPV DNA病毒載量。因此,HPV的DNA檢測(cè)只可作為“旁觀者”檢測(cè)分型。PCR檢測(cè)的結(jié)果用于HPV分型的鑒定受到了一定的質(zhì)疑。mRNA的轉(zhuǎn)錄水平能夠相對(duì)準(zhǔn)確地反映出細(xì)胞內(nèi)癌蛋白的表達(dá)。因此,檢測(cè)編碼癌蛋白的mRNA可作為蛋白質(zhì)直接檢測(cè)的方法。有研究表明,在高級(jí)別的宮頸病變中,宮頸刮片中利用E6/E7 mRNA的陽性檢出率高于HPV DNA的檢出率,其主要原因可能是因?yàn)镠PV mRNA的表達(dá)水平能夠更好地體現(xiàn)具有細(xì)胞轉(zhuǎn)化潛能的HPV激活感染程度,而HPV DNA的篩査容易受到臨床無關(guān)條件的影響[28]。

各種各樣的HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)方法逐漸發(fā)展起來,包含了原位熒光雜交技術(shù)和自取樣技術(shù)的HPV mRNA分析[29-31]。其中,HPV mRNA的高靈敏檢測(cè)主要通過擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),如利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)以及后來發(fā)展的依賴核酸序列擴(kuò)增(NASBA)技術(shù)對(duì)HPV mRNA目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增[32]。

圖 5 NASBA用于HPV E6/E7 mRNA的擴(kuò)增Fig. 5 Amplification of HPV E6/E7 mRNA based on nucleic acid sequence based amplification (NASBA)

圖 6 NASBA-MCE用于HPV16、18型的E6/E7 mRNA的檢測(cè)Fig. 6 Detection of E6/E7 mRNA of HPV16 and HPV18 by NASBA-MCE

在這兩種擴(kuò)增技術(shù)中,RT-PCR是一種發(fā)展成熟的RNA擴(kuò)增方法,擴(kuò)增的過程需要借助溫度循環(huán)裝置來保證目標(biāo)片段的選擇性擴(kuò)增。NASBA是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),擴(kuò)增過程中所需的溫度變化較少,不需要復(fù)雜的變溫過程(見圖5)。然而NASBA的擴(kuò)增過程以RNA作為對(duì)象,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求嚴(yán)格。Liu等[33]分別對(duì)HPV16、18型的E6/E7 mRNA的3種常用擴(kuò)增方法(NASBA、一步法RT-PCR和兩步法RT-PCR)進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)盡管NASBA-MCE(見圖6)操作簡(jiǎn)單,具有較好的靈敏度和特異性,但該方法的重現(xiàn)性不夠理想。此外,一步法RT-PCR操作相對(duì)簡(jiǎn)單,但引物的特異性不高,導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象嚴(yán)重。采用降落(Touch Down)的一步法RT-PCR用于HPV mRNA的擴(kuò)增,通過MCE分析,發(fā)現(xiàn)利用Touch Down的RT-PCR能夠較大地提高方法的靈敏度,但是非特異性擴(kuò)增并沒有得到明顯改善,非特異性擴(kuò)增仍然嚴(yán)重。利用MCE比較3種不同擴(kuò)增方法的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物的MCE遷移時(shí)間明顯受到一步法RT-PCR和NASBA擴(kuò)增體系的影響。但是兩步法RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的MCE遷移時(shí)間并不受體系影響,也較少受到樣品基質(zhì)的影響。因此,兩步法RT-PCR-MCE非常有利于實(shí)際樣品的HPV mRNA檢測(cè)。Liu等[33]推測(cè)這可能是因?yàn)閮刹椒≧T-PCR降低了非特異性擴(kuò)增,從而改善了分析的穩(wěn)定性。將3種HPV16和18型E6/E7 mRNA結(jié)果相比,還發(fā)現(xiàn),兩步法RT-PCR-MCE具有更高的靈敏度和特異性,能夠進(jìn)行更準(zhǔn)確的半定量分析[33]。

2.4 其他HPV檢測(cè)方法

HPV的檢測(cè)在宮頸癌、直腸癌、陰莖癌等疾病早期篩查中扮演著重要角色,很大程度上提高了癌前病變的檢出效果。隨著人們對(duì)HPV和相關(guān)癌癥病變關(guān)系的深入了解,HPV-DNA/RNA檢測(cè)在癌癥病變?nèi)鐚m頸病變預(yù)防、篩查、診治及隨訪檢測(cè)中的作用日益顯現(xiàn),也由最初的細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)展了多種不同的檢測(cè)技術(shù),除了MCE外,還包含了傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)[34]、電化學(xué)法[35,36]、電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法[37]、比色法[38]等,具體見表1。Viana等[34]通過PCR進(jìn)行HPV DNA目標(biāo)片段的擴(kuò)增后,通過FI-IR技術(shù)進(jìn)行HPV分子的識(shí)別和檢測(cè)。Mahmoodi等[35]為了提高HPV DNA檢測(cè)的靈敏度,以HPV 18 DNA為檢測(cè)對(duì)象,將還原氧化石墨烯和多壁碳納米管沉積在絲網(wǎng)印刷碳上的電極上,進(jìn)一步將金納米粒子沉積到改性的電極上,再將單鏈DNA捕獲探針通過金-巰基鍵合到電極上,最后通過脈沖伏安法實(shí)現(xiàn)了HPV18 DNA的高靈敏檢測(cè)。Avelino等[36]則利用含金納米粒子的聚苯胺膜結(jié)合阻抗分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多種HPV DNA的檢測(cè)。此外,Nie等[37]利用鋅摻雜的二硫化鉬量子點(diǎn)和亞銅粒子氧化還原羥基形成水,結(jié)合T7外切酶,成功建立了HPV16 DNA的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。Mukama等[39]通過LAMP技術(shù)對(duì)HPV16和HPV18的目的片段進(jìn)行擴(kuò)增后,利用CRISPR/Cas12a的分裂和側(cè)流生物傳感器實(shí)現(xiàn)了超高靈敏的檢測(cè)。比色法由于無需專門儀器、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便而被廣泛使用。在HPV檢測(cè)中為了能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)便分析,Fan等[24]不僅利用環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù),還結(jié)合甜菜堿、氯化錳和鈣黃綠素實(shí)現(xiàn)了可視化檢測(cè)。HPV mRNA檢測(cè)大部分是基于原位雜交的檢測(cè)方法[40,41]以及部分基于DNA酶的比色法[38]。

表 1 信號(hào)放大技術(shù)與除MCE外的其他檢測(cè)方法用于HPV檢測(cè)

3 MCE在HPV檢測(cè)的挑戰(zhàn)與展望

近年來,將微流控芯片技術(shù)和電泳技術(shù)完美地結(jié)合在一起的MCE已成為當(dāng)今臨床疾病檢測(cè)的一個(gè)相對(duì)成熟的分析技術(shù)。MCE的快速發(fā)展為生物標(biāo)志物的研究提供了有力的解決方案和方法。一些課題組[42-44]將PCR裝置器件和MCE器件集成在一個(gè)芯片上,并開展了短串聯(lián)重復(fù)序列測(cè)定和原位病原體診斷研究工作。然而,高集成的MCE在HPV分析檢測(cè)中仍存在一些挑戰(zhàn)。首先,雖然MCE裝置可以很好地進(jìn)行HPV的分離檢測(cè),但目前的MCE技術(shù)本身卻無法實(shí)現(xiàn)HPV的高靈敏和高選擇性檢測(cè)。其次,即使有部分研究者成功地將PCR和MCE集成在一個(gè)芯片上,但是在HPV檢測(cè)方面仍然沒有集成化的PCR-MCE芯片。由于每一種目標(biāo)物擴(kuò)增時(shí)所需要的溫度不同,微小的溫度差異可能會(huì)帶來完全不同的結(jié)果。因此,無法將已經(jīng)開發(fā)的PCR-MCE芯片直接用于HPV分型的檢測(cè)。MCE芯片技術(shù)的另一個(gè)瓶頸是微型化、自動(dòng)化MCE器件的研制。微型化器件的制造常常需要專業(yè)的多學(xué)科團(tuán)隊(duì)的合作和一系列復(fù)雜加工的制造工藝。因此,MCE器件仍然無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模低成本生產(chǎn)。雖然MCE在HPV的檢測(cè)以及其他生物標(biāo)志物的檢測(cè)方面仍存在著重重挑戰(zhàn)。但是我們相信，未來MCE將向微型化、高集成化以及自動(dòng)化方向發(fā)展。此外,由于個(gè)性化診斷和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,我們相信MCE技術(shù)在將來能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)HPV實(shí)時(shí)快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),也能夠發(fā)展出低成本、簡(jiǎn)單、高通量的便攜式現(xiàn)場(chǎng)診斷技術(shù)甚至是穿戴式的HPV檢測(cè)技術(shù)。

4 結(jié)論

MCE技術(shù)是一種快速、實(shí)時(shí)、可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜物質(zhì)現(xiàn)場(chǎng)分析的強(qiáng)有力技術(shù)。因此,越來越多的研究者們致力于MCE技術(shù)的集成化、微型化、自動(dòng)化和高通量研究。首先,隨著MCE技術(shù)的逐漸成熟,用于HPV自動(dòng)化檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化MCE芯片和平臺(tái)將逐步實(shí)現(xiàn)。其次,各種不同的高選擇性HPV探針和高靈敏的檢測(cè)方法將再次發(fā)展并得到進(jìn)一步的推廣和應(yīng)用。最后,人們不僅能夠?qū)CR平臺(tái)集成在MCE芯片上,未來還將集成更多的功能,如樣品前處理中的萃取濃縮等技術(shù)。此外,高通量的MCE HPV檢測(cè)技術(shù)在未來將得到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。因此,雖然目前MCE在HPV分型檢測(cè)中仍然不成熟,存在著一些挑戰(zhàn),但在未來,MCE將繼續(xù)得到發(fā)展和應(yīng)用。