毛細(xì)管電泳用于藥物分析的研究進(jìn)展

許 旭, 陳 鋼, 劉 浩

(1. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué), 上海 201418; 2. 上海市食品藥品檢驗(yàn)所, 上海 201203; 3. 國(guó)家藥監(jiān)局治療類(lèi)單抗質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201203)

藥物分析是毛細(xì)管電泳(CE)的重要應(yīng)用領(lǐng)域,持續(xù)提供著許多不同類(lèi)型和有實(shí)際研究?jī)r(jià)值的研究需求,也不斷將CE的研究成果應(yīng)用到藥物研發(fā)、生產(chǎn)以及臨床應(yīng)用與評(píng)價(jià)等各環(huán)節(jié)。CE用于藥物分析的研究文獻(xiàn)較多,本文從藥品分析領(lǐng)域中的化學(xué)藥物、中藥、生物制品,以及體內(nèi)藥物分析幾個(gè)方面綜述了近幾年毛細(xì)管電泳在這些傳統(tǒng)藥物分析中應(yīng)用的研究進(jìn)展。對(duì)于現(xiàn)代藥物分析研究比較活躍的理化常數(shù)測(cè)定、親和毛細(xì)管電泳與結(jié)合常數(shù)研究(包括藥物與受體間的相互作用等)、臨床分析生物標(biāo)志物、代謝組學(xué),以及微流控芯片CE分析等方面的研究,文獻(xiàn)內(nèi)容較多,本文限于篇幅未做討論。本文主要涉及2017年1月至2020年2月近3年的文獻(xiàn)，也包括一些2016年的文獻(xiàn)和之前的少量相關(guān)文獻(xiàn)。在概述這段時(shí)期CE在傳統(tǒng)藥物分析領(lǐng)域新進(jìn)展的同時(shí),本文討論了目前這些傳統(tǒng)藥物分析領(lǐng)域的需求,以及CE在其中的地位、挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

Deeb等[1]在對(duì)2013～2015年CE在藥物分析中的應(yīng)用研究評(píng)述中,提到不少傳統(tǒng)藥物分析領(lǐng)域的技術(shù)需求,包括人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)對(duì)藥物分析方法的要求,以及進(jìn)樣方法和檢測(cè)靈敏度等常見(jiàn)CE方法問(wèn)題。屈鋒實(shí)驗(yàn)室[2-5]近3年以及之前的毛細(xì)管電泳年度綜述均包括藥物分析的內(nèi)容。Kristoff等[6]總結(jié)了CE在蛋白質(zhì)、藥物、糖基化分析,以及外泌體與病毒分析等生物分析方面的重要進(jìn)展。Voeten等[7]發(fā)表在AnalyticalChemistry的年度綜述總結(jié)了CE在2015年9月至2017年9月的研究進(jìn)展。近期有關(guān)CE-MS的研究引起了人們的關(guān)注,Stolz等[8]綜述了CE-MS的研究進(jìn)展,包括在單克隆抗體與藥物的應(yīng)用。周韋等[9]綜述了CE-MS在藥物和生物制品分析中的應(yīng)用。本文從小分子藥物及其有關(guān)物質(zhì)、手性分離、中藥與天然產(chǎn)物、體內(nèi)藥物分析、大分子與生物制品分析幾個(gè)方面具體討論近幾年CE在這些傳統(tǒng)藥物分析中應(yīng)用的研究進(jìn)展。

1 小分子藥物及其有關(guān)物質(zhì)

1.1 法規(guī)需求

小分子藥物的分析越來(lái)越關(guān)注到ICH的方法要求。Deeb等[1]在評(píng)述時(shí)關(guān)注到ICH Q8指南中“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”(quality by design, QbD)的策略對(duì)藥物分析方法建立的要求。戴勝云等[10]綜述了QbD在藥物分析方法開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用研究進(jìn)展。QbD要面向需求,通過(guò)系統(tǒng)化、結(jié)構(gòu)化、層層遞進(jìn)的方式建立分析方法。Pasquini等[11]基于QbD原理,使用γ-環(huán)糊精-正丁醇-膽酸鈉-硼酸鹽分離緩沖液,建立了毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MEKC)快速測(cè)定卡托普利、氫氯噻嗪及其有關(guān)物質(zhì)的方法。

中國(guó)藥典四部(2015版)在通則9101“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”中規(guī)定[12]:精密度可接受范圍與樣品中待測(cè)定成分含量有關(guān),待測(cè)定成分含量在1%以上時(shí)重復(fù)性(RSD)要求低于2%,而CE直接定量的重復(fù)性(RSD)多在3%左右。雖然不少文獻(xiàn)中日內(nèi)RSD小于2%,但推廣應(yīng)用時(shí)常常達(dá)不到要求。因此,對(duì)多數(shù)含量高于1%的藥品主成分,CE方法需要改進(jìn)重復(fù)性問(wèn)題。郭懷忠等[13]曾經(jīng)在2005年系統(tǒng)討論過(guò)影響毛細(xì)管電泳分析結(jié)果重現(xiàn)性的因素及其控制途徑,至今仍然有很好的參考價(jià)值。改進(jìn)精密度的常見(jiàn)方法是內(nèi)標(biāo)法。Lago等[14]以呋喃苯胺酸為內(nèi)標(biāo),建立了測(cè)定替帕那韋(tipranavir)膠囊的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CZE)，方法精密度<2%,將該法用于藥品在酸性、堿性、熱性、光解性和氧化性條件下的穩(wěn)定性評(píng)價(jià),顯示氧化為主要降解途徑。Guichard等[15]建立了兩種CE方法用于內(nèi)標(biāo)法定量分析注射劑中的16種抗腫瘤藥物。一種是使用含50%乙腈的分離緩沖液建立的CZE方法，用于分析阿霉素、表阿霉素、伊達(dá)比星、道諾霉素、伊立替康、拓?fù)涮婵?、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春瑞濱。另一種是MEKC使用含20%乙腈的硼酸鹽-十二烷基硫酸鈉(SDS)分離緩沖液測(cè)定甲氨蝶呤、培美曲塞、依托泊苷、磷酸依托泊苷、磷酸氟達(dá)拉濱和5-氟尿嘧啶。胡雯雯等[16]使用閻超研究團(tuán)隊(duì)[17]此前開(kāi)發(fā)的基于定量閥進(jìn)樣的商品化儀器(原理圖見(jiàn)圖1),同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素B片中5種維生素,直接測(cè)定峰面積的日內(nèi)RSD在1.9%以內(nèi),顯著優(yōu)于普通CE儀器。近期另一臺(tái)值得關(guān)注的儀器是浙江大學(xué)方群教授實(shí)驗(yàn)室[18]開(kāi)發(fā)的手持式CE儀器,使用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)、短柱和缺口管進(jìn)樣技術(shù),具有體積小、成本低的特點(diǎn),已用于氨基酸、蛋白質(zhì)和DNA的分析。

圖 1 基于定量閥進(jìn)樣的高精度毛細(xì)管電泳儀器原理圖[17]Fig. 1 Schematic overview of automated quantitative capillary electrophoresis system[17]

1.2 電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)法(C4D)

C4D適用于缺乏生色團(tuán)成分的檢測(cè),近來(lái)得到廣泛應(yīng)用。Elbashir等[19]綜述了2014年2月到2016年10月期間CE-C4D在藥物、生物醫(yī)學(xué)和食品分析領(lǐng)域的應(yīng)用文獻(xiàn),其中以藥物分析的應(yīng)用居多。Cunha等[20]建立了在2 min內(nèi)快速測(cè)定不同制劑中可待因、鄰甲苯海明、異丙嗪、東莨菪堿、曲馬多和撲熱息痛含量的CE-C4D方法,檢出限為0.62～15 μmol/L。de Castro Costa等[21]采用CE-C4D在1 min內(nèi)超快速同時(shí)測(cè)定了藥品中銨和苯海拉明的含量。他們使用2-(N-嗎啉諾)乙醇磺酸-氫氧化鋰(pH 6.0)作為背景緩沖液。氨和苯海拉明的檢出限分別為0.04 mmol/L和0.02 mmol/L。他們[22]還提出CE-UV和CE-C4D快速測(cè)定精氨酸、抗壞血酸和天冬氨酸的方法,每小時(shí)分別可以測(cè)定23和78次,LOD均為0.01～0.04 mmol/L。Nguyen等[23]設(shè)計(jì)了一種CE-C4D系統(tǒng),可用于β-內(nèi)酰胺抗生素的質(zhì)量控制與摻偽識(shí)別。Evans等[24]用便攜式CE-雙C4D分別測(cè)定了3種含偽麻黃堿的市售片劑(見(jiàn)圖2)和兩種違禁藥物(甲基酮和對(duì)甲氧基甲基苯丙胺)的無(wú)機(jī)陰離子和無(wú)機(jī)陽(yáng)離子譜。10個(gè)陽(yáng)離子的檢出限為0.10～1.25 μmol/L, 8個(gè)陰離子檢出限為0.13～1.03 μmol/L。兩類(lèi)離子的CE分離分別都在6 min內(nèi)完成,測(cè)得的離子指紋數(shù)據(jù)可用于對(duì)未知樣品的分類(lèi)。

圖 2 3種市售含偽麻黃堿藥片的(a)無(wú)機(jī)陽(yáng)離子和(b)陰離子CE-C4D譜圖[24]Fig. 2 CE-C4D chromatograms of (a) cations and (b) anions in the three kinds of commercially available tablets containing pseudoephedrine[24] C4D: capacitively coupled contactless conductivity detection; STD: standard samples; EPH: pharmaceutical tablet containing pseudoephedrine. Peaks in Fig. 1a: 1. Cs+ (IS), 2. 3. K+, 4. Ca2+, 5. Na+, 6. Mg2+, 7. Mn2+, 8. Sr2+, 9. Ba2+, 10. Li+; peaks in Fig. 1b: 1. Cl-, 2. 6. F-(IS), 7.

1.3 間接檢測(cè)方法

1.4 CE-MS分析

dos Santos等[28]用CE-MS/MS測(cè)定天然減肥藥和膳食補(bǔ)充劑中安非他明及其衍生物芬特明(PTM)、甲基苯丙胺(MAM)、甲二氧基安非他明(MDA)、甲二氧基甲基安非他明(MDMA)和甲二氧基乙基安非他明(MDEA)。樣品經(jīng)改良的QuEChERS方法處理,檢出限為0.02～0.06 μg/L。Ouyang等[29]采用電滲流泵鞘流納噴接口,實(shí)現(xiàn)了負(fù)離子模式下的毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)-MS聯(lián)用,并用于按照電荷差異精細(xì)分離識(shí)別硫酸軟骨素和硫酸肝素中不同結(jié)構(gòu)的酸性低聚糖,鞘流液是含乙酸銨的甲醇-水溶液。此前該團(tuán)隊(duì)的Sun等[30]采用相同的電滲流泵鞘流接口,用CZE-MS在正離子模式下分析了肝素低聚糖和低分子量肝素,使用的分離緩沖液是揮發(fā)性碳酸氫銨,鞘流液是含甲酸的甲醇-水溶液。Ansar等[31]先用含10%蔗糖的磷酸緩沖液(20 mmol/L, pH 6.5),在對(duì)脂質(zhì)體最小影響的條件下,用CE直接測(cè)定脂質(zhì)體阿霉素制劑中未包封阿霉素的含量。他們[32]還進(jìn)一步建立了CE與電感耦合等離子體(ICP)-MS/MS聯(lián)用方法,可在脂質(zhì)體破壞最小的情況下直接定量測(cè)定阿霉素脂質(zhì)體制劑中在脂質(zhì)體內(nèi)外不同狀態(tài)的硫酸鹽含量。

1.5 離子液體

李敏等[33]以30 mmol/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體水溶液為背景電解質(zhì),以頭孢拉定為內(nèi)標(biāo),CE同時(shí)測(cè)定頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢曲松和頭孢米諾4種注射用頭孢藥物的含量。離子液體經(jīng)二氯甲烷萃取回收可重復(fù)使用。離子液體在手性藥物分析方面也有較多研究[34,35]。

1.6 藥物有關(guān)物質(zhì)分析

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心公布的《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[36]指出,“由于各種分析方法均具有一定的局限性,因此在進(jìn)行雜質(zhì)分析時(shí),應(yīng)注意不同原理的分析方法間的相互補(bǔ)充與驗(yàn)證,如HPLC與TLC及HPLC與CE的互相補(bǔ)充……”。說(shuō)明在藥品雜質(zhì)分析研究時(shí),需要用CE作為“互補(bǔ)技術(shù)”去發(fā)現(xiàn)目前HPLC方法難以分離分析甚至未檢出的雜質(zhì)。這種“互補(bǔ)技術(shù)”的應(yīng)用也是各國(guó)藥品審評(píng)指導(dǎo)原則的要求。

藥品中諸雜質(zhì)的種類(lèi)與含量被總稱為雜質(zhì)譜,Holm等[37]綜述了藥物雜質(zhì)譜分析的研究進(jìn)展,討論了ICH在藥物雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)控制方面的若干準(zhǔn)則和策略。Dispas等[38]介紹了可應(yīng)用于雜質(zhì)檢測(cè)方法的QbD原理和統(tǒng)計(jì)策略,并對(duì)QbD應(yīng)用這類(lèi)分析方法的文獻(xiàn)進(jìn)行了綜述。G?r?g[39]則評(píng)述了包括CE在內(nèi)的近十年來(lái)對(duì)映體雜質(zhì)的藥物雜質(zhì)譜和降解譜方面的研究進(jìn)展。畢萌萌等[40]建立了原料藥中呋喃西林及其雜質(zhì)5-硝基糠醛二乙酯的MEKC分析方法。楊直等[41]建立了CZE測(cè)定鹽酸雷尼替丁注射液中雷尼替丁和3個(gè)有關(guān)物質(zhì)含量的方法。Fayed等[42]在化學(xué)計(jì)量學(xué)優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立了CZE同時(shí)測(cè)定佐芬普利鈣、氫氯噻嗪,以及氫氯噻嗪的兩種主要雜質(zhì)氯噻嗪(chlorothiazide)和沙胺(salamide)。de Souza等[43]建立了CE分析呋喃苯胺酸(furosemide)及其降解樣品的方法,并做了方法認(rèn)證,該藥在中性、酸性和堿性條件下的水解,以及氧化、熱和光引起的降解產(chǎn)物不影響其定量。

1.7 手性藥物的對(duì)映體雜質(zhì)分析

中國(guó)藥典四部(2015版)[12]在通則9102“藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則”指出,對(duì)于立體異構(gòu)體雜質(zhì)的檢測(cè)廣泛采用手性色譜法和高效毛細(xì)管電泳法。

Saz等[44]綜述了環(huán)糊精用于CE手性藥物分析的研究進(jìn)展。Fanali等[45]在詳細(xì)總結(jié)CE手性拆分各方面已有成果的基礎(chǔ)上,討論了近十年進(jìn)展緩慢的原因和未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。潘聰潔等[46]綜述了2013～2015年CE用于手性分離的進(jìn)展。劉明霞等[47]綜述了2017～2019年CE在手性分離分析方面的進(jìn)展。杜迎翔等[48]綜述了近年來(lái)二元手性選擇劑CE拆分體系的進(jìn)展。吐?tīng)栠d·賈娜爾[34]綜述了手性離子液體在毛細(xì)管電泳手性分離中的應(yīng)用。Hancu等[49]綜述了CE在抗抑郁藥(氟西汀、西酞普蘭、舍曲林、文拉法辛和度洛西汀)對(duì)映體分離中的應(yīng)用。Ali等[50]綜述了手性喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)映體拆分的色譜和電泳方法,還提出一些選擇手性分離條件的建議。

本文側(cè)重討論與傳統(tǒng)藥物分析應(yīng)用領(lǐng)域密切相關(guān)的研究進(jìn)展,不再特別討論手性拆分劑與拆分方法研究方面的內(nèi)容。

1.7.1檢測(cè)靈敏度

對(duì)映體雜質(zhì)分析通常需要在手性分離的基礎(chǔ)上能夠定量含量低至0.1%的對(duì)映體,《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[36]對(duì)不同劑量的原料藥和制劑中雜質(zhì)(包括對(duì)映體雜質(zhì))的報(bào)告限度一般為0.03%～0.1%,質(zhì)控限度一般為0.05%～1.0%,這對(duì)CE對(duì)映體分離的檢測(cè)靈敏度提出了一定要求。Sánchez-López等[51]綜述了2013年6月到2015年5月有關(guān)手性CE中改進(jìn)檢測(cè)靈敏度的進(jìn)展。esták等[52]以消旋美沙酮為樣品,帶負(fù)電荷的β-環(huán)糊精硫酸酯為手性選擇劑,通過(guò)對(duì)低電導(dǎo)率樣品溶液中的陽(yáng)離子進(jìn)行柱頭場(chǎng)放大濃縮,改善CE手性分析的檢測(cè)靈敏度。Casado等[53]比較不同環(huán)糊精的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,結(jié)果硫酸化-γ-CD(sulfated-γ-CD)作為手性拆分劑分離伊伐布雷定(ivabradine)效果最好,而且加入氨基酸手性離子液體(單獨(dú)使用沒(méi)有得到手性分離)則可以增加分離度,建立的方法可以檢測(cè)0.1%的對(duì)映體雜質(zhì)。徐梓馥等[54]用羧甲基-β-CD和L-組氨酸-Cu2+雙手性手性選擇劑CE拆分氧氟沙星對(duì)映體,可以檢測(cè)到0.1%的對(duì)映體雜質(zhì)成分。

1.7.2QbD原理應(yīng)用

基于QbD原理,Orlandini等[55]建立了環(huán)糊精修飾的膠束電動(dòng)色譜法同時(shí)測(cè)定手性藥物氨布里西坦(ambrisentan)的對(duì)映體雜質(zhì)和有關(guān)物質(zhì)。Pasquini等[56]使用羥丙基-γ-環(huán)糊精(HP-γ-CD)手性拆分,建立了CE同時(shí)測(cè)定手性藥物西那卡塞(cinacalcet)對(duì)映體純度和雜質(zhì)含量的方法?；赒bD,以手性分離度和分析時(shí)間為指標(biāo),經(jīng)過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)、確定“可操作的方法設(shè)計(jì)區(qū)域(method operable design region, MODR)”、Plackett-Burman耐用性檢驗(yàn),以及基于ICH的方法驗(yàn)證,最后用于實(shí)際樣品分析。Krait等[57]基于QbD,以硫酸化β-CD為拆分劑建立了CE測(cè)定右美托咪定手性純度的方法,可測(cè)定0.1%的雜質(zhì)含量。

1.7.3體液手性藥物分析

生物液體中藥物低濃度的手性分離分析是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。ebestová等[58]利用CE-ICP/MS以sulfated-γ-CD作為手性拆分劑測(cè)定了尿樣中的抗腫瘤藥奧沙利鉑對(duì)映體。檢出限為64 ng/mL。Wu等[59]用聚去甲腎上腺素包被磁性納米顆粒和手性毛細(xì)管電泳手性分離分析了3種β-受體拮抗劑(卡特洛爾、美托洛爾和倍他索洛爾)。結(jié)合場(chǎng)增強(qiáng)進(jìn)樣,檢出限為0.401～1.59 ng/mL,并用于人體尿液樣品分析。該實(shí)驗(yàn)室Xiao等[60]還用聚多巴改性磁性納米顆粒固相萃取結(jié)合手性CE方法,手性分離分析了尿樣和牛血清中微量加標(biāo)氧氟沙星外消旋體。結(jié)合壓力輔助場(chǎng)增強(qiáng)進(jìn)樣,檢出限低至0.29 ng/mL。楊四梅等[35]使用L-脯氨酸-Cu2+-氯化-1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)的Tris-磷酸緩沖液,以離子液體促進(jìn)的手性配體交換CE分離分析去氧腎上腺素光學(xué)異構(gòu)體,并用于加標(biāo)血液和尿液樣品中R和S型去氧腎上腺素的測(cè)定。

手性CE分析可以看成是特殊的難分離雜質(zhì)分析,與化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的需求相關(guān)。目前使用手性固定相的HPLC應(yīng)用較多,也解決了大部分對(duì)映體雜質(zhì)的分析檢測(cè)問(wèn)題。CE因其易于在緩沖液中使用不同的手性添加劑而獨(dú)具特色,可在手性HPLC難分離對(duì)映體樣品的分析方面發(fā)揮重要作用。而且CE手性拆分時(shí),拆分劑與對(duì)映體藥物處于均處于自由溶液中,為研究手性藥物與受體的識(shí)別提供了良好條件。

1.8 制劑分析

Contin等[61]建立了MEKC分析兒科制劑中艾地苯醌(idebenone)的分析方法，并做了方法認(rèn)證。結(jié)果表明，該成分存在兩種不同氧化還原狀態(tài)和生物活性。Kogawa等[62]提出一種定量分析片劑中利福昔明(rifaximin)的CE方法。王萍等[63]用CE測(cè)定消毒劑與藥品中的利巴韋林時(shí),利用十六烷基三甲基溴化銨反轉(zhuǎn)電滲流縮短了分析時(shí)間。Junger等[64]建立了CE快速測(cè)定不同制劑中麻醉劑苯佐卡因和利多卡因的方法。Mufusama等[65]建立了CZE測(cè)定抗瘧復(fù)方制劑中阿莫地喹及其中含量≤0.5%的3種合成雜質(zhì)的方法，并根據(jù)ICH的質(zhì)量指南Q2(R1)文件的規(guī)定做了方法驗(yàn)證。

1.9 其他

Kowalski等[66]利用SDS單體與大環(huán)抗生素的相互作用,結(jié)合場(chǎng)放大進(jìn)樣,使用含有60% (v/v)乙腈的緩沖液分離了螺旋霉素、伊維菌素、泰樂(lè)霉素、交沙霉素、雷帕霉素和利福霉素。張含智等[67]用CE測(cè)定了環(huán)肽抗生素硫酸多黏菌素中4種多黏菌素B成分,分離緩沖液為含有HP-β-CD和異丙醇的磷酸三乙醇胺緩沖液(pH 2.5)。Wingert等[68]用微乳電動(dòng)色譜建立定量分析抗凝血藥利伐沙班的方法,并評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。

在靈敏度和精密度不如藥物分析常用的HPLC時(shí),CE可通過(guò)多種分離模式提供獨(dú)特的選擇性,獲得與常用HPLC不同的分離效果。在新藥審評(píng)中普遍關(guān)注的雜質(zhì)研究方面,應(yīng)用CE可能分離出常規(guī)HPLC未分離而漏檢的雜質(zhì)。這個(gè)互補(bǔ)技術(shù)的概念也提示,尋找HPLC分析的難點(diǎn)、發(fā)揮CE的長(zhǎng)處,也是CE研究值得注意的方向。

另一方面,CE在分離效率、選擇性、快速與經(jīng)濟(jì)性的優(yōu)勢(shì)仍然存在,產(chǎn)生CE應(yīng)用研究目前現(xiàn)狀的原因與其靈敏度和精密度密切相關(guān),這兩方面的進(jìn)展都可能顯著擴(kuò)展未來(lái)CE的應(yīng)用領(lǐng)域,對(duì)CE的應(yīng)用研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響,值得關(guān)注。

2 中藥與天然藥物分析

2.1 CE分離分析方法研究

Liu等[70]使用甲基-乙烯基咪唑(methyl-vinylimidazole)官能團(tuán)化有機(jī)聚合物單體，自制的整體柱,采用毛細(xì)管電色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定了吳茱萸果實(shí)中3種生物活性成分吳茱萸胺(evodiamine)、吳茱萸次堿(rutaecarpine)、吳茱萸內(nèi)酯(limonin)的含量。李曉慧等[71]制備聚甲基丙烯酸丁酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯整體SPE材料,與CE聯(lián)合分離檢測(cè)桑葉中蘆丁、綠原酸、槲皮素等成分。

曾雪等[72]用加入β-CD的CZE方法測(cè)定了三黃片中大黃素和大黃酚。Sereia等[73]使用含HP-β-CD的硼酸緩沖液為背景電解質(zhì),建立了巴西藥用植物卡圖巴(Trichiliacatigua)樹(shù)皮乙酸乙酯部位多種非對(duì)映異構(gòu)多酚成分的CE-UV測(cè)定方法。

2.2 檢測(cè)方法

Zhou等[74]將聚醚醚酮(PEEK)毛細(xì)管用于CE-MS,使用高有機(jī)溶劑體系分析中藥中多組活性生物堿,表現(xiàn)出良好的分離性能,并應(yīng)用于浙貝母藥材中貝母甲素(peimine)和貝母乙素(peiminine)的高靈敏定量分析。Cheng等[75]用自建的基于小離心管流動(dòng)溶液電噴霧接口的非水CE-MS方法,以二羥基蒽二酮為內(nèi)標(biāo),分離測(cè)定了中藥大黃中大黃素甲醚、大黃酚和蘆薈大黃素。

Sun等[76]采用CE-電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法測(cè)定了石蒜中加蘭他敏(galanthamine)、高石蒜堿(homolycorine)、石蒜寧堿(lycorenine)和多花水仙堿(tazettine)4種生物堿，檢出限依次為14、11、1.8和3.1 ng/mL。孫雙姣等[77]還測(cè)定了紅花石蒜中偽石蒜堿、石蒜堿和高石蒜堿,通過(guò)添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)改善了CE的分離效果。鄧光輝等[78]以CE-電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法,建立了金釵石斛中石斛堿含量的測(cè)定方法,檢出限為0.045 mg/L。他們還建立了同時(shí)檢測(cè)博落回果實(shí)中血根堿和白屈菜紅堿含量的CE電致化學(xué)發(fā)光分析方法,分離緩沖液中使用了含50%的乙腈[79]。

Wu等[80]利用Triton X-100和SDS組成的混合膠束對(duì)姜黃素天然熒光的增敏作用,建立了MEKC-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)(LIF)測(cè)定姜黃、藥用姜黃搽劑、咖喱調(diào)味料和人尿液中姜黃素、去甲氧基姜黃素、二去甲氧基姜黃素3種姜黃素類(lèi)成分的方法。唐夢(mèng)杰等[81]用CE-C4D測(cè)定中藥材連翹中齊墩果酸、熊果酸和白樺脂酸,檢出限為1.0～1.4 μg/mL。

2.3 中藥指紋圖譜

CE中藥指紋圖譜的研究發(fā)揮了CE分離復(fù)雜樣品的優(yōu)勢(shì),這方面的研究文獻(xiàn)較多。Hou等[82]提出結(jié)合CE指紋譜與線性定量分析法(linear quantitative profiling)評(píng)價(jià)苦參的質(zhì)量一致性。張蕾等[83]以硼酸鹽-SDS-無(wú)水乙醇為分離緩沖液,建立了新疆紫草的MEKC指紋圖譜,確定了6個(gè)特征峰,其中兩個(gè)峰被識(shí)別為左旋紫草素和乙酰紫草素。孫姍等[84]用CZE建立了苣荬菜的指紋圖譜,確認(rèn)9個(gè)共有峰,并識(shí)別其中3個(gè)峰分別為綠原酸、蘆丁和槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷。李成思等[85]用MEKC建立有12個(gè)共同峰的藏藥白花龍膽指紋圖譜。郭鵬等[86]采用場(chǎng)放大進(jìn)樣的CE方法測(cè)定了中藥附子的指紋圖譜,所采集的10批藥材中有8個(gè)共有峰,識(shí)別出其中苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿3個(gè)峰。陳寶龍等[87]用MEKC建立了山楂藥材的指紋圖譜,確定包括金絲桃苷在內(nèi)的16個(gè)共有峰。王玲嬌等[88]建立了木香順氣丸CE指紋圖譜,以橙皮苷為參照峰,確定了14個(gè)共有指紋峰。孫姍等[89]用CE研究了白車(chē)軸草的毛細(xì)管電泳指紋圖譜,確認(rèn)了10個(gè)共有峰?；蓐?yáng)等[90]建立了中藥材高良姜黃酮類(lèi)提取物的MEKC特征圖譜，確定了15個(gè)共有峰,并識(shí)別其中6個(gè)峰分別為兒茶精、山柰酚、槲皮素、高良姜素、山柰素-4′-甲醚和姜黃素。

張政等[91]建立了CE檢測(cè)全蝎酶解液中蛋白類(lèi)成分(>10 kDa)的指紋圖譜分析方法,并對(duì)10批樣品做了相似度評(píng)價(jià),初步確定了以25個(gè)峰為共有峰的指紋圖譜。陳莉等[92]建立了中成藥康復(fù)新液(從美洲大蠊制得)的CE指紋圖譜,確定了8個(gè)共有峰。

2.4 中藥多糖分析

依明·尕哈甫等[93]經(jīng)α-萘胺-氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)衍生,用CE測(cè)定了牛舌草多糖水解后的單糖組成。張建等[94]以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)為衍生試劑,用CZE測(cè)定不同蟲(chóng)草菌粉制劑中蟲(chóng)草粗多糖的單糖組成。

2.5 中藥分析其他方面

Alzoman等[95]建立了CE測(cè)定三花六道木(Abeliatriflora)植物葉子粗提物中黃芩苷和咖啡酸的方法。Tascon等[96]建立了CE同時(shí)測(cè)定常見(jiàn)植物中去氫駱駝蓬堿(harmine)、駱駝蓬堿(harmaline)、哈爾酚(harmol)、去甲駱駝蓬堿(harmalol)、去甲氧去氫駱駝蓬堿(harmane)和去甲哈爾滿(norharmane)6種具有精神活性的β-carboline類(lèi)生物堿的方法,用該方法分析駱駝蓬種子輸液，檢出了前3種成分。楊霞等[97]用CE同時(shí)檢測(cè)決明子中大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲大黃素甲醚和橙黃決明素5種蒽醌類(lèi)化合物。王博等[98]用MEKC同時(shí)測(cè)定了小青龍顆粒中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿與芍藥苷的含量。

盧恒等[99]還建立了人參中銅和鎘離子的MEKC-LIF測(cè)定方法。樣品用濃硝酸-過(guò)氧化氫徹底消解后,用熒光絡(luò)合劑異硫氰酸熒光素酯-偶氮乙二胺四乙酸柱前絡(luò)合其中的Cu2+與Cd2+,以pH 9.3的硼酸鹽-SDS為分離緩沖液分離,激發(fā)波長(zhǎng)為483 nm，在520 nm波長(zhǎng)下熒光檢測(cè)。

中藥作為復(fù)雜樣品,為CE的研究提供了廣闊的舞臺(tái)。目前需要考慮CE是否可以深入研究中藥這類(lèi)復(fù)雜樣品在HPLC分析中遇到的難題。其中,CE-MS分析中藥的研究值得關(guān)注。

3 體內(nèi)藥物分析

Kubáň等[100]綜述了CE用于非傳統(tǒng)體液樣品(母乳、呼吸冷凝物、汗液、唾液、羊水、腦脊液或干血斑)中1 000 Da以下小分子(離子)成分的分析。Silva等[101]綜述了測(cè)定體液樣品中搖頭丸成分的分析方法。

3.1 新方法研究

Opekar等[102]提出一種可從漢密爾頓(Hamilton)進(jìn)樣器進(jìn)樣分析μL級(jí)臨床樣品的CE分析自動(dòng)微進(jìn)樣器。注射器針頭的出口與分離毛細(xì)管的進(jìn)樣口對(duì)準(zhǔn)并相距數(shù)百μm,進(jìn)樣時(shí)從注射器中擠出的一滴樣品在毛細(xì)管的入口被捕獲進(jìn)入到毛細(xì)管,洗掉多余的樣品溶液后采用CE分離。方法測(cè)定總量10 μL鼠血漿中的抗寄生蟲(chóng)藥戊烷脒(pentamidine),使用C4D檢測(cè)器的定量限是8 μmol/L。Emara等[103]建立了毛細(xì)管柱內(nèi)衍生化結(jié)合熒光檢測(cè)的快速M(fèi)EKC測(cè)定人血清中嗎啡的方法。在含有鐵氰化鉀的背景電解質(zhì)中,嗎啡被氧化成高熒光產(chǎn)物偽嗎啡,方法檢出限為1.14 ng/mL,并用于單次口服硫酸嗎啡控釋片后血清中嗎啡的測(cè)定。Wu等[104]將熒光染料7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸作為衍生化試劑用于405 nm半導(dǎo)體LIF檢測(cè),氫氯噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮衍生后經(jīng)MEKC基線分離后的檢出限分別為0.24、0.29、和0.23 nmol/L,用于加標(biāo)人尿液樣品的分析。

3.2 體內(nèi)藥物分析的檢測(cè)靈敏度

CE-MS和CE在線濃縮的方法得到較多應(yīng)用。Piestansky等[105]研究和比較了兩種用于監(jiān)測(cè)人尿中戒煙藥伐尼克蘭(varenicline)的CE方法。一種是CZE-MS快速分析方法(分析時(shí)間7 min),另一種是低成本的基于在線樣品濃縮的CZE-UV方法,兩法都做了方法驗(yàn)證。

3.2.1CE-MS

Hernández-Mesa等[106]用CE-MS/MS建立了經(jīng)分子印跡固相萃取處理的尿液樣品中11種5-硝基咪唑類(lèi)化合物及其代謝物的分析方法，檢出限為9.6～130.2 μg/L。vidrnoch等[107]用非水CE-MS/MS建立了同時(shí)測(cè)定人血清中9種苯二氮卓類(lèi)藥物(bentazepam、etizolam、deschloroetizolam、diclazepam、flubromazepam、flubromazolam、nimetazepam、phenazepam、pyrazolam)的方法。采用25 mmol/L醋酸銨和100 mmol/L三氟乙酸的乙腈溶液為分離電解質(zhì),測(cè)定的LOD在1.5～15.0 ng/mL之間。Tejada-Casado等[108]用MEKC-MS/MS建立了同時(shí)測(cè)定動(dòng)物尿液中13種苯并咪唑的新方法。使用在線掃集模式改善靈敏度,LOD低于70 μg/L。

Sun等[109]將構(gòu)建的新型電致化學(xué)發(fā)光傳感器與毛細(xì)管電泳聯(lián)用,測(cè)定了人血漿中鹽酸喹那普利(quinapril)及其代謝物鹽酸喹普利拉(quinaprilat), LOD分別為3.6 ng/mL和3.9 ng/mL。李享等[110]基于堿性溶液中待測(cè)組分對(duì)[Ag(HIO6)2]5-(二(過(guò)碘酸氫)合銀(Ⅲ)配離子)-魯米諾體系化學(xué)發(fā)光的抑制作用,建立了測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的SPE-CE-間接化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，檢出限均為2.5 μg/mL。該團(tuán)隊(duì)的朱懷嬌等[111]則利用嗎啡對(duì)相同體系化學(xué)發(fā)光的抑制作用,建立了檢測(cè)尿液與血液中嗎啡含量的CE-間接化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法,檢出限為0.75 mg/L。Saar-Reismaa等[112]用CE熒光檢測(cè)快速分析3種致幻成分,包括唾液樣本收集過(guò)程,可在大約15 min內(nèi)完成搖頭丸濫用的檢測(cè)。

3.2.2在線濃縮

3.3 其他體內(nèi)藥物分析研究

李興華等[121]建立了高效毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法快速分離測(cè)定10-羥基喜樹(shù)堿、6-巰基嘌呤、5-氟尿嘧啶3種抗腫瘤藥物的方法。劉曉鳳等[33]用CE測(cè)定給藥大鼠血漿中頭孢地尼濃度，并計(jì)算了藥動(dòng)學(xué)參數(shù),定量限為0.2 μg/mL。胡小波等[122]建立了血漿直接進(jìn)樣測(cè)定大鼠血漿中丙吡胺游離濃度和總濃度的CE方法。Liu等[123]建立簡(jiǎn)便的CZE方法,在自殺基因抗腫瘤療法中,可同時(shí)檢測(cè)攜帶CD/5-FC自殺基因系統(tǒng)的人細(xì)胞中5-氟胞嘧啶及其目標(biāo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物5-氟尿嘧啶。有關(guān)手性藥物體內(nèi)分析已在1.7節(jié)提及。

體內(nèi)藥物分析對(duì)檢測(cè)靈敏度有較高要求,LC-MS/MS具有優(yōu)勢(shì)地位。CE的樣品使用量少,通過(guò)在線濃縮與CE-MS/MS建立起新的技術(shù)特色,在體內(nèi)藥物分析領(lǐng)域有較好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

4 生物制品藥物分析

CE已經(jīng)成為生物藥(包括單克隆抗體)完整狀態(tài)和middle-up途徑分析表征的基本工具。Kahle等[124]綜述了蛋白質(zhì)電荷異質(zhì)性分析的3種CE技術(shù):cIEF、全柱成像cIEF(icIEF)和CZE,討論了各方法實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)分析結(jié)果影響的研究進(jìn)展,總結(jié)了各方法精密度的進(jìn)展,提出開(kāi)發(fā)cIEF分析方法時(shí)的參數(shù)和范圍,對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)具有較好的實(shí)用價(jià)值。陳泓序等[125]從純度分析、等電點(diǎn)(pI)測(cè)定、電荷異質(zhì)性分析和N-寡糖分析幾方面詳細(xì)綜述了CE在單克隆抗體藥物分析中的應(yīng)用。高凡等[126]綜述了MEKC與MEKC-MS在蛋白質(zhì)分離分析方面的研究進(jìn)展。

4.1 CE-SDS

《中國(guó)藥典》2015版中收錄的“單抗分子大小變異體測(cè)定法”(通則3127)是目前單克隆抗體純度檢測(cè)的主要方法,使用含有十二烷基硫酸鈉和親水性聚合物的分離緩沖液,稱為CE-SDS。Gu等[127]使用計(jì)算機(jī)模擬和CE-SDS實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了基線干擾對(duì)治療性蛋白藥物純度測(cè)定的影響,認(rèn)為基線干擾源自樣品分析中的熱干擾以及背景電解質(zhì)的基線特征。他們還提供了改善準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn)建議。

Zhang等[128]采用SDS-毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)和柱頭場(chǎng)放大樣品堆積在線預(yù)濃縮技術(shù),僅用25 ng總蛋白實(shí)現(xiàn)了基于分子大小的蛋白質(zhì)分析。在214 nm下,病毒外殼蛋白的檢出限為0.2 ng/mL (3.3 pmol/L),靈敏度增強(qiáng)3個(gè)數(shù)量級(jí),可與銀染SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)相媲美。方法已用于分析不同血清型和轉(zhuǎn)基因的腺相關(guān)病毒(AAV)產(chǎn)品的純度。

Beckman等[129]使用CE-SDS分析RTP-1(一種Fc-Adnectin融合蛋白,約80 kDa)時(shí),分離度和峰對(duì)稱性不理想,將SDS換成十六烷基硫酸鈉(sodium hexadecyl sulfate, SHS)后,其分離度和塔板數(shù)分別提高了2.3倍和8倍(見(jiàn)圖3)。

圖 3 凝膠緩沖溶液中添加和不添加0.2% SHS的RTP-1蛋白CGE電泳圖[129]Fig. 3 CGE electropherograms of RTP-1 comparing results with or without 0.2% SHS added to the gel buffer solution[129] CGE: capillary gel electrophoresis ; SHS: sodium hexadecyl sulfate; SDS: sodium dodecyl sulfate.

Kahle等[130]使用不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)混合物比較了主要的商品化CE儀器用于CE-SDS蛋白分析的性能,有助于用戶根據(jù)實(shí)際需求選購(gòu)。

劉振東等[131]研究?jī)?yōu)化了分析非還原單克隆抗體藥物純度的前處理?xiàng)l件,認(rèn)為高pH的樣品緩沖液中封閉劑降解,易使未封閉的游離巰基介導(dǎo)鏈間二硫鍵斷裂,會(huì)導(dǎo)致樣品處理過(guò)程中出現(xiàn)非預(yù)期降解。鄧欽培等[132]用CE-SDS建立了測(cè)定人絨促性素(hCG)解離亞基的測(cè)定方法,并用于工藝開(kāi)發(fā)及穩(wěn)定性研究中檢測(cè)影響其活性的亞基解離現(xiàn)象。

4.2 生物制品的CE-MS研究

CE-MS聯(lián)用是生物藥物分析的熱點(diǎn)。Sanchez-Hernandez等[133]提出在CE-SDS與MS聯(lián)用分析抗體時(shí)在線消除SDS干擾的方法。通過(guò)在樣品進(jìn)樣區(qū)帶后注入陽(yáng)離子表面活性劑的甲醇-水溶液,利用陽(yáng)離子表面活性劑與SDS在管內(nèi)相對(duì)移動(dòng)和結(jié)合,除去與抗體結(jié)合的SDS,使抗體的CE峰變窄變強(qiáng)。例如含有0.2% (v/v) SDS的樣品中,使用十六烷基三甲基溴化銨或苯扎氯銨分別可恢復(fù)97%和95%的質(zhì)譜峰強(qiáng)度。該方法也被用于其他蛋白質(zhì)和溶于10%SDS中的抗體,以及其他包含SDS的基質(zhì)。

Le-Minh等[134]提出在天然活性條件下的CE-MS方法,在沒(méi)有去活和去折疊的活性條件下分析完整的治療藥物英利昔單抗。非去活的實(shí)驗(yàn)條件保護(hù)了單抗的構(gòu)象差異和自締合,CE毛細(xì)管使用了聚凝胺(polybrene)-硫酸葡聚糖-聚凝胺3層涂層,鞘流液為異丙醇-水-醋酸,單次分析可以同時(shí)檢測(cè)天然的和去折疊的單體以及二聚體。

圖 4 用CIEF-MS方法分析英夫利昔單抗的變體[135]Fig. 4 Identified variants of infliximab by cIEF-MS[135]cIEF: capillary isoelectric focusing.

Wang等[135]用3處通孔的小塑料離心管構(gòu)建流動(dòng)溶液接口建立了高分辨cIEF-MS聯(lián)用方法,不用抗對(duì)流劑甘油時(shí)pI的分辨率可以達(dá)到0.02 pH。以英夫利昔單抗制劑為樣品,用軌道阱(Orbitrap)質(zhì)譜成功分離了4個(gè)變體,并在10-6質(zhì)量精度下識(shí)別出13個(gè)英夫利昔單抗分子量變體(見(jiàn)圖4)。該研究團(tuán)隊(duì)的Cheng等[136]使用類(lèi)似的此前建立的非水CE-MS聯(lián)用接口,以含20 mmol/L甲酸銨的乙腈-甲醇-甲酸(20∶78∶2, v/v/v)為分離緩沖液、含2 mmol/L甲酸銨的乙醇溶液為接口溶液,分離了6種高疏水性抗菌肽temporin樣品。該團(tuán)隊(duì)[75]還將此非水CE-MS接口用于中藥成分。

Haselberg等[137]用低流量無(wú)鞘CE-MS在完整和middle-up策略(使用內(nèi)切蛋白酶IdeS)分析完整和酶切后的單克隆抗體。通過(guò)分析兩種單價(jià)納米抗體Nb1和Nb2(各自包含Myc-6xHis標(biāo)記)以及兩種Nb1結(jié)構(gòu)域的二價(jià)抗體(Nb1-35 GS-Nb1)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià),并用于分析幾種具有不同電荷和糖基化差異的單抗藥物。

Camperi等[138]對(duì)人絨毛膜促性腺激素(hCG)進(jìn)行了完整水平的CE表征,CE分離兩種hCG生物類(lèi)似藥物:Ovitrelle(重組r-hCG)和Pregnyl(分離自孕婦尿液),結(jié)果兩者峰數(shù)、遷移時(shí)間和峰強(qiáng)度均不相同,說(shuō)明不同來(lái)源的hCG藥物中含有不同性質(zhì)和比例的亞型。經(jīng)cIEF分析,兩者pI范圍分別為3.4～4.7和4.5～5.2。他們進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出CZE方法，可以區(qū)分對(duì)應(yīng)不同的hCG亞型的至少6個(gè)峰,建立了可用于hCG各種異構(gòu)體指紋識(shí)別的CZE-MS聯(lián)用分析方法。

4.3 全柱成像毛細(xì)管等電聚焦法

icIEF在檢測(cè)多肽與蛋白質(zhì)藥物的等電點(diǎn)以及電荷異質(zhì)性方面有明顯優(yōu)勢(shì),應(yīng)用較多。Goyon等[139]用icIEF測(cè)定了23個(gè)美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)和歐洲藥物管理局(EMA)批準(zhǔn)的pI范圍從6.1到9.4的單克隆抗體治療藥物,并建議icIEF可以作為此類(lèi)測(cè)定的參考技術(shù)。Demirdirek等[140]報(bào)道了監(jiān)測(cè)靜脈輸液中葡萄糖參與的蛋白糖化產(chǎn)物的icIEF方法,顯示其能夠檢測(cè)不穩(wěn)定的席夫堿糖基加合物。

武剛等[141]考察了icIEF測(cè)定單抗等電點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)條件(包括添加尿素、聚焦時(shí)間、pI標(biāo)記物)對(duì)icIEF測(cè)定抗HER2單抗、抗VEGF單抗的主峰等電點(diǎn)測(cè)定的影響,認(rèn)為pI標(biāo)記物的選擇對(duì)等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果影響較大,測(cè)得等電點(diǎn)受到pI標(biāo)記物標(biāo)注等電點(diǎn)準(zhǔn)確性的影響。他們[142]還在icIEF分析單抗電荷異質(zhì)性時(shí)組織國(guó)內(nèi)多家質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證,并制備出用于icIEF的系統(tǒng)適用性對(duì)照品。

李響等[143]用icIEF有效分離了IL-15融和蛋白的12個(gè)電荷異構(gòu)體,并證明唾液酸化程度差異是電荷異質(zhì)性產(chǎn)生的主要原因。他們[144]還比較了icIEF與CZE兩種分析重組人促紅素電荷異構(gòu)體含量的方法,認(rèn)為兩者均可滿足rhEPO電荷異構(gòu)體的質(zhì)控需求。孟曉光等[145]用icIEF檢測(cè)多肽與蛋白質(zhì)藥物的等電點(diǎn),人血紅蛋白的4種主要電荷異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)了基線分離,評(píng)價(jià)了進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)貝伐單抗一致性。周朝明等[146]用國(guó)產(chǎn)icIEF儀器測(cè)定了多肽KR-1、胰島素、融合蛋白疫苗重組人乳頭瘤病毒的等電點(diǎn)。

4.4 抗體藥物分析

Ladner等[147]將單抗的胰蛋白酶消化和電泳分離水解物在線自動(dòng)化聯(lián)用,用于3種單克隆抗體(曲妥珠單抗、英夫利昔單抗和托西珠單抗)的分析，結(jié)果與離線消化的譜圖相當(dāng),可用于單克隆抗體藥物的質(zhì)量控制。Said等[148]利用無(wú)鞘CE-MS/MS,從整體、middle-up和bottom-up不同的分析策略對(duì)抗體偶聯(lián)藥物本妥昔單抗(brentuximab vedotin)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。Hutanu等[149]使用鹽酸胍溶液沖洗以避免管壁蛋白質(zhì)的吸附,通過(guò)加入特異性配體,利用部分填充毛細(xì)管的親和CE法分離了兩種相似單克隆抗體的混合物。

王文波等[150]用CZE建立IgG2型單抗電荷異質(zhì)性分析方法時(shí),使用含有羥丙基甲基纖維素的6-氨基己酸-三乙基四胺緩沖液作為分離緩沖液,改善了樣品的分離。黃碧君等[151]用CE測(cè)定重組人源化IgG2抗體的純度,使用的是商品化的SDS-MW Analysis Kit分離緩沖液。

4.5 N-寡糖分析

CE已經(jīng)具有分離相同單糖序列但位置不同的寡糖同分異構(gòu)體,并可區(qū)分單糖之間的α連接和β連接。Lu等[152]詳細(xì)綜述了2014～2018年初CE分離N-寡糖的進(jìn)展和主要應(yīng)用。Szigeti等[153]提出用溫度梯度技術(shù)改進(jìn)熒光標(biāo)記N-寡糖CE分離的選擇性。在15～45 ℃的溫度區(qū)間內(nèi)以5 ℃為間隔梯度升溫,分離了3種寡糖的混合物，顯示溫度是CE寡糖分離的重要實(shí)驗(yàn)參數(shù)。李鳳等[154]以8-氨基芘-1,3,6-三磺酸鈉(APTS)為熒光衍生試劑,分別建立中藥多糖中單糖組成的CE分析方法，以及人血清中糖蛋白N-寡糖的CE指紋譜分析方法。Savicheva等[155]還通過(guò)對(duì)APTS的結(jié)構(gòu)改造,得到用于還原糖分析、具有更高熒光強(qiáng)度和更多負(fù)電荷的CE激光誘導(dǎo)熒光衍生試劑。

4.6 二硫鍵分析

表征二硫鍵的連接位置仍然是分析肽/蛋白質(zhì)藥物的一個(gè)重要問(wèn)題。Delvaux等[156]結(jié)合CZE-MS、離子遷移譜-MS和理論計(jì)算,研究了具有兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵,但存在不同半胱氨酸連接方式的3種多肽的二硫鍵異構(gòu)體,在水相(CZE)和氣相(離子遷移譜)中的分離。

4.7 生物制品分析的其他方面

Liang等[157]提出一種用于改善CZE分離高濃度組分的擴(kuò)展速度間隙技術(shù)(stretching velocity gap, S-VGCE),其機(jī)理是高濃度的樣品成分先被拉伸成較寬的區(qū)帶,再通過(guò)電切換的切割效應(yīng)將樣品分成多個(gè)短區(qū)帶,然后將這些短區(qū)帶分離開(kāi)。Liang等[157]將該技術(shù)用于分離含有溶菌酶、牛血清白蛋白和核糖核酸酶組成的混合蛋白質(zhì)樣品。Maldaner等[158]以雷尼替丁為內(nèi)標(biāo),用CZE分析了重組人甲狀旁腺素(rhPTH 1-34),線性范圍為0.25～250 μg/mL。Kpaibe等[159]報(bào)道了蛇毒液指紋圖譜的CZE分析方法,使用改性涂層毛細(xì)管以避免蛇毒中大量蛋白質(zhì)和肽的吸附,可用于不同批次蛇毒液的質(zhì)量控制。Yao等[160]建立了CZE分離測(cè)定門(mén)冬酰胺酶(埃希)及其酸性變體的方法,定量限為1.9%。

van Tricht等[161]用CE直接定量檢測(cè)上下游加工樣品中完整的腺病毒顆粒,用于開(kāi)發(fā)基于腺病毒疫苗期間的分析監(jiān)測(cè)。使用由125 mmol/L Tris、338 mmol/L三甲基甘氨酸和0.2%(v/v)聚山梨酯-20組成的緩沖液(pH 7.7),將腺病毒顆粒從復(fù)雜的混合物中分離出來(lái)。生產(chǎn)過(guò)程中5個(gè)具有代表性的樣品中腺病毒的定量測(cè)定結(jié)果為0.5×1011～1.5×1011腺病毒顆粒/mL (約80～250 pmol/L)。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是常用于單抗生產(chǎn)的蛋白表達(dá)系統(tǒng),Wang等[162]建立了同時(shí)檢測(cè)CHO細(xì)胞中7種氧化還原和能量相關(guān)代謝物的毛細(xì)管電泳方法。采用在線聚焦技術(shù),7種代謝物的檢出限為0.050～0.688 mg/L,并用于兩種不同培養(yǎng)條件下CHO細(xì)胞提取物的分析。

Hu等[163]報(bào)道了一種利用毛細(xì)管電泳一體化固定化酶反應(yīng)器在線檢測(cè)青霉素酶活性和抑制作用的方法,可用于細(xì)菌耐藥性的治療和診斷。Chen等[164]以青霉素G為底物,建立了CE分析絲氨酸-β-內(nèi)酰胺酶和金屬-β-內(nèi)酰胺酶的方法,并對(duì)在線和離線兩種方法都做了方法認(rèn)證。

吳克等[165]用CE紫外間接檢測(cè)法測(cè)定了四價(jià)輪狀病毒疫苗原液中蔗糖的含量,分離緩沖液為含CTAB的2,6-吡啶二羧酸-NaOH溶液(pH 12.6)。李響等[166]用CZE測(cè)定了重組人干擾素α-1b滴眼液中間甲酚的含量。

在生物制品分析方面,CE-SDS、icIEF已經(jīng)形成了方法優(yōu)勢(shì)并成為蛋白類(lèi)藥物法定分析方法難以替代的一部分,CE-MS也具備了在生物制品分析中解決實(shí)際問(wèn)題的能力。生物制品在新藥研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中提出了很多需要解決的分析問(wèn)題,未來(lái)在這方面CE將會(huì)得到越來(lái)越多的應(yīng)用。

5 結(jié)論

CE在藥物分析方面仍然具有特色和優(yōu)勢(shì),并顯示出較大的發(fā)展空間。CE-MS在不斷改進(jìn)接口技術(shù)的同時(shí),在藥物分析各方面都得到廣泛應(yīng)用,MS和MS/MS強(qiáng)大的定性能力與優(yōu)越的檢測(cè)靈敏度彌補(bǔ)了CE的短板,而CE對(duì)包括生物大分子在內(nèi)的強(qiáng)極性生物活性成分的分離能力也使CE-MS顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。用于蛋白類(lèi)藥物分析的icIEF和CE-SDS在應(yīng)用中逐漸走向成熟,成為生物制品分析的有力工具,在作為國(guó)內(nèi)外研發(fā)熱點(diǎn)的抗體藥物研究方面更具優(yōu)勢(shì),兩者均已經(jīng)實(shí)現(xiàn)與MS聯(lián)用,并會(huì)顯示出更多應(yīng)用潛力。廣泛應(yīng)用的在線樣品濃縮技術(shù)使檢測(cè)靈敏度不再成為CE分析的難題。對(duì)分析重復(fù)性的改進(jìn)以及便攜式儀器的出現(xiàn)可能使國(guó)內(nèi)CE儀器擁有走向世界的技術(shù)特色,也為CE更多進(jìn)入日常藥品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室以及快檢現(xiàn)場(chǎng)提供了想象空間。

這些研究成果顯示,CE分析的多個(gè)重要瓶頸問(wèn)題(例如靈敏度、重復(fù)性、定性能力等)已經(jīng)出現(xiàn)突破的跡象,令人期待。相對(duì)于其他色譜分析方法,CE技術(shù)的掌握還普遍存在一定難度,將這些成果和方法用于解決藥物分析中存在的很多具體問(wèn)題還需要各方面的耐心和投入。在應(yīng)用研究過(guò)程中不斷產(chǎn)生的新問(wèn)題和新思路,以及CE在方法學(xué)和其他領(lǐng)域研究成果的應(yīng)用,推進(jìn)著CE藥物分析的不斷發(fā)展。

致謝 感謝上海市食品藥品檢驗(yàn)所季申教授在中藥分析方面的討論。