親和毛細(xì)管電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究中的應(yīng)用

余方志, 章大鵬, 袁 征, 趙 強(qiáng), 汪海林*

(1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100085; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

DNA是生物遺傳信息的載體,蛋白質(zhì)是相關(guān)生物功能的執(zhí)行者,蛋白質(zhì)-DNA的相互作用在許多生命過程中至關(guān)重要。例如,DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及損傷修復(fù)等基本生命過程都需要一系列蛋白質(zhì)的共同參與;DNA甲基化狀態(tài)改變及生物學(xué)意義也需要通過相關(guān)的功能蛋白實(shí)現(xiàn)。另一方面,利用已經(jīng)鑒定出與DNA作用的功能蛋白質(zhì)分子,可以開發(fā)出許多先進(jìn)的技術(shù)用于生物工程和生命分析等領(lǐng)域。比如,Cas9蛋白已經(jīng)不僅是一種實(shí)驗(yàn)室常用的基因編輯工具,還有望成為臨床上進(jìn)行基因治療的一種手段[1,2];基于甲基化識別蛋白/抗體相互作用的免疫沉淀技術(shù)為更深層次的DNA甲基化測序分析奠定了基礎(chǔ)[3]。因此,對蛋白質(zhì)-DNA的相互作用研究不僅有利于更好地認(rèn)識基本的生命過程,而且可以幫助開發(fā)、改進(jìn)許多重要的生物工程和生命分析技術(shù)。

建立和發(fā)展靈敏、快速、多樣化的分析技術(shù)是進(jìn)行蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究的首要問題。目前,常用的蛋白質(zhì)-DNA相互作用分析方法有凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)、染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)、表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)、等溫量熱滴定(isothermal titration calorimetry, ITC)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)、冷凍電鏡(cryo-electron microscopy, cryo-EM)以及親和毛細(xì)管電泳(affinity capillary electrophoresis, ACE)等技術(shù)。每種技術(shù)都有其獨(dú)特的優(yōu)勢和局限,研究者需要根據(jù)研究對象和研究目的進(jìn)行靈活選擇。毛細(xì)管電泳(CE)技術(shù)因其超高的分離效率、極低的樣品消耗與較短的分析時間等優(yōu)勢已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于分離分析,在食品安全、藥物篩選、環(huán)境監(jiān)測、生命分析等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。根據(jù)不同的分離原理,毛細(xì)管電泳技術(shù)具有多種分離模式。其中,親和毛細(xì)管電泳技術(shù)利用遷移速率的變化可以對分子間的相互作用進(jìn)行多參數(shù)表征,包括結(jié)合常數(shù),解離速率常數(shù),結(jié)合計量比等。另外,由于毛細(xì)管電泳技術(shù)操作簡單,可以在生理相關(guān)的條件下進(jìn)行,使其非常適合用于研究生物大分子間的相互作用。另一方面,毛細(xì)管電泳技術(shù)又可以反過來利用一些已知的相互作用發(fā)展新的分析方法用于相關(guān)目標(biāo)分子及目標(biāo)反應(yīng)的分析檢測[4]。本文對親和毛細(xì)管電泳技術(shù)的研究進(jìn)展做了簡要介紹,對其在蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié),并對該領(lǐng)域的未來發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望與探討。

1 親和毛細(xì)管電泳簡介

高效毛細(xì)管電泳技術(shù)主要利用不同荷質(zhì)比的物質(zhì)在強(qiáng)電場中的遷移速度差異從而將其在毛細(xì)管中進(jìn)行高效的分離分析。得益于微米級別毛細(xì)管(內(nèi)徑約20～100 μm)的使用,帶電粒子在電場中運(yùn)動所產(chǎn)生的焦耳熱可及時散發(fā),因此可使用高電壓(高場強(qiáng))。同時,由于高場強(qiáng)的施加,帶電粒子的擴(kuò)散時間縮短,且擴(kuò)散有可能受到強(qiáng)電場的“籠子效應(yīng)”限制,帶電粒子的峰展寬極小,分離效率顯著提高。親和毛細(xì)管電泳廣義涉及各種復(fù)合物在毛細(xì)管電泳中的分離與分析。由于不同分子通過親和相互作用形成的復(fù)合物通常具有與原來分子不同的荷質(zhì)比,其電泳遷移速度會發(fā)生改變,所以理論上利用毛細(xì)管電泳技術(shù)可以對這種親和相互作用進(jìn)行分析檢測。親和毛細(xì)管電泳的概念由哈佛大學(xué)Whitesides教授研究團(tuán)隊于1992年提出[5],他們將不同濃度的帶電配體加入電泳緩沖液中,通過檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的遷移時間變化,從而計算出蛋白質(zhì)-配體相互作用的結(jié)合常數(shù)。此后,親和毛細(xì)管電泳技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸、蛋白質(zhì)-藥物分子、抗原-抗體、受體-配體等之間的相互作用研究。親和毛細(xì)管電泳技術(shù)可測得的親和力范圍非常廣泛,相互作用體系的平衡解離常數(shù)(Kd)可以從mmol/L級到nmol/L級變化[4]。

親和作用機(jī)制可以被引入各種類型的毛細(xì)管電泳分離模式,包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管電色譜等。而根據(jù)進(jìn)樣方式或互作分子空間分布的不同,可以將親和毛細(xì)管電泳技術(shù)總結(jié)為3種主要模式:(1)狹義的親和毛細(xì)管電泳,其將互作分子之一作為添加劑添加至電泳緩沖液中,通過檢測另一分子的遷移時間變化從而計算出相互作用的結(jié)合常數(shù);(2)動力學(xué)親和毛細(xì)管電泳,也稱為預(yù)平衡毛細(xì)管區(qū)帶電泳或親和探針毛細(xì)管電泳,其將互作的分子提前孵育至反應(yīng)平衡,再將樣品進(jìn)樣至毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離分析,通過檢測游離探針、穩(wěn)定復(fù)合物及電泳過程中解離的復(fù)合物的峰面積與遷移時間可以計算出相互作用的結(jié)合常數(shù)及互作后形成復(fù)合物的解離速度常數(shù)[6,7]; (3)配體固定化的親和毛細(xì)管電泳,其將親和配體固定在毛細(xì)管中,受體分子在進(jìn)樣至毛細(xì)管后經(jīng)過親和捕獲-洗脫過程以實(shí)現(xiàn)分離分析。前兩類為均相作用體系,第三類為非均相作用體系。動力學(xué)親和毛細(xì)管電泳本身還包括許多不同的分析方法,如空峰法、前沿分析、部分填充親和毛細(xì)管電泳等,由于篇幅所限,本文在此不再一一介紹,感興趣的讀者可以參考綜述文獻(xiàn)[8,9]以了解詳細(xì)的分類標(biāo)準(zhǔn)、方法原理及適用范圍。

在實(shí)際的應(yīng)用過程中,研究者們還發(fā)展了多種策略以增強(qiáng)親和毛細(xì)管電泳技術(shù)的分析能力,包括競爭親和分析策略,優(yōu)化電泳緩沖液、分離電壓、分離時間,降低分離溫度,抑制毛細(xì)管壁的吸附效應(yīng)等[10,11]。Kennedy教授實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)考察了電泳緩沖液、分離電壓、分離時間、分離溫度等對親和作用分析的影響[12,13],他們認(rèn)為短的分離時間和低的分離溫度更有利于非共價復(fù)合物的檢測。他們還發(fā)展了蛋白質(zhì)交聯(lián)毛細(xì)管電泳技術(shù)(protein cross-linking capillary electrophoresis, PXCE),以更準(zhǔn)確地考察蛋白質(zhì)之間的相互作用[14]。PXCE技術(shù)不僅降低了親和毛細(xì)管電泳對分離條件的要求,還極大地縮短了單個樣品的分析時間,從而提高了實(shí)驗(yàn)通量[15]。作者實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在樣品中加入適量的甘油、蔗糖、聚乙醇等有機(jī)滲透劑(organic osmolyte)不僅可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)-DNA的結(jié)合親和力,還可以降低復(fù)合物的解離速率,增強(qiáng)復(fù)合物的穩(wěn)定性[16]。最近,EL-Hady等[17,18]將短鏈咪唑類離子液體形成的兩相體系引入親和毛細(xì)管電泳以保護(hù)作用蛋白的活性從而增強(qiáng)其與藥物分子的結(jié)合。

2 蛋白質(zhì)-DNA相互作用機(jī)制研究

蛋白質(zhì)-DNA的相互作用在基因選擇性表達(dá)、基因組復(fù)制及基因組穩(wěn)定性維持等重要的生命過程中起到不可或缺的作用。因此,對蛋白質(zhì)-DNA相互作用的基礎(chǔ)分子機(jī)制研究是親和毛細(xì)管電泳的重要應(yīng)用領(lǐng)域。Heegaard等[19]在1993年就利用親和毛細(xì)管電泳技術(shù)對人血清淀粉樣蛋白(SAP)中的肽段與DNA的相互作用進(jìn)行了定性和定量分析。通過分別改變DNA探針的長度,肽段的長度及序列,他們確定了SAP蛋白與DNA相互作用的最小長度要求及序列特異性;通過改變DNA探針濃度建立結(jié)合曲線,他們估算了肽段與DNA的結(jié)合常數(shù)。但是目標(biāo)肽段呈堿性(pI=8.55),在近中性的電泳緩沖液(pH=7.3)中極易被帶負(fù)電的毛細(xì)管內(nèi)壁吸附,他們因此選用DNA作為分析物質(zhì),并將其在上樣前與目標(biāo)肽段孵育。需要注意的是,由于毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附作用,作者并未檢測到復(fù)合物的峰,只能通過未結(jié)合的游離DNA探針峰進(jìn)行定性和定量分析。

Stebbins等[20]發(fā)展了毛細(xì)管電泳遷移實(shí)驗(yàn)(capillary electrophoresis mobility shift assay, CEMSA)用于蛋白質(zhì)-DNA的相互作用研究。作者通過考察經(jīng)典的阻遏蛋白與大腸桿菌色氨酸操縱子的結(jié)合證實(shí)了該方法的可靠性與優(yōu)勢。加州理工學(xué)院的發(fā)育生物學(xué)家Davidson教授研究組利用CEMSA技術(shù)考察了海膽胚胎轉(zhuǎn)錄因子SpP3A2蛋白與靶標(biāo)DNA位點(diǎn)的相互作用[21]。為了抑制毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附作用,作者選用中性涂層修飾的毛細(xì)管用于CEMSA實(shí)驗(yàn),可以在20 min內(nèi)檢測到SpP3A2-DNA復(fù)合物。另外,結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光(laser-induced fluorescence, LIF)技術(shù),該方法具有超高的檢測靈敏度,可以檢測到低至數(shù)百萬個熒光標(biāo)記的DNA分子,這比常規(guī)EMSA技術(shù)的靈敏度提高了至少100倍。超高的檢測靈敏度使得該方法不僅可以用于DNA與高純度重組蛋白的相互作用,還可以直接考察DNA探針與細(xì)胞核提取物、卵細(xì)胞裂解液、甚至單個海膽卵細(xì)胞裂解液的相互作用。

類似地,Foulds等[22]利用CEMSA-LIF技術(shù)在自由水溶液中測定了酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4蛋白的GCNK58結(jié)構(gòu)域與靶標(biāo)DNA位點(diǎn)結(jié)合的解離常數(shù);Fraga等[23]采用CEMSA-LIF技術(shù)系統(tǒng)考察了甲基化胞嘧啶(5mC)結(jié)合蛋白(MBD家族)與甲基化DNA的結(jié)合親和力,并據(jù)此推測了不同結(jié)合蛋白被招募至特定啟動子區(qū)域的內(nèi)在驅(qū)動力。作者團(tuán)隊也利用實(shí)驗(yàn)室自制的CE-LIF裝置對5mC結(jié)合蛋白MBD2b與DNA的結(jié)合計量學(xué)及識別特異性進(jìn)行了系統(tǒng)研究,首次從結(jié)合計量學(xué)的角度闡述了分子間相互作用特異性的內(nèi)在分子機(jī)制[24,25]。

值得注意的是,自Dovichi教授將激光誘導(dǎo)熒光應(yīng)用于毛細(xì)管電泳技術(shù)[26], LIF檢測器因其超高的靈敏度與很好的兼容性已成為毛細(xì)管電泳技術(shù)最重要的檢測手段之一。尤其是在蛋白質(zhì)-DNA相互作用機(jī)制的研究中對檢測方法的廣泛性要求不高,通常都是對DNA或蛋白質(zhì)分子進(jìn)行熒光標(biāo)記,利用LIF檢測技術(shù)測定相關(guān)參數(shù)。除了熒光強(qiáng)度,熒光偏振(fluorescence polarization, FP)是熒光的另一個重要性質(zhì)。熒光偏振響應(yīng)由熒光分子的旋轉(zhuǎn)速度決定,與分子的大小及局部環(huán)境密切相關(guān)。如果熒光分子在溶液中快速轉(zhuǎn)動,其被一束偏振光激發(fā)后發(fā)射的熒光在很大程度上會發(fā)生去偏振現(xiàn)象,熒光偏振響應(yīng)較低;相反,當(dāng)熒光分子受到外界的限制轉(zhuǎn)動速度降低時,其發(fā)射的熒光具有與激發(fā)的偏振光相似的偏振特性,熒光偏振響應(yīng)較高。根據(jù)這一原理,熒光偏振響應(yīng)常被用于分析分子間的相互作用及生物大分子的結(jié)構(gòu)變化。阿爾伯塔大學(xué)X. Chris Le教授研究組在LIF檢測的基礎(chǔ)上將熒光偏振檢測技術(shù)引入毛細(xì)管電泳發(fā)展了高靈敏的毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光偏振(CE-LIFP)裝置[27-29]。由于可以同時通過電泳遷移時間變化和熒光偏振響應(yīng)表征分子間的結(jié)合與解離狀態(tài)及可能的構(gòu)象變化,CE-LIFP技術(shù)已經(jīng)成為親和作用分析與生物物理結(jié)構(gòu)分析的重要工具[30-34]。

圖 1 近距離作用引起的熒光偏振增強(qiáng)效應(yīng)示意圖Fig. 1 Schematic illustration of close contact-enhanced fluorescence polarization (FP)

作者實(shí)驗(yàn)室利用CE-LIFP技術(shù)對多種蛋白質(zhì)-DNA相互作用體系的分子機(jī)制及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)進(jìn)行了系統(tǒng)研究,包括DNA損傷位點(diǎn)與修復(fù)蛋白[32],核酸適配體與靶蛋白[33], DNA底物與同源重組酶等[34]。核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair, NER)是一種能夠識別廣譜DNA損傷的修復(fù)系統(tǒng),可以修復(fù)DNA交聯(lián)、DNA加合物等多種損傷形式,在降低基因突變概率、防止細(xì)胞癌變等方面具有重要意義。Wang等[32]在利用修復(fù)酶檢測DNA損傷時意外發(fā)現(xiàn)一種非相對分子質(zhì)量依賴的熒光偏振響應(yīng)增強(qiáng)現(xiàn)象,通過設(shè)計多種DNA熒光探針證明這一熒光偏振增強(qiáng)效應(yīng)與DNA纏繞有關(guān)。由于DNA纏繞于大腸桿菌修復(fù)酶UvrB蛋白會造成多位點(diǎn)的密切接觸,使得標(biāo)記在DNA上的熒光基團(tuán)轉(zhuǎn)動受到束縛,故而顯著增強(qiáng)了其熒光偏振響應(yīng)。我們進(jìn)一步利用這種近距離作用引起的熒光偏振增強(qiáng)效應(yīng)(見圖1)對DNA纏繞在NER機(jī)制中的作用進(jìn)行了研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UvrA蛋白介導(dǎo)的DNA-UvrB纏繞作用是NER通路中的一個早期事件,可能會誘導(dǎo)DNA損傷位點(diǎn)的局部解旋以便UvrB蛋白的插入,形成穩(wěn)定的損傷修復(fù)前復(fù)合體。在此基礎(chǔ)上,我們提出了大腸桿菌NER機(jī)制的DNA纏繞-解鏈模型,為認(rèn)識NER的廣譜DNA損傷識別能力提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Zhang等[33]隨后利用這種近距離作用引起的熒光偏振增強(qiáng)效應(yīng)考察了核酸適配體TA29與靶標(biāo)蛋白凝血酶的相互作用情況。通過對TA29的單個核苷酸進(jìn)行選擇性標(biāo)記并檢測其與凝血酶結(jié)合前后的熒光偏振響應(yīng)差異,即可鑒定出TA29適配體結(jié)合靶標(biāo)分子的關(guān)鍵位點(diǎn)。相比于經(jīng)典的結(jié)構(gòu)解析技術(shù)(如X射線衍射、NMR等), CE-LIFP技術(shù)十分方便,不依賴昂貴儀器,且耗時非常短。這一方法不僅對理解核酸適配體與靶分子作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)具有重要意義,還可以快速評價并指導(dǎo)人工進(jìn)化核酸適配體,從而提高其親和力與特異性,以更好地服務(wù)于生物分析及靶標(biāo)分子檢測。

圖 2 CE-LIFP鑒定3種RecA核蛋白纖維復(fù)合物的形成[34]Fig. 2 Capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence polarization (CE-LIFP) identification of the formation of three types of RecA nucleofilaments[34]

同源重組通路不僅可以通過修復(fù)DNA雙鏈斷裂維持基因組的穩(wěn)定性,還可以導(dǎo)致等位基因交換促進(jìn)生物遺傳多樣性。RecA/Rad51家族蛋白是同源重組過程的核心功能分子,其在介導(dǎo)同源重組時首先需要在單鏈DNA上組裝形成核蛋白纖維復(fù)合物,然后以此尋找同源的雙鏈DNA并與之發(fā)生鏈交換以啟動DNA合成實(shí)現(xiàn)雙鏈斷裂的精準(zhǔn)修復(fù)。Zhao等[34]利用CE-LIFP技術(shù)對大腸桿菌同源重組酶RecA蛋白在單鏈DNA上的組裝情況行了深入研究,發(fā)現(xiàn)其在生理條件下可以通過自身DNA依賴的ATP水解活性緊密調(diào)控組裝過程,形成不同結(jié)合計量比的高、中、低3種密度的核蛋白纖維復(fù)合物(見圖2)。ATP水解會促進(jìn)RecA在單鏈DNA上的解離,形成極低密度的不飽和RecA核蛋白纖維復(fù)合物。在這種不飽和的RecA核蛋白纖維復(fù)合物結(jié)構(gòu)中,單鏈DNA的絕大部分核苷未被RecA結(jié)合,電鏡成像及酶切保護(hù)等分析一致證明了這一結(jié)果。進(jìn)一步的體外鏈交換和體內(nèi)同源重組實(shí)驗(yàn)均表明這種低密度、不飽和的核蛋白纖維復(fù)合物是成功介導(dǎo)大腸桿菌同源重組的活性形式。這一發(fā)現(xiàn)改變了對傳統(tǒng)同源重組通路中關(guān)鍵核蛋白纖維復(fù)合物基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識,為深入理解同源重組修復(fù)機(jī)制提供了理論依據(jù)。

3 基于蛋白質(zhì)-DNA相互作用的應(yīng)用研究

親和毛細(xì)管電泳技術(shù)不僅可以探索未知相互作用的分子機(jī)制,還可以利用一些已知的特異性相互作用發(fā)展新的分析方法用于相關(guān)目標(biāo)分子及目標(biāo)反應(yīng)的檢測。目前,在親和毛細(xì)管電泳中用到的蛋白質(zhì)-DNA相互作用主要包括3類:抗原-抗體,DNA結(jié)合蛋白與底物,核酸適配體與靶蛋白。

3.1 基于抗體的毛細(xì)管電泳分析

基于抗原-抗體特異性相互作用的免疫分析是生化實(shí)驗(yàn)室最為常見的定性定量及可視化分析手段。Heegaard[35]利用毛細(xì)管電泳技術(shù)考察了磷酸化酪氨酸與不同抗體的結(jié)合親和力,并據(jù)此證明了免疫親和毛細(xì)管電泳技術(shù)的可行性。Le等[36]結(jié)合免疫親和毛細(xì)管電泳與LIF檢測技術(shù)發(fā)展了一種快速超靈敏的DNA胸腺嘧啶二醇分析方法,檢出限低至3×10-21mol,比原來的檢測靈敏度提高了4～5個數(shù)量級。他們還利用此方法研究了A549細(xì)胞經(jīng)輻射誘導(dǎo)后胸腺嘧啶二醇的修復(fù)過程,并提出了一種誘導(dǎo)修復(fù)機(jī)制。Carnelley等[37]制備了一種90個堿基長度的含有一個鄰二醇環(huán)氧苯并[a]芘(BPDE)加合物的DNA探針(BPDE-90 mer),并利用CE-LIF技術(shù)考察了3種單克隆抗體與該探針的結(jié)合親和力。Tan等[38]利用該探針發(fā)展了一種競爭性免疫親和毛細(xì)管電泳方法用于檢測A549細(xì)胞基因組中BPDE加合物水平。Wang等[39]利用這種競爭性免疫親和毛細(xì)管電泳方法對BPDE加合物探針與其抗體結(jié)合的化學(xué)計量學(xué)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明抗BPDE-dG的IgG型抗體的兩個半抗原結(jié)合位點(diǎn)可以分別與兩個探針分子結(jié)合,形成1∶2(抗體∶BPDE加合物)的三元復(fù)合物,但形成三元復(fù)合物的比例與DNA探針的長度及加合物與抗體的相對濃度有關(guān)。作者實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上制備了4種不同的立體異構(gòu)BPDE-DNA加合物熒光探針,并利用特異性抗體和免疫親和毛細(xì)管電泳技術(shù)對它們進(jìn)行了系統(tǒng)表征,證明了每個探針分子上都只有單個BPDE加合物[40-43]。

圖 3 (a)競爭性免疫實(shí)驗(yàn)與(b)非競爭性免疫實(shí)驗(yàn)檢測BPDE-DNA加合物Fig. 3 (a) Competitive and (b) non-competitiveimmuno-assay to detect BPDE-DNA adducts

Wang等[44]進(jìn)一步發(fā)展了更加靈敏的非競爭性免疫親和毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測基因組的BPDE加合物水平。與競爭性免疫分析(見圖3a)不同,在非競爭性免疫分析(見圖3b)中,除了需要加入能特異性識別DNA加合物的一級抗體(一抗)外,還需要加入熒光標(biāo)記的二級抗體(二抗)。需要注意的是,在這一反應(yīng)體系中存在3種熒光標(biāo)記的物質(zhì):游離的二抗、二抗-一抗二元復(fù)合物、二抗-一抗-DNA加合物三元復(fù)合物。由于DNA的等電點(diǎn)更低,很容易通過高效毛細(xì)管電泳將含有DNA加合物的三元復(fù)合物從混合體系中分離出來從而實(shí)現(xiàn)定性定量分析。Shen等[45]利用這種非競爭性的免疫分析方法研究了砷和苯并[a]芘在細(xì)胞水平的相互作用,結(jié)果顯示三價無機(jī)砷可通過增強(qiáng)BPDE的細(xì)胞吸收促進(jìn)BPDE-DNA加合物的形成。為了增強(qiáng)免疫親和毛細(xì)管電泳技術(shù)的穩(wěn)定性,提高檢測靈敏度,作者團(tuán)隊在研究過程中還提出了許多策略,如在樣品中加入牛血清白蛋白(BSA)或免疫球蛋白(IgG)等非特異性蛋白可增強(qiáng)免疫復(fù)合物的形成,顯著提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性[46];利用DNA聚焦方法可將較低濃度的免疫復(fù)合物富集于一狹窄區(qū)帶,從而顯著提高分離效率和檢測靈敏度[47];利用量子點(diǎn)標(biāo)記的二抗可將BPDE-DNA加合物的檢測靈敏度提高至6.6×10-21mol,從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)痕量DNA加合物的定量分析[48]。

除了DNA加合物,免疫親和毛細(xì)管電泳技術(shù)還可用于DNA修飾的分析。Wang等[49]利用CE-LIFP技術(shù)發(fā)展了一種非競爭性的免疫親和毛細(xì)管電泳方法用于基因組DNA整體5mC水平的檢測。由于熒光偏振檢測可以反映相對分子質(zhì)量的大小,高靈敏的LIFP檢測可以在無需進(jìn)一步分離的情況下排除脫落的小分子熒光染料對待測免疫復(fù)合物熒光信號的干擾。與之前的膠束毛細(xì)管電泳方法相比[50-52],這種免疫親和毛細(xì)管電泳方法具有很多優(yōu)勢:(1)樣品前處理簡單,DNA樣品只需經(jīng)過簡單的變性處理,無需經(jīng)過耗時的酶解消化處理,更不需要經(jīng)過復(fù)雜的共價衍生化處理;(2)分析時間短,每針樣品的分離時間不到1.2 min; (3)檢測靈敏度更高,樣品消耗量更低,僅需消耗0.1 ng的基因組DNA。利用這種免疫親和毛細(xì)管電泳方法可以對環(huán)境污染物的表觀遺傳毒性進(jìn)行快速評價,Wang等[53]進(jìn)一步考察了4種醛類化合物和6種苯醌類化合物對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)活性的影響,結(jié)果顯示鹵代苯醌對DNMT酶活的抑制作用最強(qiáng)。

3.2 基于DNA結(jié)合蛋白的毛細(xì)管電泳分析

生命體系中存在一系列參與DNA代謝的蛋白質(zhì),具有不同的DNA結(jié)合能力,可以被用于發(fā)展多種生物工程或生命分析的工具。單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNA binding protein, SSB)就是這其中一類典型的蛋白質(zhì),其選擇性地與代謝過程中產(chǎn)生的單鏈DNA結(jié)合。Berezovski等[54]通過將SSB蛋白添加到電泳緩沖液中發(fā)展了一種SSB介導(dǎo)的親和毛細(xì)管電泳方法用于加速DNA或RNA的雜交檢測。在這一方法中,首先將高濃度熒光標(biāo)記的DNA雜交探針與待測DNA或RNA充分孵育形成雙鏈分子,然后進(jìn)樣至毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離分析,通過在電泳緩沖液中添加SSB蛋白與剩余的單鏈DNA探針結(jié)合從而改變其遷移速率。這種方法已經(jīng)被成功應(yīng)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)產(chǎn)物、胞內(nèi)信使RNA(message RNA, mRNA)、microRNA(miRNA)的快速定量分析[55-58]。Wegman等[58]利用這種技術(shù)發(fā)展了可以同時定量分析多種miRNA的方法(DQAMmiR)。為了實(shí)現(xiàn)多種miRNA的同時直接定量分析,除了在電泳緩沖液中添加SSB蛋白以外,還需要對不同序列的DNA探針修飾不同的標(biāo)簽(生物素、氨基酸等)以改變雜交后雙鏈分子的荷質(zhì)比從而實(shí)現(xiàn)分離分析。通過不斷優(yōu)化探針濃度、緩沖液組成、分離溫度等實(shí)驗(yàn)條件,DQAMmiR方法的檢出限已經(jīng)可以低至1 pmol/L,并且可以實(shí)現(xiàn)單核苷差異的miRNA檢測[59-63]。Hu等[64]利用此方法對細(xì)胞裂解原液的miRNA進(jìn)行了準(zhǔn)確的定量分析,并將其與實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)方法——定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)技術(shù)進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示DQAMmiR方法具有更好的測量準(zhǔn)確度與精度。Hu等[65]還在此基礎(chǔ)上利用中性的肽核酸(peptide nucleic acids)探針發(fā)展了不需要添加SSB的第二代DQAMmiR方法。

作者團(tuán)隊最近利用親和毛細(xì)管電泳技術(shù)考察了不同長度單鏈DNA與SSB蛋白的結(jié)合親和力及解離速率,發(fā)現(xiàn)當(dāng)單鏈DNA大于30個堿基長度時,其與SSB形成的復(fù)合物非常穩(wěn)定,在CE分離過程中幾乎不會解離(koff< 0.004/s)[66]。我們進(jìn)一步利用這種超穩(wěn)定的相互作用發(fā)展了一種高親和力且不解離的ACE分析方法并將其成功應(yīng)用于DNA分子雜交及鏈交換反應(yīng)的快速高靈敏檢測。如圖4所示,只需將SSB蛋白加入反應(yīng)完成后的樣品中,待孵育達(dá)到平衡后,即可利用CE-LIF對樣品進(jìn)行快速分離分析。與傳統(tǒng)的凝膠電泳技術(shù)相比,這種高親和力且不解離的ACE分析方法在分析時間和樣品消耗等方面顯示出巨大的優(yōu)勢。另外,結(jié)合在線LIF檢測技術(shù),該方法具超高的靈敏度,可以檢測到50 pmol/L的單鏈DNA介導(dǎo)的鏈交換反應(yīng)。

圖 4 超穩(wěn)定SSB蛋白介導(dǎo)的毛細(xì)管電泳快速分析DNA鏈交換反應(yīng)[66]Fig. 4 Undissociated SSB binding-mediated capillary electrophoresis for rapid analysis of DNA strand exchange reactions[66] a. schematic illustration of the DNA strand exchange reaction (left panel) and the selective binding of SSB for the subsequent CE-LIF analysis (right panel); b. representative electropherograms obtained from the CE-LIF analysis of RecA-catalysed DNA strand exchange reactions; c. bar plot of the detected strand exchange efficiency.

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是基因組DNA中廣泛存在的由單個核苷酸突變引起的一種DNA序列多態(tài)性,與許多遺傳疾病的發(fā)生有關(guān)。SNP的分析檢測在機(jī)理研究、臨床診斷及藥物開發(fā)等方面具有重要意義。Drabovich等[67]利用DNA堿基錯配修復(fù)通路中MutS蛋白與單堿基錯配位點(diǎn)的特異性結(jié)合能力發(fā)展了一種親和毛細(xì)管電泳方法用于對目的片段特定位點(diǎn)的SNP進(jìn)行快速檢測。該方法首先需要將目的片段與熒光標(biāo)記的雙鏈DNA探針混合,通過變性再復(fù)性等操作獲得含有堿基錯配的雙鏈DNA。由于MutS蛋白與不同類型單堿基錯配的結(jié)合親和力差異,該方法只需通過雙鏈DNA片段的電泳遷移時間而不需要通過DNA測序技術(shù)即可識別目的位點(diǎn)的堿基類型。

3.3 基于核酸適配體的毛細(xì)管電泳分析

核酸適配體是一類對靶標(biāo)分子可特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA寡核苷酸序列,通常由15到80個核苷酸組成。作為一種新型的生物識別分子,核酸適配體具有廉價易得、穩(wěn)定性好、易改造修飾等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)被廣泛用于發(fā)展各類生物傳感器及分析方法,包括親和毛細(xì)管電泳技術(shù)[68-85]。German等[67]將熒光標(biāo)記的核酸適配體作為親和探針引入毛細(xì)管電泳實(shí)現(xiàn)了對靶蛋白IgE的分離分析。該方法的線性范圍達(dá)5個數(shù)量級,最低檢出限低至46 pmol/L,并且特異性非常好,不受IgG蛋白的干擾,可以用于血清樣品的直接檢測。他們進(jìn)一步利用凝血酶的檢測實(shí)驗(yàn)證明了核酸適配體作為親和探針的可靠性。X. Chris Le教授研究組[69]利用熒光標(biāo)記的核酸適配體RT26作為親和探針結(jié)合CE-LIF技術(shù)發(fā)展了一種特異性檢測人免疫缺陷病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(human immunodeficiency virus-reverse transcriptase, HIV-RT)的方法,該方法可以實(shí)現(xiàn)未結(jié)合自由探針與結(jié)合復(fù)合物的基線分離。他們在此基礎(chǔ)上結(jié)合PCR技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展了一種超靈敏的檢測痕量蛋白質(zhì)的方法[72]。該方法首先通過高效毛細(xì)管電泳將靶蛋白-核酸適配體復(fù)合物從自由探針中分離并收集,然后將收集到的組分作為模板加入PCR體系,通過檢測PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物即可實(shí)現(xiàn)對靶蛋白的痕量分析。由于PCR的信號放大作用,該方法的檢出限低至180個分子,為蛋白組學(xué)研究及臨床診斷提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。此外,該課題組還發(fā)展了一種可調(diào)適配體毛細(xì)管電泳方法用于多種蛋白質(zhì)的同時檢測[76,78]。雖然改變DNA的長度并不會改變其自身的荷質(zhì)比,但可以改變核酸適配體-靶蛋白復(fù)合物的荷質(zhì)比。因此,可以通過調(diào)節(jié)各個核酸適配體的長度改變其與靶蛋白結(jié)合后復(fù)合物的電泳遷移速率,實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的分離檢測。Lin等[81]利用這種可調(diào)適配體毛細(xì)管電泳方法結(jié)合微流控芯片技術(shù)同時對3種蛋白質(zhì)進(jìn)行了快速定量分析。Zhu等[85]將特異性的核酸適配體引入通用的微芯片毛細(xì)管電泳(microchip capillary electrophoresis, MCE)裝置發(fā)展了一種快速檢測細(xì)胞色素C的方法,可以在135 s內(nèi)對低至0.4 nmol/L的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行定量分析。Zhao[86]利用MCE裝置結(jié)合核酸適配體觸發(fā)的熒光信號放大技術(shù)可以檢測出人血清中低豐度的癌胚抗原。

核酸適配體與靶蛋白的結(jié)合親和力直接影響親和毛細(xì)管電泳方法的分離效率、檢測靈敏度及特異性,因此提高核酸適配體的親和力對于分析方法的發(fā)展十分重要。值得注意的是,已經(jīng)發(fā)展了多種基于CE的核酸適配體篩選方法并得到了廣泛應(yīng)用[87-101]。傳統(tǒng)的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技術(shù)需要將靶標(biāo)分子固定在固相基質(zhì)(如磁珠等)表面,通過固液分離將具有靶標(biāo)結(jié)合能力的核酸適配體從核酸文庫中篩選出來?；诠滔嗷|(zhì)的SELEX技術(shù)很容易引起核酸文庫的非特異性吸附,降低篩選效率;另外,靶標(biāo)分子的固定化也可能帶來空間位阻效應(yīng),不利于適配體與靶標(biāo)的結(jié)合。而基于CE的SELEX技術(shù)能避免上述問題,提高篩選效率。Zhu等[102]發(fā)展了基于在線反應(yīng)的一步CE法用于快速篩選靶標(biāo)蛋白的核酸適配體,該方法通過控制分離電壓實(shí)現(xiàn)了核酸適配體與靶標(biāo)蛋白的在線反應(yīng)及反應(yīng)后生成復(fù)合物的分離鑒定。Li等[103]將磁珠篩選技術(shù)與CE篩選技術(shù)相結(jié)合,充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢,通過多輪篩選獲得了高親和力和高選擇性的糖蛋白適配體。最近,Le等[104,105]發(fā)展了一種理想過濾毛細(xì)管電泳技術(shù)(ideal-filter capillary electrophoresis, IFCE)只需一步篩選即可獲得針對靶蛋白的高親和力核酸適配體。該方法通過調(diào)節(jié)電泳緩沖液的離子強(qiáng)度控制電滲流速度,使結(jié)合靶標(biāo)的核酸適配體與未結(jié)合靶標(biāo)的核酸適配體在毛細(xì)管中的遷移方向相反,從而極大地提高了篩選效率。另一方面,Bai等[106]通過CE-LIF技術(shù)發(fā)現(xiàn)在核酸適配體Apt15的3’末端增加18～25個重復(fù)T堿基可以將其結(jié)合凝血酶的親和力提高100倍以上,從而在電泳過程中檢測到穩(wěn)定的復(fù)合物峰。作者在此基礎(chǔ)上提出了一種多重協(xié)同作用增強(qiáng)核酸適配體親和力的策略,并將其成功應(yīng)用于IgE核酸適配體的親和力增強(qiáng)。

4 總結(jié)與展望

蛋白質(zhì)-DNA相互作用的分子機(jī)制研究不僅有利于我們更好地認(rèn)識基本的生命過程,還可以幫助開發(fā)新的分析檢測技術(shù)與方法。鑒于毛細(xì)管電泳技術(shù)分離效率高、分析時間短、樣品消耗少、操作簡便等諸多優(yōu)勢,其已在蛋白質(zhì)-DNA的相互作用研究中發(fā)揮了重要作用。由于DNA的熒光標(biāo)記相對簡單,高靈敏的LIF檢測器是蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究中最常用的檢測手段。CE-LIF(P)技術(shù)在成功應(yīng)用于核苷酸切除修復(fù)、同源重組修復(fù)等生命過程中蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究的同時,還發(fā)展了多種高靈敏分析方法用于痕量DNA加合物、堿基修飾、重要蛋白質(zhì)等生物標(biāo)志物的檢測。但是截至目前,毛細(xì)管電泳技術(shù)樣品消耗少和高通量的優(yōu)勢尚未在此領(lǐng)域的研究中得到充分發(fā)揮。在未來的研究中,可充分利用這兩點(diǎn)優(yōu)勢,分別發(fā)展用于少量珍貴生物樣品的高靈敏檢測方法和用于大量未知因素篩選評價的高通量分析方法。鑒于其在核酸適配體篩選方面的成功應(yīng)用,親和毛細(xì)管電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)作用位點(diǎn)的快速篩選方面應(yīng)該也大有可為。例如,結(jié)合測序技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)錄因子、甲基轉(zhuǎn)移酶等蛋白質(zhì)與基因組DNA的特異性結(jié)合位點(diǎn)。另外,還需注意結(jié)合先進(jìn)的質(zhì)譜技術(shù)或蛋白組學(xué)研究手段以鑒定可與DNA發(fā)生特異性相互作用的未知蛋白質(zhì)。

致謝 感謝汪海林教授課題組博士研究生劉艷同學(xué)在圖片繪制過程中提供的幫助。