毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

梁 玉, 張麗華, 張玉奎

(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室, 國家色譜研究分析中心, 遼寧 大連 116023)

毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)技術(shù)具有上樣體積小、分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)勢,目前已被廣泛用于分離分析研究領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)研究旨在“系統(tǒng)地分析生物體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用和動態(tài)變化”,在生物學(xué)、精準醫(yī)學(xué)研究等方面發(fā)揮著舉足輕重的作用[1,2]。目前其主要研究策略包括基于蛋白質(zhì)酶解肽段分離-質(zhì)譜鑒定的“自下而上(bottom-up)”技術(shù)[3-5]、基于整體蛋白質(zhì)分離-質(zhì)譜鑒定的“自上而下(top-down)”技術(shù)[6-8]和非變性質(zhì)譜(native-MS)技術(shù)[9,10]。然而,研究面臨的最大挑戰(zhàn)是生物樣品極其復(fù)雜,具有蛋白質(zhì)動態(tài)分布范圍寬、數(shù)目巨大、性質(zhì)差異顯著等特點[11,12],因此亟須發(fā)展更好的分離技術(shù)以與高分辨質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用[13]。隨著CE-MS技術(shù)的發(fā)展,其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注[14,15]。本文首先報道了CE-MS技術(shù)的研究進展,其中重點突出了實用性強并得到廣泛應(yīng)用的商品化接口,并概述了與質(zhì)譜聯(lián)用的CE分離模式;然后分別介紹了CE-MS技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)“bottom-up”分析、“top-down”分析以及native MS分析中的應(yīng)用,其中重點突出了與其他分離鑒定技術(shù)相比的優(yōu)勢;最后探討了CE-MS技術(shù)的應(yīng)用潛力。

1 毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究進展

1.1 接口

圖 1 基于電滲流控制鞘流液流速的低流速鞘流液CE-MS接口[24]Fig. 1 Electrokinetically pumped sheath-flow CE-MS interface[24]

毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用的關(guān)鍵部件是接口[16,17],其必須在保證電泳分離的同時實現(xiàn)電噴霧過程,主要包括鞘流液和無鞘流液兩種接口。鞘流液接口通過鞘流液施加噴霧電壓,操作簡單,實用性強;并且可以通過鞘流液改變電噴霧條件從而提高電泳緩沖液和質(zhì)譜的兼容性。但是鞘流液接口存在的最大問題是鞘流液稀釋樣品從而影響檢測靈敏度。Chen等[18]設(shè)計了連接分離毛細管、不銹鋼噴針和加壓鞘流液的接口,其中分離毛細管插入不銹鋼噴針內(nèi)部直至尖端,并分別在分離毛細管進樣端及不銹鋼噴針上施加分離電壓和噴霧電壓,而鞘流液儲液池和質(zhì)譜接地;鞘流液的流速由壓力控制。此接口不僅實現(xiàn)了電泳分離和電噴霧過程,而且可以將鞘流液流速降低至0.1 μL/min,從而減少樣品稀釋程度、提高檢測靈敏度,目前已被推廣應(yīng)用到肽段、蛋白質(zhì)、抗體等分離分析[19-21]。Dovichi等[22-24]研制了基于四通的鞘流液接口(見圖1a),分別連接了分離毛細管、石英電噴霧針、鞘流液、沖洗管路,其中分離毛細管延伸入石英電噴霧針的尖端附近,并分別在分離毛細管進樣端和鞘流液儲液池中施加電壓,而質(zhì)譜接地;鞘流液的低流速由電滲流控制,無需機械泵或者壓力控制。為了進一步解決鞘流液稀釋樣品導(dǎo)致靈敏度降低的問題,Dovichi等通過縮短分離毛細管末端與噴針的距離(見圖1b),研制了三代接口,連接Q-Exactive肽段檢測靈敏度可達zmol級[23],使用壽命可達3.5天,連續(xù)運行127次[24],目前已經(jīng)被美國CMP Scientific公司和深圳市永道致遠科學(xué)技術(shù)有限公司商品化(EMASS-Ⅱ),并得到廣泛應(yīng)用[25-29]。

圖 2 基于多孔層的無鞘流液CE-MS接口[32]Fig. 2 Sheathless porous-tip CE-MS interface[32]

無鞘流液接口避免了樣品稀釋從而提高了靈敏度,其面臨的主要挑戰(zhàn)是要維持CE穩(wěn)定流量,同時在CE分離和ESI噴霧之間生成穩(wěn)定的電接觸。目前文獻報道的電接觸方法主要基于導(dǎo)電鍍層[30,31]、多孔層[32-34]以及毛細管壁的細小裂縫[35,36]等,其中多孔電噴針的穩(wěn)定性和實用性相對較好。最有代表性的工作是,Moini等[32,33]采用氫氟酸刻蝕法將分離毛細管末端刻蝕成5～10 μm的多孔層,然后將多孔尖端穿過充滿溶液的金屬噴針,利用少量離子穿過多孔層從而產(chǎn)生穩(wěn)定的電接觸(見圖2)。此多孔電噴針制備簡單,重現(xiàn)性好,電噴霧穩(wěn)定。盡管這種接口存在多孔層可能發(fā)生堵塞影響使用壽命的問題,但是已被美國貝克曼公司商品化(CESI 8000),并應(yīng)用于肽段、蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)復(fù)合物的高靈敏度分析[37-41]。

Neusü?等[42]系統(tǒng)比較了多種接口的性能,結(jié)果表明低流速鞘流液接口和基于多孔電噴針的無鞘流液接口的靈敏度相當(dāng),都比傳統(tǒng)鞘流液接口靈敏度高,但低流速鞘流液接口的使用靈活性更好。隨著CE-MS接口的發(fā)展及商品化,CE-MS技術(shù)日趨成熟,給分離分析科學(xué)注入了新的生命力。

1.2 分離模式

在眾多的CE分離模式中,毛細管區(qū)帶電泳(CZE)與質(zhì)譜的聯(lián)用最為普遍,已被廣泛用于小分子、肽段、蛋白質(zhì)、核酸等樣品的分離分析[43-46]。其聯(lián)用接口既可以采取鞘流液接口也可以采取無鞘流液接口。為了提高與質(zhì)譜的兼容性,通常選用易揮發(fā)、對質(zhì)譜友好的緩沖液,比如甲酸、乙酸、醋酸銨等。目前研究者們主要通過發(fā)展進樣技術(shù)[47-49]、毛細管涂層技術(shù)[50-52]、在線富集技術(shù)[53,54]等方式提高CZE-MS的分離鑒定性能。近年來毛細管等電聚焦(CIEF)通過鞘流液接口與質(zhì)譜實現(xiàn)了在線聯(lián)用[20,27,28,55],并用于肽段、蛋白質(zhì)和抗體的高分辨分離分析。但是由于CIEF的緩沖液中添加的兩性電解質(zhì)抑制質(zhì)譜信號,并且操作復(fù)雜(包括進樣、聚焦、區(qū)帶遷移等步驟),因此應(yīng)用受到限制。毛細管電色譜(CEC)兼具分離選擇性好和分離效率高的優(yōu)點,其與質(zhì)譜的聯(lián)用被用于小分子的分離分析[56,57],而在肽段、蛋白質(zhì)鑒定方面的應(yīng)用少有報道。適合CEC高效分離且與質(zhì)譜兼容的分離柱有待進一步開發(fā)。

2 CE-MS技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1 在蛋白質(zhì)組“bottom-up”分析中的應(yīng)用

目前被廣泛采用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略主要是“bottom-up”策略[3],即先將蛋白質(zhì)樣品酶解成肽段,然后進行分離鑒定,最后通過鑒定到的肽段獲得蛋白質(zhì)信息。CE-MS在此領(lǐng)域中的優(yōu)勢是其分析速度快、靈敏度高。Dovichi等[23]采用自主研制的鞘流液接口及內(nèi)徑為10 μm的涂層毛細管構(gòu)建了CZE與Q Exactive MS聯(lián)用系統(tǒng),在10 min內(nèi)分析了16 pgE.coli酶解產(chǎn)物,鑒定到256±9個肽段,對應(yīng)于105±17個蛋白質(zhì);從400 fgE.coli酶解產(chǎn)物中仍能鑒定到9條肽段,對應(yīng)于4±1個蛋白質(zhì)。據(jù)報道,基于內(nèi)徑為20 μm的CZE分離毛細管與Qq-TOF Impact質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng),肽段檢出限可達260 zmol[58];基于10 μm的涂層CZE分離毛細管與Q-Exactive HF質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng),肽段檢出限可低至1 zmol[59]。

單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)目前主要基于“bottom-up”策略,其有望獲得不同細胞個體特征的蛋白質(zhì)全景信息,從而深入了解細胞異質(zhì)性[60,61],然而由于樣品量極少,因此對分離鑒定的靈敏度提出了更高的要求[62]。而CE-MS具備樣本需求量少、檢測靈敏度高的優(yōu)勢,可以滿足單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析的需求[63]。Nemes等[64]采用CZE-MS分析了瓜蛙胚胎細胞有絲分裂成16個細胞后的細胞異質(zhì)性(見圖3),分別從中線ventral-animal細胞(稱為V11)、中線ventral-vegetal細胞(稱為V21)和中線dorsal-animal細胞(稱為D11)中鑒定了1 070、884和853個蛋白質(zhì);通過GO分析,揭示了鑒定的蛋白質(zhì)的不同生物學(xué)功能,且豐度跨越6個數(shù)量級;通過串聯(lián)質(zhì)譜標簽(TMT)標記實現(xiàn)了V11、V21、D11中蛋白質(zhì)的相對定量。此外,他們進一步改進了樣品預(yù)處理方法和CE-MS系統(tǒng),實現(xiàn)了單細胞蛋白質(zhì)組的無標記定量分析[65,66]。盡管他們采取的單細胞是卵細胞,仍展示出CE-MS在單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用潛力。

CZE基于分析物的質(zhì)荷比的不同而分離,與基于分析物疏水性質(zhì)不同而分離的反相液相色譜(RPLC)互補,為強極性的肽段和疏水性質(zhì)相近的肽段(尤其是翻譯后修飾肽段)的分離鑒定提供了新的途徑。Lindner等[67,68]采用CZE-MS分析了組蛋白酶解肽段。組蛋白酶解肽段親水性好,在反相色譜上保留弱甚至無保留導(dǎo)致無法有效分離鑒定,而CZE-MS可以實現(xiàn)其分離鑒定,包括乙?；?、磷酸化等翻譯后修飾位點的鑒定。Dovichi等[69]結(jié)合RPLC和CZE,分離鑒定了完整糖肽:通過RPLC,能夠?qū)㈦亩喂羌芙Y(jié)構(gòu)相似的糖肽分離;再通過CZE,能夠?qū)⒐羌芙Y(jié)構(gòu)相似但糖苷不同的糖肽分離。從鑒定結(jié)果可以看出,僅通過RPLC分離鑒定了197條完整糖肽,僅通過CZE分離鑒定了159條,兩者結(jié)合可以鑒定268條。由此可見,CE-MS技術(shù)以獨特的優(yōu)勢與LC-MS技術(shù)互為補充,從而提高酶解肽段鑒定的覆蓋度。

2.2 在蛋白質(zhì)組“top-down”分析中的應(yīng)用

由于基因突變、RNA可變剪切、蛋白質(zhì)翻譯后修飾等原因,一個蛋白質(zhì)編碼基因可能會產(chǎn)生多個蛋白質(zhì)變體(proteoforms)[70]。雖然同一基因產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)變體的一級結(jié)構(gòu)高度相似,但是其生物學(xué)功能卻有明顯差異[71]。因此,蛋白質(zhì)變體的深度鑒定將是下一代蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展趨勢[72]。與“bottom-up”策略不同,“top-down”策略,即將蛋白質(zhì)分子直接進行分離、質(zhì)譜鑒定,可以獲得更精準、更豐富、更完整的蛋白質(zhì)變體信息[6,7,72,73]。蛋白質(zhì)變體的深度鑒定面臨的巨大挑戰(zhàn)仍然來自生物樣品的復(fù)雜性[12],因此發(fā)展高效的完整蛋白質(zhì)分離技術(shù)和高靈敏度的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)至關(guān)重要。

在完整蛋白質(zhì)分離鑒定方面,CE-MS技術(shù)的優(yōu)勢尤為明顯[45,74]。早在1996年,Mclafferty等[75]利用CZE與傅里葉變換離子回旋共振(FTICR)用于完整蛋白質(zhì)的分離檢測,其靈敏度高達amol級;Smith等[76]也報道了CZE-FTICR MS對于8～20 kDa蛋白質(zhì)的檢出限可達30 zmol。Yates等[77]比較了CZE-MS和RPLC-MS的蛋白質(zhì)分離鑒定效果。與RPLC-MS相比,CZE-MS靈敏度提高了100倍,僅需2.5 ng(約12 amol)樣品量。分析其主要原因是:與RPLC相比,CZE對于蛋白質(zhì)分離具有更高的分離效率和回收率。Kelleher等[78]采用Gelfree方法按照相對分子質(zhì)量大小進行預(yù)分級,然后收集餾分進行CZE-MS分析。從P. aeruginosa樣品中鑒定到30個30～80 kDa的蛋白質(zhì),其中30～50 kDa的蛋白質(zhì)分離半峰寬為24～57 s; 48～60 kDa的蛋白質(zhì)分離半峰寬約為24 s,充分顯示了CE在大分子分離方面的優(yōu)勢。

圖 3 基于CE-MS分析瓜蛙胚胎單細胞的(a)示意圖和(b)鑒定結(jié)果[64]Fig. 3 (a) Schematic diagram and (b) results of CE-MS proteomic analysis of single embryonic cells[64]

隨著質(zhì)譜技術(shù)及數(shù)據(jù)解析方法的發(fā)展,CE-MS技術(shù)被用于復(fù)雜樣品“top-down”規(guī)?；治?。Sun等[79]采用基于聚丙烯酰胺涂層的分離毛細管和基于電滲流控制鞘流液流速的低流速鞘流液CE-MS接口提高分離效率和靈敏度,并采用動態(tài)pH界面堆積的方法提高上樣量,從1 μgE.coli樣品中單針鑒定到200個蛋白質(zhì)和約600個蛋白質(zhì)變體;其分離窗口增加至90 min,峰容量達到280(見圖4)。采用構(gòu)建的CZE-MS/MS系統(tǒng)對斑馬魚腦Teo區(qū)和Cb區(qū)進行了整體蛋白質(zhì)水平上的定量分析[80]:從Cb區(qū)和Teo區(qū)單針分別鑒定了1 730個和2 024個蛋白質(zhì)變體,合并6針鑒定結(jié)果,鑒定了4 000個蛋白質(zhì)變體;采取無標定量的方法,定量到了2 000個蛋白質(zhì)變體,其中786個蛋白質(zhì)變體存在明顯差異。

圖 4 基于CZE-MS/MS技術(shù)對E. coli蛋白質(zhì)組“top-down”分析的分離鑒定結(jié)果[79]Fig. 4 Data about top-down proteomics of E. coli using CZE-MS/MS[79]

由于CE分析速度快,且與LC分離正交性好,因此CE-MS結(jié)合LC能夠進一步提高蛋白質(zhì)分離峰容量和鑒定覆蓋度[81,82]。Sun等[82]將E.coli蛋白質(zhì)先進行尺寸排阻色譜(SEC)和RPLC分級,再將100個級分分別用CZE-MS/MS分析,三維的峰容量高達4 000,總共鑒定了850個蛋白質(zhì)和5 700個蛋白質(zhì)變體。此外,CE與新型裂解模式的結(jié)合也被嘗試用于提高蛋白質(zhì)變體的鑒定深度?；罨x子電子轉(zhuǎn)移(AI-ETD)裂解模式和紫外光裂解模式(UVPD)為產(chǎn)生更多的匹配片段從而提高蛋白質(zhì)的序列覆蓋率和鑒定準確性提供了新的手段[83-85]。Sun等[86]基于SEC預(yù)分級-CZE分離-AI-ETD鑒定,從E.coli樣品中可信地鑒定到3 028個蛋白質(zhì)變體,其中包括豐富的翻譯后修飾信息及N端信息;同時CZE-MS與UVPD技術(shù)的結(jié)合也被嘗試用于分析斑馬魚腦樣品[87]。CE-MS技術(shù)的優(yōu)勢結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)的不斷革新以及數(shù)據(jù)解析方法的逐步完善,從而推進了“top-down”蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。

2.3 在蛋白質(zhì)復(fù)合物native MS分析中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)通常與其他分子(如核酸、藥物分子、輔助因子、配體、其他蛋白質(zhì)等)相互作用形成復(fù)合物從而在特定的時間和空間內(nèi)完成特定的功能[88]。研究蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和結(jié)構(gòu)對理解生物系統(tǒng)具有重要意義,而傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)通常無法從完整蛋白質(zhì)復(fù)合物水平上進行分析。Native MS基于電噴霧電離技術(shù),使用接近生理條件的緩沖溶液,使蛋白質(zhì)復(fù)合物維持天然狀態(tài)下的四級拓撲結(jié)構(gòu),能夠獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物的精確相對分子質(zhì)量、亞基組成及空間排列、化學(xué)計量比等,為蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析提供了更多的信息[9,89,90]。

蛋白質(zhì)復(fù)合物的native MS分析通常需要結(jié)合分離純化方法[90-92]。相比于LC、凝膠電泳等分離方法,CZE可以采用近生理條件的緩沖液從而能夠更好地維持蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu),且在大分子分離方面分辨率高,此外與質(zhì)譜聯(lián)用的檢測靈敏度高。因此,CZE-MS技術(shù)在蛋白質(zhì)復(fù)合物native MS分析中備受關(guān)注。Nguyen等[33]采用CZE與Q-TOF聯(lián)用,實現(xiàn)了在非變性條件下血紅細胞中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-金屬復(fù)合物的分離檢測,包括碳酸酐酶II-Zn復(fù)合物、碳酸酐酶I-Zn復(fù)合物和血紅蛋白四聚體,豐度范圍跨越3個數(shù)量級。Gahoual等[93]采用CZE與Q-TOF質(zhì)譜聯(lián)用,分離檢測了445～1.34 MDa的血藍蛋白復(fù)合物。Belov等[41]采用CZE與EMR orbitrap聯(lián)用,在非變性條件下分離鑒定了標準蛋白質(zhì)復(fù)合物和E.coli核糖體樣品,并通過二級碎裂實現(xiàn)了其中蛋白質(zhì)變體的鑒定。為了提高分離能力,Sun等[92]使用SEC對提取的蛋白質(zhì)樣品進行預(yù)先分級,搭建了SEC-CZE-Native MS平臺分析E.coli樣品(見圖5),總共鑒定到144種蛋白質(zhì)、672個蛋白質(zhì)變體和23個蛋白質(zhì)復(fù)合物,其中包括4個蛋白質(zhì)二聚體、16個蛋白質(zhì)-金屬復(fù)合物、2個蛋白質(zhì)-[2Fe-2S]復(fù)合物和一個蛋白質(zhì)-谷氨酰胺復(fù)合物。然而由于使用的質(zhì)譜受m/z掃描范圍的限制,沒有鑒定到更大相對分子質(zhì)量的復(fù)合物。

圖 5 E. coli蛋白質(zhì)組通過SEC-CZE-Native MS分析的示意圖及分離鑒定結(jié)果[92]Fig. 5 Schematic diagram and results of SEC-CZE-Native MS analysis of E. coli proteome[92]

CE-MS將高效分離和native MS聯(lián)合起來,為蛋白質(zhì)復(fù)合物分析提供了有力工具。在未來的研究中,CE-native MS方法也有望通過與不同的預(yù)分離方法相結(jié)合、質(zhì)譜儀器的進一步改進和鑒定解析方法的突破,對復(fù)雜體系中蛋白質(zhì)復(fù)合物進行更有效的表征。

3 總結(jié)與展望

靈敏度高、噴霧穩(wěn)定的CE-MS接口的發(fā)展及商品化使CE-MS技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域逐漸被關(guān)注,并以其獨特的優(yōu)勢在肽段、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離鑒定中發(fā)揮著重要的作用。首先,CE-MS技術(shù)具有進樣體積小、靈敏度高、分析速度快的優(yōu)點,結(jié)合高通量的樣品預(yù)處理技術(shù)及自動化的上樣技術(shù)將有望實現(xiàn)高通量、高靈敏度的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究;其次,CE-MS技術(shù)與LC-MS技術(shù)互為補充,可以提高蛋白質(zhì)組分離鑒定的覆蓋度;第三,與液相色譜相比,毛細管電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)大分子的分離方面具有分離效率高、回收率高的優(yōu)勢,其與質(zhì)譜的聯(lián)用在整體蛋白質(zhì)的分離鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛;最后,CE-native MS在蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離鑒定方面具有很大的應(yīng)用潛力。