畜禽養(yǎng)殖廢水來(lái)源的自養(yǎng)氨氧化菌篩選及氨氮去除效果研究

孫 宏 ，張 恒,2，王 新，李園成，湯江武*，吳逸飛，姚曉紅，沈 琦，葛向陽(yáng)

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 310021；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430030）

畜禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化、集約化發(fā)展帶來(lái)了大量含有高濃度氨、磷污染物的養(yǎng)殖廢水，若處置不當(dāng)將導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，威脅人類健康。當(dāng)前畜禽養(yǎng)殖廢水的脫氮技術(shù)主要以基于相關(guān)功能微生物的生化反應(yīng)措施為主。其中，自養(yǎng)氨氧化菌在氮素循環(huán)中扮演了極其重要的角色，其主導(dǎo)的將氨氮（NH4+-N）轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}氮（NO2–-N）過(guò)程為整個(gè)生物脫氮反應(yīng)的關(guān)鍵限速步驟，而該步驟也是一種較為可行的處理NH4+-N 的措施[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外研究已在農(nóng)田土壤、污水處理廠、植物根際、人工濕地等來(lái)源相繼發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)氨氧化菌的存在[3-4]。由于不同環(huán)境下的自養(yǎng)氨氧化菌的多樣性及生態(tài)活性均有顯著差異，因而篩選分離不同來(lái)源或針對(duì)不同處理水體的氨氧化菌仍具有顯著現(xiàn)實(shí)意義[5]。特別是當(dāng)前畜禽養(yǎng)殖廢水由于NH4+-N 含量顯著高于普通污染水體，但目前有關(guān)從養(yǎng)殖廢水中篩選自養(yǎng)氨氧化菌的研究仍較少，對(duì)其處理效果也尚未明確。

本研究擬在采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE）監(jiān)控自養(yǎng)氨氧化功能菌群變化的基礎(chǔ)上，從處置畜禽養(yǎng)殖廢水的活性污泥中篩選自養(yǎng)氨氧化菌，并初步評(píng)價(jià)篩選獲得的菌株在養(yǎng)殖廢水中的實(shí)際去除效果，以期為處理養(yǎng)殖廢水、實(shí)現(xiàn)NH4+-N 的高效去除提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 活性污泥與富集培養(yǎng)基 本試驗(yàn)所用活性污泥與養(yǎng)殖廢水均采自安吉吉成牧業(yè)有限公司養(yǎng)殖廢水綜合處理工程。其中，養(yǎng)殖廢水的NH4+-N、硝態(tài)氮（NO3–-N）、化學(xué)需氧量（COD）和pH 分別達(dá)到550 mg/L、25.4 mg/L、2190 mg/L 和7.8。

自養(yǎng)氨氧化菌富集培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液和（NH4）2SO4溶液（10 g/L）按9:1 的體積比配制而成?；A(chǔ)液為磷酸緩沖液100 mL、NaCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、CaCl20.136 g、NaHCO30.5 g、CuSO4·5H2O 母液（0.187 g/L）、EDTA-Na 母液（3.958 g/L）、MnCl2·4H2O 母液（0.114 g/L）、CoSO4·6H2O 母液（0.31 g/L）、Na2MoO4母液（0.08 g/L）各1 mL，加去離子水定容至1 000 mL 后滅菌。其中，磷酸緩沖液為K2HPO441.076 g、NaH2PO42.721 g，加水定容至1 000 mL。（NH4）2SO4溶液，單獨(dú)滅菌。

在液體富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入1.5%瓊脂粉并滅菌制備固體培養(yǎng)基。氨氧化富集培養(yǎng)基中的NH4+-N 濃度為212 mg/L。

1.2 自養(yǎng)氨氧化菌的富集培養(yǎng) 取100 mL 運(yùn)行良好的液體活性污泥5 000 r/min 下離心5 min 去上清，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2 次后，定容至100 mL，取樣50 mL于-20℃保存。剩余50 mL 污泥按照10%（v/v）的接種量接種至100 mL 自養(yǎng)氨氧化菌富集培養(yǎng)基中，于200 r/min、28℃下?lián)u床培養(yǎng)，每隔 2 d 取樣檢測(cè)NH4+-N、NO3–-N、NO2–-N 濃度和pH，采用1 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)pH 維持在7.5，當(dāng)發(fā)現(xiàn)體系NH4+-N 耗盡時(shí)，補(bǔ)加NH4+-N 至200 mg/L，當(dāng)NH4+-N 再次耗盡時(shí)，取樣50 mL 于-20℃下保存?zhèn)涮酓NA，并進(jìn)行10%轉(zhuǎn)接到新的富集培養(yǎng)基中，重復(fù)上述富集轉(zhuǎn)接操作4 次。

對(duì)于保存的富集轉(zhuǎn)接樣品采用水相提取試劑盒（PowerWater DNA Isolation Kit，MOBIO）進(jìn)行DNA提取，使用帶GC 夾子的amoA 基因引物（GC+amoA-1F：5 ' -C G C C G C G C G G C G G G C G G G G C G G G G G C G G G G T T TCTACTGGTGGT-3'；amoA-2R：5'-CCCCTCKGSAA AGCCTTCTTC -3'）[6]，按照文獻(xiàn)[7]的相應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增后，放入4℃冰箱保存。amoA 基因的DGGE 電泳步驟參照張智超等[8]的報(bào)道進(jìn)行，尿素變性梯度選用40%～60%，將amoA 基因PCR 產(chǎn)物取10 μL 上樣，在60℃、120 V 下跑膠10 h，EB 染色30 min 后拍照。切割明亮條帶用不帶GC 夾子的amoA 引物擴(kuò)增，電泳驗(yàn)證擴(kuò)增成功后送交生工生物（上海）有限公司測(cè)序，用以評(píng)價(jià)富集培養(yǎng)的效果。

1.3 自養(yǎng)氨氧化菌的分離和鑒定 采用轉(zhuǎn)接4 次后的富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋（10–2、10–3、10–4），涂氨氧化培養(yǎng)基平板培養(yǎng)7 d，挑取細(xì)小單菌落接種至含有20 mL 富集培養(yǎng)基的三角瓶中于200 r/min，30℃搖床培養(yǎng)3 d，使用Griess 試劑和二苯胺試劑檢測(cè)是否有NO2–-N 和NO3–-N 的生成[9]。取NO2–-N 顯色陽(yáng)性而NO3–-N 顯色陰性的菌株，進(jìn)一步在富集培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)3～5 次轉(zhuǎn)接純化培養(yǎng)，采用引物27F 和1492R 進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序鑒定[7]。測(cè)序結(jié)果遞交NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast 程序?qū)Ρ?，采用MEGA 7.0 軟件選取同源性高的序列采用Neighbor-Joining 算法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[7]。同時(shí)，篩選的自養(yǎng)氨氧化菌送省農(nóng)科院檢測(cè)中心進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.4 篩選菌株的原位硝化能力評(píng)定 接種終濃度為104CFU/mL的自養(yǎng)氨氧化菌至含有200 mL 滅菌養(yǎng)殖廢水（5 倍稀釋）的500 mL 三角瓶中，以不接菌的滅菌稀釋廢水為對(duì)照，在30℃、200 r/min 下恒溫振蕩培養(yǎng)，每天取樣檢測(cè)NH4+-N、NO3–-N 和NO2–-N 的含量。每組試驗(yàn)包含3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)周期為5 d。氨氧化速率計(jì)算：v=（pt-p0）?t，式中，v為t時(shí)間內(nèi)的NO2–-N 的生成速度，mg/（L·h）；p0為初始NO2–-N 濃度，mg/L；pt為培養(yǎng)t時(shí)間后對(duì)應(yīng)NO2–-N 的濃度，mg/L；t為培養(yǎng)或處理時(shí)間[7]。

1.5 水質(zhì)檢測(cè)方法 NH4+-N 檢測(cè)方法采用《水質(zhì)氨氮的測(cè)定-水楊酸分光光度法》（GB 7481-87）；NO3–-N含量檢測(cè)采用《水質(zhì)硝酸鹽氮的測(cè)定-紫外分光光度法》（HZ-HJ-SZ-0138）；NO2–-N 的測(cè)定采用《水質(zhì)亞硝酸鹽氮的測(cè)定-分光光度法》（GB 7493-87）；COD檢測(cè)方法采用《水質(zhì)化學(xué)需氧量的測(cè)定-重鉻酸鹽法》（GB 11914-89）。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)處理采用Excel 軟件進(jìn)行，除菌株篩選結(jié)果外，均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性分析采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌的富集培養(yǎng) DGGE 及條帶測(cè)序結(jié)果顯示（圖1、表1），自養(yǎng)氨氧化菌富集培養(yǎng)過(guò)程中，具有amoA 功能基因的微生物分布隨著培養(yǎng)轉(zhuǎn)接過(guò)程而發(fā)生變化。其中，條帶A～C 所對(duì)應(yīng)的亞硝化菌的濃度逐漸減低，而條帶D 對(duì)應(yīng)的亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonassp.）微生物的濃度在4 次富集后明顯增加，成為富集液中優(yōu)勢(shì)菌株。

圖1 自養(yǎng)氨氧化菌富集轉(zhuǎn)接過(guò)程的DGGE 指紋圖譜

表1 DGGE 條帶測(cè)序結(jié)果

2.2 自養(yǎng)氨氧化菌的篩選和鑒定 經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)后，從氨氧化平板上共挑到7 株菌落細(xì)小且為灰白或者乳白的菌落，分別命名為AH-1 至AH-7。接種到氨氧化菌富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取樣進(jìn)行NO2–-N 和NO3–-N 顯色定性分析后發(fā)現(xiàn)，AH-7 的NO2–-N 顯色最為明顯，因而選擇AH-7 作為備用菌株進(jìn)行鑒定。

AH-7 的電鏡結(jié)果顯示（圖2），菌株AH-7 呈卵圓形，直徑在0.5～0.75 μm，菌體細(xì)胞多呈兩兩聚集狀態(tài)分布。菌株AH-7 的氨氧化標(biāo)志基因-amoA 基因跑膠鑒定呈陽(yáng)性（圖3-B），其16S rDNA 擴(kuò)增（圖3-A）并測(cè)序后，經(jīng)過(guò)Blast 對(duì)比，序列與亞硝化單胞菌（Nitrosomonas eutropha）（KU747123.1）的相似度最高，達(dá)到100%。挑選相似度高于98%的典型菌株進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果菌株AH-7屬于亞硝化單胞菌（N.eutropha）。

圖2 菌株AH-7 在透射電鏡下的細(xì)胞形態(tài)（25 000×）

2.3 自養(yǎng)氨氧化菌AH-7 對(duì)滅菌養(yǎng)殖廢水中氮素含量的影響 由圖5 可知，在NH4+-N 為102 mg/L 的初始濃度下，經(jīng)過(guò)5 d 的培養(yǎng)，養(yǎng)殖廢水中NH4+-N 濃度降至7.56 mg/L，NH4+-N 降解率達(dá)到92.59%，顯著高于未接菌對(duì)照組。同時(shí)，隨著NH4+-N 含量降低，接入AH-7 的培養(yǎng)體系內(nèi)NO2–-N 可積累至87.24 mg/L（P<0.05），氨氧化速率達(dá)到16.87 mg/（L·d），顯著高于對(duì)照組。此外，培養(yǎng)前后NO3–-N 含量未見(jiàn)顯著變化。同時(shí)，接菌組和對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)的NO3–-N 含量也均未見(jiàn)顯著差異。

圖3 菌株AH-7 的16S rDNA（1 500 bp，A）和amoA 基因（491 bp，B）的PCR 擴(kuò)增電泳圖

圖4 菌株AH-7 的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

圖5 菌株AH-7 對(duì)滅菌養(yǎng)殖廢水中氮素含量的影響

3 討論

經(jīng)過(guò)自養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的多次富集馴化，配合DGGE 對(duì)氨氧化amoA 功能基因的指示，本研究篩選獲得了1 株自養(yǎng)氨氧化菌AH-7，并鑒定為亞硝化單胞菌（N.eutropha）。前人研究證實(shí)，由于氨氧化菌自身生長(zhǎng)緩慢，對(duì)環(huán)境變化又十分敏感，因而該類細(xì)菌的篩選難度較高[10-11]。同時(shí)由于培養(yǎng)周期長(zhǎng)，而在培養(yǎng)基平板上菌落小，因此往往需要經(jīng)過(guò)多次富集并配合適當(dāng)?shù)姆肿訖z測(cè)手段來(lái)提高篩選效率和準(zhǔn)確性[12]。本研究所選用的amoA 基因是編碼氨氧化過(guò)程催化中關(guān)鍵催化酶-氨單加氧酶的基因，可直接用于指示自養(yǎng)氨氧化菌[13]。Abe 等[14]和Reddy等[15]采用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)amoA 基因進(jìn)行標(biāo)記用以快速篩選獲得自養(yǎng)氨氧化菌的純培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)室前期已成功采用基于16S rDNA 為基礎(chǔ)的DGGE 技術(shù)輔助篩選NH4+-N 降解菌株[8]，而本研究中直接采用amoA功能基因進(jìn)行跟蹤進(jìn)一步提高了對(duì)目標(biāo)微生物在富集過(guò)程中的指示作用，表明采用該技術(shù)可為篩選氨氧化菌提供幫助[16]。另一方面，本研究篩選到的亞硝化單胞菌屬于亞硝化單胞菌屬的自養(yǎng)氨氧化菌。該菌是目前已有報(bào)道中最為常見(jiàn)的氨氧化菌種，其在污水和富營(yíng)養(yǎng)化地表水中分布廣、對(duì)氨氧化的貢獻(xiàn)也較大[17]。如魏偉偉等[18]曾報(bào)道在自然濕地底泥中富集分離到的氨氧化菌主要為亞硝化單胞菌屬。國(guó)外研究表明，氨氧化菌的生長(zhǎng)條件差異較大，在不同環(huán)境營(yíng)養(yǎng)水平下篩選的自養(yǎng)氨氧化菌有顯著差異[19]。Bollmann 等[16]研究表明，通過(guò)采用連續(xù)富集培養(yǎng)的手段，較易富集到亞硝化單胞菌屬的氨氧化菌，但對(duì)其他類別的氨氧化菌的分離效果較差。Otawa 等[20]對(duì)比了11 個(gè)污水處理廠中氨氧化菌含量后發(fā)現(xiàn)，在高NH4+-N 濃度（大于100 mg/L）下，亞硝化單胞菌（N.eutropha）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；而在低NH4+-N濃度下，N.oligotropha菌的數(shù)量占優(yōu)勢(shì)。本研究中富集液濃度達(dá)到212 mg/L，因而富集后期以亞硝化單胞菌為主，符合上述研究結(jié)論。

本研究發(fā)現(xiàn)AH-7 在滅菌稀釋養(yǎng)殖廢水中培養(yǎng)5 d后的NH4+-N 降解率達(dá)到92.59%，顯著高于魏偉偉等[18]從自然濕地來(lái)源篩選的氨氧化菌的降解率（73.86%）和曾濤濤等[9]選用AOB 人工培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d 后所報(bào)道的最高73.1%的氨氧化能力。上述NH4+-N 降解差異可能與菌株不同和初始培養(yǎng)條件差異均有關(guān)。如魏偉偉等[18]研究中初始NH4+-N 濃度僅為5 mg/L 左右，與其相比，本研究中所用的NH4+-N 初始濃度高于100 mg/L，因而該菌株在該濃度下具有較好的降解能力。Shrestha等[21]報(bào)道自養(yǎng)氨氧化菌在濃度為40～50 mg/L 的初始NH4+-N 濃度下具有最佳的降解效率。張健等[22]從對(duì)蝦養(yǎng)殖底泥中篩選到一株氨氧化菌后研究表明，NH4+-N濃度在1～200 mg/L，氨氧化速率隨氨濃度的升高而加快；但當(dāng)NH4+-N 濃度超過(guò)2 000 mg/L 后，氨氧化活性將會(huì)受到明顯抑制。但上述研究[22]在與本研究一致的初始NH4+-N 濃度（100 mg/L）下培養(yǎng)16 d 后，降解率僅為60.21%，顯著低于本試驗(yàn)的報(bào)道，表明菌株AH-7 可能具有較好的應(yīng)用開發(fā)前景。熊英等[23]研究證實(shí)單株亞硝化單胞菌在不同游離氨條件下具有不同的親和力，從而影響NH4+-N 轉(zhuǎn)化效率，并推測(cè)該差異可能與amoA 基因不同的拷貝數(shù)有關(guān)。同時(shí)，本研究中NH4+-N 的顯著降低伴隨著NO2–-N 含量的顯著提高，進(jìn)一步表明系統(tǒng)內(nèi)主要發(fā)生了氨氧化代謝過(guò)程[24]。因此，通過(guò)投加篩選的AH-7 菌株，可增加體系的硝化效果，從而在畜禽廢水NH4+-N 去除上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。另一方面，有報(bào)道亞硝化單胞菌屬的微生物能在氧受限條件下，發(fā)生以NO2–-N 為受體的厭氧氨氧化反應(yīng)，顯著提高生物脫氮效率[25]。于濛雨等[26]采用模擬系統(tǒng)固定化培養(yǎng)氨氧化菌后發(fā)現(xiàn)，氨氧化菌可實(shí)現(xiàn)短程硝化作用，氨氧化速率可高達(dá)50 mg/（L·d）。上述結(jié)果解釋了本研究中經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，滅菌養(yǎng)殖廢水中氮含量總體有所下降的情況，但有關(guān)AH-7 菌株是否有上述功能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。需要注意的是，與前人采用的方法不同[9,18]，本研究為了降低高濃度NH4+-N 對(duì)氨氧化菌生長(zhǎng)的不利影響，同時(shí)兼顧后續(xù)在實(shí)際應(yīng)用中與微藻的復(fù)配使用，對(duì)畜禽廢水做了稀釋處理用以評(píng)價(jià)AH-7 菌株的硝化效果。上述結(jié)果尚不能完整說(shuō)明該菌在實(shí)際條件即未稀釋廢水中的應(yīng)用效果。后續(xù)有關(guān)該菌的最高NH4+-N 耐受濃度的試驗(yàn)正在開展，以完整揭示其在實(shí)際處理中的應(yīng)用前景和效果。此外，本研究為了排除養(yǎng)殖廢水中外源微生物的影響而采用滅菌水作為試驗(yàn)原料對(duì)篩選的菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)，后續(xù)將進(jìn)一步采用未滅菌養(yǎng)殖廢水對(duì)其脫NH4+-N 功能進(jìn)行研究，以深入揭示該菌在實(shí)際處理中的應(yīng)用前景和效果。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從養(yǎng)殖廢水污泥中分離獲得1 株自養(yǎng)氨氧化菌AH-7，經(jīng)過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察和16S rDNA 序列鑒定為亞硝化單胞菌（N.eutropha）。在本試驗(yàn)條件下，該菌在滅菌廢水中有較好的NH4+-N 去除作用，NH4+-N 降解率達(dá)到92.59%，氨氧化速率達(dá)到16.87 mg/（L·d）。