西藍花廢棄莖葉固態(tài)發(fā)酵飼料的營養(yǎng)成分及活性代謝產物的分析研究

孫 宏，姚曉紅，湯江武，吳逸飛，王 新，李園成，沈 琦

（植物保護與微生物研究所，浙江省農業(yè)科學院，浙江杭州 310021）

西藍花（Brassica oleraceaL.var.italica）又名綠菜花，其蛋白質、維生素和礦物質含量高，富含酚類化合物，可有效預防人體心腦血管疾病和癌癥的發(fā)生。目前，中國西藍花種植面積已超過2.7 萬hm2，年產量超過100萬t[1-2]，但新鮮西藍花在采摘過程中會產生大量的廢棄莖葉，其含水率在90% 以上，極易腐爛，導致臭氣污染和附近水源地污染[2]，嚴重威脅環(huán)境安全。國內外研究嘗試通過制備青貯飼料、生物發(fā)酵飼料和西藍花莖葉蛋白粉等方式來實現(xiàn)西藍花廢棄莖葉的飼料化利用，取得了較好的效果[3-5]。由于將西藍花廢棄莖葉制備為發(fā)酵飼料具有成本較低、工藝控制程度高、發(fā)酵周期短等優(yōu)勢，較適宜于規(guī)?；茝V應用[5-6]。但目前該方面的研究仍較少，且多集中于動物應用效果評價，缺乏對發(fā)酵前后西藍花莖葉中營養(yǎng)成分，特別是活性成分的全面分析評估。生物發(fā)酵飼料是一個復合體系，包括發(fā)酵底物原料及其降解產物、微生物生長代謝產物等多種復雜的小分子化合物，這也增加了其全面分析的難度。

代謝組學技術（Metabolomics）是一種基于組學思想和高分辨率色譜、質譜分析手段，用于研究生物代謝途徑及代謝產物的技術。自20 世紀末以來，代謝組學技術已逐漸應用于動物血液、食品發(fā)酵乳制品、中草藥等復雜代謝物的定性和定量研究[7]。但目前其在固態(tài)發(fā)酵過程中的應用報道仍較少[8]。本試驗嘗試采用代謝組學技術對西藍花莖葉與玉米皮、米糠和麩皮等原料混合后固態(tài)發(fā)酵制備的發(fā)酵飼料中活性產物進行分析，探討固態(tài)發(fā)酵對混合發(fā)酵原料中代謝物的影響，為完善和評價西藍花莖葉制備發(fā)酵飼料的實際效果提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 西藍花原料及發(fā)酵菌株 西藍花莖葉、玉米皮、米糠和麩皮均購自浙江臺州天萊生物科技有限公司。短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）XLJ2-1、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）99-1 和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）Lvk1 均為本實驗室培養(yǎng)選育和保藏。新鮮西藍花莖葉原料營養(yǎng)成分（鮮料）實測值分別為粗蛋白質2.62%、水分85.0%、粗纖維4.8%、粗脂肪0.5%、粗灰分1.6%。

1.2 固態(tài)發(fā)酵西藍花的制備 發(fā)酵原料為含有50%（w/w）西藍花莖葉碎渣、20%玉米皮、20%米糠和10%麩皮的混合原料。將上述發(fā)酵底物混合均勻后，接種1.0%（v/w）含有短小芽孢桿菌XLJ2-1、釀酒酵母99-1 和干酪乳桿菌Lvk1 的混合菌液（比例為1:1:1，v/v；混合菌液中初始活菌數(shù)分別為2.6×108、0.8×108、2.2×108CFU/mL）。取2.5 kg 西藍花廢棄莖葉混合原料裝入飼料厭氧呼吸發(fā)酵袋中，于30℃下恒溫培養(yǎng)15 d。以接種前的混合原料為對照，每組設置5 個重復。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)成分分析及活菌數(shù)測定 取接種前與發(fā)酵后的新鮮西藍花莖葉樣品200 g，參照文獻[9]的報道，測定西藍花樣品的粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維、水分和灰分等常規(guī)營養(yǎng)成分。參照《食品微生物學檢驗-菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2-2016）檢測西藍花發(fā)酵后的芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌數(shù)量。

1.3.2 發(fā)酵樣品的代謝組測定

1.3.2.1 樣品提取及預處理 取發(fā)酵前后新鮮西藍花樣品1 g，加入50 mL 液氮研磨均勻，取0.1 g 研磨樣品放入無菌1.5 mL 離心管中，加入0.4 mL 預冷的提取液（甲醇:乙腈 :水，4:4:2，v/v），渦旋混合1 min 后，–20℃下靜置60 min，14 000 r/min 離心20 min，取離心上清真空干燥至干。質譜分析前加入100 μL 濃度為50%的乙腈水溶液（乙腈:水，1:1，v/v）復溶。將復溶后的樣品經(jīng)過0.22 μm 微孔濾膜過濾后，置于液相樣品瓶中，待測。

1.3.2.2 UPLC-Q-TOF 檢測 樣品采用UPLC 系統(tǒng)（Agilent 1290，CA，USA）進行色譜分離，其中色譜柱采用C18反向色譜柱（1.7 μm，2.1×100 mm），柱溫25℃、流速0.3 mL/min、進樣體積2 μL。流動相A 為含有終濃度25 mmol/L 乙酸銨和25 mmol/L 氨水的水溶液，流動相B 為乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，95% 流動相B；1～14 min，流動相B 濃度從95%下降到65%；14～16 min，流動相B 從65%繼續(xù)下降到40%；16～18 min 維持40%流動相B 濃度；18～20 min，95%流動相B 沖洗。

樣品經(jīng)UPLC 分離后采用AB SCIEX TOF 6600 質譜儀進行分析。電噴霧離子源（ESI）；四級桿飛行時間串聯(lián)質量分析器；掃描采用正負離子兩種模式進行，離子源溫度600℃，毛細管電壓2.0 kV，質核比掃描范圍60～1 000 m/z。

1.3.2.3 差異代謝物鑒定及代謝途徑富集分析 將總離子流圖譜轉換為格式文件mzXML，然后利用XCMS 程序提取原始數(shù)據(jù)，并進行峰對齊、保留時間矯正和提取峰積分面積，根據(jù)保留時間、精準質量數(shù)匹配原則（誤差小于20 mg/kg）和二級圖譜匹配方式等，與人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB）、微生物代謝組數(shù)據(jù)庫（YMDB、HMDB）和自建數(shù)據(jù)庫中相關信息進行匹配，從而完成代謝物鑒定[10]。對XCMS 輸出的保留時間-質核比數(shù)據(jù)矩陣，采用SIMCA-P11 軟件進行多維統(tǒng)計（PCA）分析區(qū)分發(fā)酵前后西藍花莖葉樣品。以差異倍數(shù)分析Ratio>2 或<0.5 為篩選標準，找出西藍花莖葉發(fā)酵前后的差異代謝物；以P<0.05 為標準，將候選差異代謝物的相對含量進一步進行t檢驗驗證。最后，為了闡明差異代謝物的生物學功能，使用MetaboAnalyst 3.0 軟件結合KEGG 等數(shù)據(jù)庫，通過富集倍數(shù)檢驗來確定受到顯著影響的代謝途徑[11]。

1.3.3 活性產物分析驗證 發(fā)酵西藍花樣品中粗多糖的測定參照《植物源食品中粗多糖的測定》（SN/T 4260-2015）進行；酸溶蛋白含量參照國標《大豆肽粉》（GB/T 22492-2008）的測定方法進行；總酸參照《食品中總酸的測定方法》（GB/T 12456-2008）測定；γ-氨基丁酸的測定參照顧宇翔等[12]的報道進行。

1.4 統(tǒng)計分析 利用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間差異分析采用t檢驗。所有數(shù)據(jù)以平均值± 標準差表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 西藍花莖葉混合原料發(fā)酵前后常規(guī)營養(yǎng)成分分析及活菌數(shù)測定 西藍花莖葉混合原料樣品經(jīng)過15 d 固態(tài)發(fā)酵后呈黃色，有較強的酸香氣味。由表1 可知，發(fā)酵后西藍花莖葉混合原料中芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌分別為3.5×106、7.6×106、0.2×106CFU/g。與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后的西藍花莖葉混合原料中粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維、粗灰分和水分的含量均無顯著差異。

2.2 西藍花莖葉混合原料發(fā)酵前后代謝物輪廓分析 圖1 為西藍花莖葉混合原料發(fā)酵前后代謝物的PCA 得分圖。正、負離子檢測模式下模型解釋率（R2X）分別為0.668 和0.686，滿足數(shù)據(jù)擬合要求。同時，發(fā)酵前后樣品獲得了有效分離。

2.3 發(fā)酵前后西藍花莖葉混合原料中差異代謝物的鑒定由表2 可知，西藍花莖葉混合原料發(fā)酵前后的顯著差異代謝物共有35 種，主要包括脂肪酸（有機酸）類、多糖及其衍生物類、核酸類、氨基酸（肽）類、維生素類及其他小分子活性物質。在脂肪酸（有機酸）方面，檸檬酸和異檸檬酸在發(fā)酵后降低（P<0.05），D-乳酸、亞油酸、α-亞麻酸含量提高（P<0.05）；糖類物質方面，2-酮基-葡萄糖酸和半乳糖酸的含量在發(fā)酵后增高（P<0.05），異鼠李糖和甘露庚糖醇含量降低（P<0.05）；核酸方面，黃嘌呤、5-甲硫腺苷和腺嘌呤核苷含量均下降（P<0.05）；氨基酸（肽）類方面，除谷氨酰-丙氨酸、脯氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-谷氨酸和亮氨酸-丙氨酸含量在發(fā)酵后顯著降低外，其余11 種肽類物質和組氨酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰-谷氨酸的含量均在發(fā)酵后顯著提高；維生素方面，L-抗壞血酸和硫胺素含量在發(fā)酵后提高（P<0.05）。此外，4-吡哆酸、三乙醇胺和薰衣草醇含量在經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵后降低（P<0.05），而γ-氨基丁酸含量提高（P<0.05）。

表1 發(fā)酵前后西藍花莖葉飼料中營養(yǎng)成分和活菌數(shù)含量

圖1 發(fā)酵西藍花莖葉樣品的PCA 分析

代謝途徑富集分析也表明，固態(tài)發(fā)酵對代謝途徑的影響主要集中在蛋白質降解、氨基酸合成、植物次生代謝以及維生素降解途徑等方面（圖2）。

2.4 發(fā)酵西藍花莖葉混合原料的活性產物分析 由表3可知，發(fā)酵西藍花樣品中總酸、酸溶蛋白和γ-氨基丁酸含量均高于發(fā)酵前（P<0.05）；而發(fā)酵前后粗多糖含量無差異。

3 討 論

3.1 發(fā)酵西藍花莖葉混合原料常規(guī)營養(yǎng)成分分析 本研究中西藍花莖葉原料發(fā)酵后顏色加深至黃色，可能與其發(fā)酵過程中葉綠素逐漸被破壞有關[13]。田久東等[14]報道西藍花渣經(jīng)過3 d 固態(tài)發(fā)酵后，粗蛋白質含量提高15%，還原糖含量提高50%。但本研究中常規(guī)飼料成分在發(fā)酵前后無顯著差異，這可能與所用的菌種和發(fā)酵周期差異有關。本研究采用厭氧呼吸袋作為發(fā)酵介質，可制造較好的厭氧環(huán)境，也導致了發(fā)酵后營養(yǎng)成分與傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵存在差異[15]。本研究中接種前微生物數(shù)量較低可能與西藍花廢棄莖葉在處理過程中采用洗凈等加工工藝有關。乳酸菌和芽孢桿菌數(shù)量在發(fā)酵后仍較高，與前人結果一致[16]；而發(fā)酵后酵母菌數(shù)量較發(fā)酵初始有所降低，可能與其在較低pH 下生長受到抑制有關，從而進一步為乳酸菌的生長提供便利[17]。

3.2 固態(tài)發(fā)酵對西藍花莖葉飼料代謝物的影響 本研究中發(fā)酵前后樣品在PCA 分析中獲得了有效分離，說明兩組之間代謝存在差異[18]。差異代謝物鑒定進一步證實固態(tài)發(fā)酵處理可引起包括脂肪酸、多糖、核酸、氨基酸、維生素在內的多種代謝物的顯著改變，并與途徑富集分析的結果一致。代謝通路富集分析可依據(jù)代謝物的相關性對通路進行歸屬化，因而這些受影響的代謝途徑與西藍花固態(tài)發(fā)酵關系密切，為進一步研究固態(tài)發(fā)酵對其代謝物影響提供了線索。目前，利用代謝組技術分析固態(tài)發(fā)酵中代謝物變化的研究仍較少。孫杰等[8]通過GC-MS 代謝組手段分析了酵母液態(tài)、固態(tài)發(fā)酵過程中代謝物差異，發(fā)現(xiàn)蛋白質和氨基酸代謝是酵母生長過程中最為重要的差異代謝途徑，該結果與本研究結果類似。王越男等[19]在分析脫脂乳和發(fā)酵乳樣品的差異代謝物時也證實，共有16 種有機酸、20 種多肽、12 種氨基酸和8 種核酸代謝物含量發(fā)生顯著變化。程新等[11]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵受錳離子影響的主要途徑集中在糖及衍生物、脂肪酸及其衍生物和氨基酸三大類。本研究結果提示，糖類、脂肪酸和氨基酸代謝途徑可能也是西藍花莖葉固態(tài)發(fā)酵中受影響的主要代謝途徑。

表2 發(fā)酵前后西藍花莖葉混合原料中的差異代謝物及其相對積分含量

圖2 發(fā)酵前后西藍花莖葉混合原料中代謝途徑富集分析

表3 發(fā)酵西藍花莖葉樣品中活性代謝產物分析

就具體差異代謝物而言，不同代謝物的變化趨勢各不相同。本研究中，代表好氧途徑的三羧酸循環(huán)中的重要節(jié)點化合物（檸檬酸、異檸檬酸）含量在發(fā)酵后顯著降低，同時乳酸菌重要的代謝產物D-乳酸含量則顯著提高。上述代謝物的顯著變化表明在本試驗發(fā)酵條件下，厭氧發(fā)酵可能為微生物發(fā)酵后期的主要代謝模式。這與本研究發(fā)酵周期長達15 d，在發(fā)酵中后期，呼吸袋中氧氣被芽孢桿菌等好氧微生物耗盡有關[15]。同時，高濃度脂質好氧分解中間產物（亞麻酸、亞油酸）的顯著積累也反映發(fā)酵后期好氧代謝可能受到了抑制[8]，這與Frick 等[20]在酵母發(fā)酵中的報道一致。顯著提高的2-酮基-葡萄糖酸、半乳糖酸等糖酸類物質可在糖酵解途徑中發(fā)揮作用，為微生物的厭氧發(fā)酵提供能量，這與植物乳桿菌制備發(fā)酵乳的代謝方式一致[19]。黃嘌呤、甲硫腺苷和腺嘌呤核苷等核苷物質主要存在于細胞核內，參與胞內的DNA 合成和修復[21]。本研究中發(fā)酵后黃嘌呤、5-甲硫腺苷和腺嘌呤核苷含量顯著降低，可能與微生物破碎植物細胞分解代謝核苷物質有關。蛋白方面，本試驗發(fā)酵前后主要差異代謝物為二肽和游離氨基酸，這與在液態(tài)發(fā)酵乳制品方面的研究結果一致[22]。二肽和游離氨基酸的來源主要為微生物所分泌的蛋白酶對發(fā)酵物料的蛋白組分進行分解所致[23]。由于不同微生物對氨基酸的利用存在差異，間接導致了特定短肽和氨基酸含量的升高或降低；而短肽一般較易于被動物腸道吸收利用，且多具有提高動物免疫力、抵抗應激等特定的生物學功能，表明發(fā)酵可能提高了西藍花飼料的營養(yǎng)價值[24]。本研究結果表明，L-抗壞血酸、硫胺素等維生素含量在發(fā)酵后顯著提高，符合Patel 等[25]所提出的微生物可在發(fā)酵過程中參與微生物合成的觀點。此外，研究發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸在發(fā)酵后會有顯著提高[8]，表明微生物在次生代謝中參與了該類化合物的合成。范志勇等[26]報道，仔豬日糧中添加γ-氨基丁酸可有效改善豬生長性能，同時顯著促進體內生長激素和褪黑素的分泌。本研究結果也顯示，發(fā)酵后西藍花莖葉混合原料中γ-氨基丁酸含量顯著提高。本試驗結果可為進一步解析西藍花發(fā)酵飼料的飼喂效果提供依據(jù)。最后，有關4-吡哆酸、三乙醇胺和薰衣草醇等植物激素類前體物質在發(fā)酵后顯著降低的調控機制仍不明確，推測可能與本研究中涉及到復雜的多菌株聯(lián)合作用及代謝有關。如聶存喜等[27]曾在利用復合菌協(xié)同發(fā)酵棉籽粕的代謝組分析中發(fā)現(xiàn)了較為明顯的菌種發(fā)酵互作。后續(xù)通過開展單一菌種的發(fā)酵并繪制代謝路徑圖譜將有助于進一步解釋該類代謝物差異的原因。需要注意的是，代謝組學的結果更加傾向于對代謝輪廓的描述，本研究雖發(fā)現(xiàn)了大量小分子化合物在發(fā)酵前后具有顯著差異，但仍需進一步驗證這些化合物差異。

3.3 發(fā)酵西藍花莖葉飼料的品質分析 一般而言，發(fā)酵品質優(yōu)劣與飼料在發(fā)酵后的pH 有密切關系[28]。乳酸菌在發(fā)酵過程中可將發(fā)酵物料中的糖類轉換為乳酸，從而引起pH 和總酸含量的變化[29]。因而發(fā)酵西藍花莖葉中總酸含量的提高與乳酸菌在厭氧發(fā)酵后期的大量生長有關[16]。Liu 等[6]報道固態(tài)發(fā)酵西藍花莖葉中乙酸、丙酸和丁酸含量分別為5.5、0.033、0.008 g/kg，發(fā)酵后pH低于4.5。田久東[14]同樣采用玉米皮、麩皮、米糠粕等輔料和西藍花渣進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)物料pH 降至4.5 以下，物料中乳酸菌含量可達108 以上。韋仕靜等[16]則在制備西藍花酵素的研究中報道發(fā)酵液pH 不斷降低至3.51。本研究進一步證實，發(fā)酵后西藍花莖葉飼料中的總酸、酸溶蛋白和γ-氨基丁酸含量顯著高于發(fā)酵前物料。酸溶蛋白含量是反映發(fā)酵后蛋白降解情況的指標，其含量越高表明蛋白分解越多[27]。本研究中酸溶蛋白含量的顯著提高可能與芽孢桿菌、乳酸菌在生長中所分泌的各種蛋白酶有關[23]。田久東等[14]曾報道發(fā)酵西藍花渣中的酸溶蛋白可較未發(fā)酵組提高150%以上，最高達到6.53%。而本研究中酸溶蛋白含量在發(fā)酵后西藍花莖葉中可達8.41%，這可能與發(fā)酵菌種和發(fā)酵周期不同有關，需要進一步驗證。最后，本研究中γ-氨基丁酸含量在代謝組和實際檢測后均有顯著提高，表明γ-氨基丁酸可作為一種潛在的標志物來分析發(fā)酵西藍花莖葉品質，而更多差異小分子代謝產物的定量驗證及其在動物生產中的作用還有待后續(xù)進一步研究探討。

4 結論

本研究結果表明，西藍花莖葉發(fā)酵前后共涉及35種差異代謝物且主要集中在蛋白質降解、氨基酸合成、植物次生代謝和維生素代謝等方面；發(fā)酵西藍花莖葉中總酸、酸溶蛋白和γ-氨基丁酸的含量均顯著增加，可能會提高其飼用品質。