敖漢細毛羊Noggin 基因質(zhì)粒的構(gòu)建及其在成纖維細胞中表達量的研究

榮 恒，張夢瑤，柳 楠，李 晶，賀建寧*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109；2.曲阜市畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務中心，山東濟寧 273100）

隨著人們生活水平的提高，對羊毛的需求量不斷增加，對羊毛產(chǎn)量、質(zhì)量的研究也顯得越來越重要[1]。羊毛是毛囊的衍生物，同時羊毛的產(chǎn)量和質(zhì)量取決于毛囊的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)[2]。因此，想要更好地控制羊毛的性狀發(fā)育特征，需要對毛囊發(fā)育規(guī)律和結(jié)構(gòu)特征進行研究[3]。Noggin基因在1992 年首次被發(fā)現(xiàn)，由Smith 等[4]從非洲爪蟾的胚胎中分離得到。McMahon 等[5]于1998 年發(fā)現(xiàn)Noggin 作為一種重要的胚胎蛋白，其在小鼠的節(jié)點、脊索和背側(cè)體節(jié)表達，并且發(fā)現(xiàn)它對神經(jīng)管的生長有重要作用。與此同時，Noggin基因在胚胎發(fā)育過程中對神經(jīng)有重要誘導作用，主要誘導外胚層的背側(cè)發(fā)育[6]。Noggin基因不僅在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還是骨骼發(fā)育[7]、卵巢發(fā)育[8]和心臟中隔形成[9]等過程的重要調(diào)控基因。Noggin 可與骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合，阻止其與相應受體結(jié)合，直接拮抗BMP4、BMP7、BNP2等基因，從而抑制BMP 信號通路[10]。資料顯示[11]，BMP基因家族在毛囊發(fā)育過程中起重要的抑制作用，如BMP2基因在毛囊生長的休止期表達量最高。而Noggin基因作為BMP 基因家族的抑制劑，在很多方面的功能作用都是基于抑制BMP 基因家族的活性從而對毛囊發(fā)育發(fā)揮間接的促進作用。其次Noggin作為抑制劑誘導次級毛囊發(fā)育[12]，如果Noggin基因缺失，可能出現(xiàn)光禿現(xiàn)象。

目前，關(guān)于Noggin基因的研究大多集中于調(diào)節(jié)腫瘤、癌癥等方面，與細毛羊毛囊有關(guān)的較少。而對于毛囊相關(guān)的基因研究，大部分僅在分子水平上對其功能進行了驗證。因此，本實驗對Noggin基因在細胞中的表達量進行研究，有助于進一步了解Noggin對羊毛產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取40 日齡的敖漢細毛羊健康胎羊（由青島畜牧所奧特種羊場提供）并及時消毒處理。

1.2 實驗試劑及儀器 TRIZol（Roche）試劑、蛋白裂解液、Nhel、Kpnl限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、T載體、pcDNA3.1 質(zhì)粒、DH5α感受態(tài)細胞、DMEM（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、胰蛋白酶、標準胎牛血清、DPBS（磷酸緩沖鹽溶液）、Lipofectamine 2 000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、切膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、培養(yǎng)皿等均購自青島尚賽科貿(mào)有限公司。BB5060UV 型賀氏二氧化碳培養(yǎng)箱購于德國Eppendorf 公司，LG16-W 高速微量離心機、Leica DMIRB 型倒置顯微鏡購于青島鑫恒一有限公司，BSW-1360V 垂直潔凈工作臺購于青島賽尚科技有限公司，Redbio CFX ConnectTM熒光定量PCR 系統(tǒng)購自Bio-Rad 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PCR 擴增 RNA 提取并反轉(zhuǎn)錄后，根據(jù)NCBI 收錄的綿羊Noggin基因組序列（登錄號為NM_00117411 0.1）CDS 區(qū)外側(cè)通過Primer 5.0 設計引物，并在上游引物和下游引物的5'末端分別添加NheI、KpnI限制性酶切位點及保護堿基（下劃線序列）。完成后的引物序列為：上游引物：5'-CTAGCTAGCACAGACCTTCTGCC TCACTACC-3'；下游引物：5'-CGGGTACCTTCACCG GACGATCCTTCT-3'。通過PCR 擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，體系為25 μL：DNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，Green Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5μL。

1.3.2 TA 克隆 DNA 通過瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，T載體連接體系為：T4 DNA 連接酶1 μL，T4 DNA 連接酶Buffer 1 μL，T 載體2 μL，目的片段6 μL；混勻置于26℃金屬浴中2 h 后4℃過夜，將10 μL T 連接液加入到100 μL DH5α感受態(tài)細胞中，混勻后冰上靜置15 min；42℃熱激90 s 后重新冰上靜置20 min；加入800 μL LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含AMP 抗生素）37℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)1 h，離心后去除上清，吹打混勻細胞，將細胞涂布在含AMP 抗生素的平板上，在37℃條件下培養(yǎng)12 h，然后挑單菌搖菌后測序。

1.3.3Noggin基因與pcDNA3.1 載體連接 利用Nhel、Kpnl限制性內(nèi)切酶對TA 克隆載體及pcDNA3.1 載體同時進行雙酶切，體系為：Nhel限制性內(nèi)切酶1 μL，Kpnl限制性內(nèi)切酶1 μL，TA 克隆載體和pcDNA3.1 10 μL，Buffer1 μL，補水至50 μL 體系；37 ℃ 3 h，通過瓊脂糖凝膠電泳對Noggin基因及切開的pcDNA3.1質(zhì)粒進行切膠回收，取5 μLNoggin基因液體，4 μL pcDNA3.1，加入到含有1 μL T4 DNA 連接酶及1 μL T4 DNA 連接酶Buffer 的PCR 管中22 ℃ 2 h，之后16℃反應3 h，最終轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細胞，選取搖菌后的單菌落對其進行陽性率測定，經(jīng)測序、質(zhì)粒提取獲得陽性質(zhì)粒。

1.3.4 成纖維細胞的培養(yǎng) 用75%酒精浸洗兩遍從羊場取回的40 日齡胎羊（自母羊妊娠后40 日齡的未出生羊）之后，在培養(yǎng)皿中用75% 的酒精再次清洗3 遍，最后用含有雙抗的PBS 反復清洗3 遍。之后用剪刀剪掉頭部和四肢，然后將軀干剪成1.5 mm3左右，將其放在培養(yǎng)皿，加胎牛血清，在CO2濃度為0.05、溫度37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，再加培養(yǎng)液。從培養(yǎng)箱取出24 h 后，用PBS 沖洗干凈，更換培養(yǎng)液，定時觀察。細胞生長到95%左右進行傳代培養(yǎng)。

1.3.5 細胞轉(zhuǎn)染 在傳代后2 代進行轉(zhuǎn)染。用Lipofecta mine 2 000 進行瞬時轉(zhuǎn)染，實驗組和對照組分別加20 μL脂質(zhì)體試劑和480 μL DMEM（不含雙抗），混勻，靜置10 min，在實驗組中加入40 μL 構(gòu)建好的表達載體和460 μL DMEM（不含雙抗），對照組僅加入500 μL DMEM，靜置20 min，然后將實驗組和對照組都移到培養(yǎng)皿中均加入4 mL DMEM，在37℃條件下，培養(yǎng)6 h后換液，之后培養(yǎng)36 h。

1.3.6 細胞轉(zhuǎn)染后的RT-PCR 擴大培養(yǎng)轉(zhuǎn)染成功的單細胞，細胞在培養(yǎng)皿底部長到95% 時，每個板加TRIZol（Roche）試劑3 mL，細胞裂解后進行RNA 提取。RNA 提取完成后，測定濃度和純度符合標準后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過Primer Premier 5.0 軟件設計Noggin和GAPDH基因的引物序列見表1。實時熒光定量PCR 反應程序：95℃預變性7 min；95℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸30 s，共45 個循環(huán)。樣品各進行3 次重復，采用Ct（2－ΔΔCt）值法計算Noggin相對于內(nèi)參基因GAPDH的表達量。利用SPSS17.0 軟件中t檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。

表1 引物信息

1.3.7 細胞轉(zhuǎn)染后Western Blot 檢測Noggin基因蛋白表達 利用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）將樣品分為實驗組和對照組，每組3 個生物學重復。先裂解提取細胞中的蛋白質(zhì)，內(nèi)參基因GAPDH、目的基因Noggin分別點3 個膠孔，電泳后對蛋白質(zhì)進行PVDF 轉(zhuǎn)膜，用轉(zhuǎn)膜電泳槽進行2～3 h，之后封閉蛋白質(zhì)2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；按1:2 000 的比例對一抗進行稀釋，在4℃冰箱用一抗孵育PVDF 膜12 h；用TBST 洗膜3次，每次5 min。按1:2 000 的比例稀釋二抗，孵育1.5 h；在暗室中曝光。用Image J 軟件分析條帶，結(jié)果用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1Noggin目的基因擴增 圖1 為PCR 后凝膠電泳分析結(jié)果（2%瓊脂糖凝膠），結(jié)果顯示擴增條帶單一明亮，大小位于699 bp 處，與已知大小一致。

圖1 Noggin 基因PCR 擴增

2.2 克隆載體的提取 對pGM-T-Noggin進行提取，結(jié)果如圖2 所示，pGM-T 載體大小為3 015 bp、目的基因大小為699 bp，連接后條帶位于3 714 bp 處，與已知大小相符，表明克隆載體連接并提取成功。

圖2 克隆載體的鑒定

2.3 TA 克隆測序比對 圖3 為測序后比對結(jié)果，堿基沒有發(fā)生突變，可用于后續(xù)實驗。

2.4 克隆載體、pcDNA3.1 表達載體雙酶切 圖4 為雙酶切結(jié)果，目的基因為699 bp，pGM-T 為3 015 bp，表達載體pcDNA3.1 為5 427 bp。圖4 所示條帶與以上數(shù)據(jù)相符合，酶切成功。

2.5 表達載體pcDNA3.1 構(gòu)建及鑒定 菌液PCR 結(jié)果如圖5 所示，在699 bp 位置處有明亮清晰且單一的條帶，證明pcDNA3.1-Noggin構(gòu)建成功。

2.6 細胞培養(yǎng) 細胞生長觀察結(jié)果如圖6 所示，其中原代培養(yǎng)細胞為梭形、圓形，此外還有一些游離組織；傳代培養(yǎng)細胞全部為成纖維細胞，形態(tài)上為梭形。

2.7 實時熒光定量PCR 檢測mRNA 的表達 從轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞中提取RNA 后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板對目的基因Noggin和內(nèi)參基因GAPDH片段同時進行PCR 擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖7 所示，擴增的條帶單一明亮，GAPDH產(chǎn)物大小為125 bp、Noggin產(chǎn)物大小為128 bp，與已知大小均相同，可繼續(xù)實時熒光定量PCR 實驗。

圖8 為實時熒光定量擴增曲線和熔解曲線，曲線清晰且只有一個峰值，表明在實時熒光定量PCR 過程中無二聚體且得到了特異性的擴增產(chǎn)物，可用來進行定量分析。利用SPSS 對2 組mRNA 的表達量進行測定和分析，結(jié)果如圖9 所示，轉(zhuǎn)染組極顯著高于未轉(zhuǎn)染組（P<0.01）。

2.8 Westren Blot 檢測蛋白的表達 由圖10 可知，轉(zhuǎn)染的實驗組條帶明顯比未轉(zhuǎn)染的對照組粗，由Image J 軟件分析灰度值，灰度值用SPSS 分析。由圖11 可知，轉(zhuǎn)染組Noggin 表達量極顯著高于未轉(zhuǎn)染的對照組，表明質(zhì)粒pcDNA3.1-Noggin能高效表達Noggin基因。

3 討 論

關(guān)于毛囊的研究以往主要集中在出生后和成年綿羊身上[13]，Stenn 等[14]在成年綿羊身上對毛囊的周期性生長變化展開研究；近年來，柳楠等[15]在分子水平上研究了敖漢細毛羊羊毛性狀形成的機理；王小佳等[16]在分子水平上探究了羊毛的生長部位。由于大多數(shù)前人研究都集中在分子水平上，而在細胞水平上與毛囊生長發(fā)育相關(guān)的研究甚少。因此本實驗選擇在細胞水平上對Noggin基因功能進行驗證。

Noggin 作為一種重要的胚胎蛋白，對神經(jīng)管的生長具有重要作用，在胚胎發(fā)育過程中起神經(jīng)誘導作用，近年來發(fā)現(xiàn)它對多個系統(tǒng)有影響。范曉棠等[17]研究發(fā)現(xiàn)Noggin基因在大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中表達，也是骨骼發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)因子。BMPs 可以促進骨生長，增加骨量，可治療骨量減少所引起的疾病，例如骨折和骨質(zhì)疏松等，但如何控制BMPs 的量則需要Noggin等因子來調(diào)節(jié)。

圖3 TA 克隆測序比對

圖4 克隆載體及pcDNA3.1 載體雙酶切

圖5 表達載體pcDNA3.1 的鑒定-PCR 擴增

圖6 成纖維細胞原代、傳代培養(yǎng)

圖7 內(nèi)參基因GAPDH（A）目的基因Noggin 擴增產(chǎn)物(B)

圖8 Noggin 和GAPDH 熔解曲線峰值圖（A）和擴增曲線圖(B)

圖9 Noggin 基因mRNA 相對表達量

圖10 實驗組和對照組蛋白表達條帶

圖11 Noggin 蛋白相對表達量

1999 年，Botchkarev 等[18]研究發(fā)現(xiàn)有2 種擾亂毛囊誘導并引起脫發(fā)的途徑，BMP4 異位過表達和BMP抑制劑Noggin的靶向干擾。Noggin作為刺激HF 誘導的關(guān)鍵信號分子，主要通過2 種途徑發(fā)揮作用，一種是與BMP4 拮抗作用，另一種是下調(diào)75 KD 神經(jīng)營養(yǎng)因子受體。2002 年Botchkarev 提出了Noggin在雌性動物生產(chǎn)后 HF 生長期發(fā)揮作用。由他的研究可得知，無論是胚胎期還是出生后，Noggin都會中和BMP4 的抑制活性。在胚胎時期，Noggin就開始誘導HF[19]。Noggin對細胞內(nèi)的 BMP 信號起抑制作用，BMP 信號被抑制，LEF1 信號則會表達，繼而引起Wnt 信號的恢復。在這個循環(huán)過程中，毛囊干細胞中BMP 信號會隨著Noggin的變化而產(chǎn)生相應的變化，從而導致生長周期的啟動。因此，本實驗通過對目的基因Noggin的克隆，并構(gòu)建其表達載體。通過轉(zhuǎn)染實驗后對mRNA 及蛋白的表達量進行測定，結(jié)果表明，實驗組表達量均極顯著高于對照組。

4 結(jié) 論

本實驗通過對目的基因Noggin的TA 克隆，表達載體pcDNA3.1-Noggin的構(gòu)建，轉(zhuǎn)染成纖維細胞后進行實時熒光定量PCR 技術(shù)和Westren Blot 技術(shù)檢測Noggin基因在成纖維細胞中的表達，結(jié)果表明，實驗組均極顯著高于對照組，為今后Noggin功能的鑒定研究提供了基礎(chǔ)。