CPT1B 基因在靈山香雞上的時空表達(dá)規(guī)律研究

屠云潔 ，束婧婷，章 明，巨曉軍，劉一帆，單艷菊，姬改革，唐燕飛，蔣華蓮，鄒劍敏*

（1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇揚州 225125；2.廣西富鳳農(nóng)牧集團(tuán)有限公司，廣西南寧 530024）

肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1B（Carnitine Palmitoyl Transferase 1B，CPT1B）作為CPT1 的一種重要同工酶-肌肉型肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（MCPT1），其在調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪酸的氧化過程中起著重要作用[1-3]。以往關(guān)于CPT1B基因的研究多集中于哺乳動物，而禽類的能量代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)與哺乳動物存在諸多差異，因此有關(guān)哺乳動物[4-5]的研究結(jié)論可能并不適用于禽類。作者前期研究結(jié)果顯示，CPT1B基因在隱性白羽雞產(chǎn)蛋高峰期心臟、胸肌和腿肌的表達(dá)量顯著高于肝臟[5]，但不同發(fā)育階段表達(dá)量的變化趨勢未見報道。靈山香雞是從靈山縣地方優(yōu)良肉用土種雞中經(jīng)過多年選育而成的一種優(yōu)質(zhì)型肉雞品種，其肉嫩滑、雞味香濃，肌內(nèi)脂肪含量高。靈山香雞在廣西、廣東、海南及港澳地區(qū)廣受市場的青睞，競爭于南方高檔次肉雞消費市場[6-7]。為了更好地開發(fā)利用靈山香雞，本研究分析CPT1B基因在靈山香雞胸肌、腿肌、心臟和肝臟不同發(fā)育階段差異表達(dá)量，以揭示CPT1B在靈山香雞不同組織中和同一組織不同發(fā)育階段的差異表達(dá)量，為研究雞體內(nèi)脂肪代謝機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 靈山香雞種蛋來自廣西富鳳農(nóng)牧集團(tuán)有限公司，300 個靈山香雞種蛋在江蘇省家禽科學(xué)研究孵化，出雛，飼養(yǎng)。

1.2 樣品采集 每個發(fā)育階段采集靈山香雞商品雞10 個樣品，共采集11 個時間點：9、12、16 胚齡、1 日齡、1、3、5、7、10、13、16 周齡。屠宰后迅速采取腿肌、胸肌、心臟和肝臟樣本并投入液氮中，然后置于-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA 的提取以及cDNA 的合成 利用Trizol Reagent Kit 試劑盒提取腿肌、胸肌、心臟和肝臟RNA，cDNA第一鏈的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。以提取的總RNA 為模板，按照RT-PCR 試劑盒（TaKaRa，Dalian，China）說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：總 RNA 2 μL，OligodT20 1 μL，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）1 μL，RNA 酶抑制劑 1 μL，dNTP Mix（10 mmol/L）2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DEPC 水9 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃作用30 min，99℃反應(yīng)5 min。

1.4 引物設(shè)計 根據(jù)CTP1B和β-actin基因的mRNA 序列，利用Primer5.0 設(shè)計熒光定量PCR 引物，由上海生物工程（上海）股份有限公司合成。

雞CPT1B基因正反向引物序列為F：5'-TGCTGCT TCCAATTCGACG-3'，R：5'-TGCAGCGCGATCTGAA TG-3'；雞內(nèi)參基因β-actin 基因正反向引物序列為F：5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTAA-3'，R：5'-TGCGCATT TATGGGTTTTGTT-3′。

1.5 熒光定量PCR 反應(yīng)條件CPT1B：95 ℃預(yù)變性20～30 s，然后40 個循環(huán)的95 ℃變性20～30 s，退火55～60℃ 20～30 s，最后95℃變性10～15 s，60℃ 1 min，95℃ 10～15 s，連續(xù)測定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取熔解曲線。

β-actin：95℃ 預(yù)變性 20 s，然后40 個循環(huán)的95℃變性20～30 s，退火56～59℃ 20～30 s，最后95℃ 變性10～15 s，60℃ 1 min，95℃ 10～15 s，連續(xù)測定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取熔解曲線。

1.6 mRNA 定量數(shù)據(jù)分析 雞各組織樣本經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA 第一鏈后，分別利用CPT1B和β-actin基因各自優(yōu)化好的條件進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，每個樣品均做3個平行管，每次反應(yīng)均設(shè)無模板對照（NTC）。以β-actin基因為內(nèi)參照，對CPT1B基因mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行校正，并采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，其中△Ct=（Ct目的基因－ Ct 內(nèi)參基因），以1 個發(fā)育階段基因表達(dá)量為參照，如3 周齡△Ct 作為其他組織的參照，計算相對表達(dá)量 △△Ct，△△Ct=（△CtXgroup－△Ct 參照），以此來比較CPT1B基因表達(dá)量的倍數(shù)變化。

2 結(jié)果與分析

從圖1 可以看出，CPT1B在不同發(fā)育階段4 種組織中表達(dá)差異性不同。在胚胎期（9、12、16 胚齡）和1 日齡，CPT1B基因在肝臟的表達(dá)量顯著高于在心臟、胸肌和腿??；1、3 周齡時，CPT1B基因在4 種組織中的表達(dá)量差異不顯著，5、7、10、13 周齡時，CPT1B在胸肌的表達(dá)量顯著高于其他3 種組織，性成熟16 周齡時，CPT1B在腿肌的表達(dá)量顯著低于其他3 種組織，在胸肌、心臟、肝臟中的表達(dá)量差異不顯著。

CPT1B基因在4 種組織不同發(fā)育階段表達(dá)量的變化趨勢不一致。CPT1B在肝臟的胚胎期（9、12、16 胚齡）和1 日齡時的表達(dá)量雖有降低升高再降低的趨勢，但表達(dá)量差異不顯著，且顯著高于 1、3、5、7、10、13、16 周齡，且1～16 周齡的CPT1B表達(dá)量差異不顯著。

CPT1B基因在心臟、胸肌和腿肌的不同發(fā)育階段變化趨勢一致，但不同發(fā)育階段表達(dá)量變化顯著性不同。CPT1B出雛后在心臟、腿肌、胸肌的各個發(fā)育階段的表達(dá)量顯著高于胚胎期。CPT1B在心臟1 日齡時表達(dá)量顯著上升，1～10 周齡表達(dá)量變化不顯著，13、16 周齡的表達(dá)量顯著高于1、3、5、7、10 周齡。CPT1B在腿肌胚胎期和出雛后的表達(dá)量差異不顯著。CPT1B在胸肌從9 胚齡到10 周齡表達(dá)量逐漸升高，13 周齡時表達(dá)量顯著下降，且5、7、10、13、16 周齡極顯著高于1、3 周齡，1 日齡表達(dá)量顯著高于胚胎期。

圖1 CPT1B 基因在靈山香雞不同組織和不同發(fā)育階段的差異表達(dá)量

3 討 論

3.1CPT1B基因在不同組織中的差異表達(dá)量分析 大多數(shù)組織都有氧化脂肪酸的能力，肝臟和肌肉組織是脂肪酸β-氧化的主要場所。肌肉亞型（CPTlB）屬于CPTs家族中的一員，是脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵限速酶，對脂肪的分解供能具有重要的調(diào)控作用[8-10]。Tu 等[5]研究了包括CPT1B在內(nèi)的8 個雞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因在產(chǎn)蛋高峰期217 日齡隱性白羽公母雞中的差異表達(dá)，結(jié)果顯示CPT1B在公母雞心臟、胸肌、腿肌的表達(dá)量大于肝臟。本研究發(fā)現(xiàn)，CPT1B雖然屬于肌肉亞型CPT，但不是每個發(fā)育階段在肌肉組織中的表達(dá)量高于肝臟，且CPT1B在不同發(fā)育時間點的組織中表達(dá)量不同，在胚胎期和1 日齡時，CPT1B基因在肝臟的表達(dá)量最高，5～13 周齡CPT1B在胸肌的表達(dá)量最高。本實驗結(jié)果與前期研究結(jié)果[5]不一致，這可能與雞的日齡有關(guān)，不同發(fā)育階段所需的能量不同。胚胎期心臟、胸肌和腿肌發(fā)育比較緩慢，需要能量較少，在肝臟氧化產(chǎn)生的能量主要供自身利用；但出雛后，1、3 周齡時，心臟、胸肌和腿肌發(fā)育迅速，需要由肝臟為心臟、胸肌和腿肌提供更多的能量，5、7、10、13 周齡時，CPT1B在胸肌的表達(dá)量顯著高于其他3 種組織，可能是因為從5 周開始靈山香雞的胸肌迅速發(fā)育。不同發(fā)育階段4 種組織差異表達(dá)量結(jié)果表明，靈山香雞胚胎期，肝臟是CPT1B參與脂肪酸β-氧化的主要場所，出雛后到性成熟，胸肌是CPT1B參與脂肪酸β-氧化的主要場所。

3.2CPT1B基因在4 種組織不同發(fā)育階段的差異表達(dá)量分析 本研究中，CPT1B基因在4 種組織不同發(fā)育階段變化趨勢不一致，其中CPT1B在肝臟的胚胎期和1日齡時的表達(dá)量顯著高于 1、3、5、7、10、13、16 周齡，呈顯著下降趨勢，這可能與肝臟在脂肪代謝中的功能有關(guān)。肝臟是動物脂肪代謝的主要部位，肝細(xì)胞液中的脂肪酸以及肌肉和其他組織細(xì)胞攝取的脂肪酸借助CPT-Ⅰ被轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)，經(jīng)β-氧化后生成乙酰CoA，肝臟中生成的乙酰CoA 除經(jīng)三羧酸循環(huán)產(chǎn)生ATP 供自身利用外，更多的是轉(zhuǎn)化為酮體運輸?shù)侥X等肝外組織氧化利用[4]。胚胎期和1 日齡時胸肌、腿肌和心臟發(fā)育比較緩慢，需要能量較少，所以CPT1B在胚胎期和1 日齡時在肝臟表達(dá)量明顯高于其他時期，出雛后由于胸肌、腿肌和心臟等組織迅速發(fā)育需要由肝臟提供更多的能量，所以在肝臟的表達(dá)量顯著下降。

CPT1B在心臟1 日齡～16 周齡的表達(dá)量顯著高于胚胎期，這可能由于出雛后心臟活動量加大，需要更多能量，CPT1B在心臟參與的脂肪酸β-氧化增強(qiáng)，為心臟提供更多能量。

CPT1B在腿肌的胚胎期到出雛后的各個發(fā)育階段的表達(dá)量變化趨勢比較平緩，1 日齡～16 周齡的表達(dá)顯著高于胚胎期。CPT1B在胸肌胚胎期到出雛后的多個發(fā)育階段的表達(dá)量持續(xù)顯著性上升。CPT1B在胸肌和腿肌不同發(fā)育階段表達(dá)量不同，這可能由于胸肌和腿肌的肌纖維發(fā)育快慢不同，胚胎期肌纖維發(fā)育低于出雛后[11-12]。靈山香雞作為一個優(yōu)質(zhì)肉雞品種，出雛后胸肌逐漸發(fā)育，胸肌肌內(nèi)脂肪含量和腹脂沉積會逐漸增加[13]。CPT1B在調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪酸的氧化過程中起著重要作用，CPT1B基因是催化脂肪酸線粒體β-氧化的限速酶，影響體內(nèi)脂肪的分布，與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[14]。本實驗中CPT1B在胸肌的表達(dá)量顯著升高，推測CPT1B在脂質(zhì)代謝過程中起到正調(diào)控作用，后續(xù)將進(jìn)一步進(jìn)行CPT1B基因功能驗證。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，CPT1B在不同發(fā)育階段4 種組織相對表達(dá)量不同，在胚胎期，CPT1B基因在肝臟的表達(dá)量最高，5、7、10、13 周齡時，CPT1B在胸肌的表達(dá)量最高。CPT1B基因在4 種組織不同發(fā)育階段變化趨勢不一致，CPT1B在肝臟的胚胎期到性成熟時表達(dá)量呈下降趨勢，而CPT1B在腿肌、胸肌和心臟的表達(dá)量呈上升趨勢，在胸肌的表達(dá)量上升趨勢最顯著。靈山香雞胚胎期，肝臟是CPT1B參與脂肪酸β-氧化的主要場所，出雛后到性成熟，胸肌是CPT1B參與脂肪酸β-氧化的主要場所。