長(zhǎng)白山野雜豬和東北民豬背最長(zhǎng)肌的mRNA轉(zhuǎn)錄組比較分析

金太花，婁安鋼，季久秀，李鐘淑，關(guān)立增*

（1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276005；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002）

長(zhǎng)白山野豬作為我國(guó)特有的豬種資源，具有瘦肉率高、不飽和脂肪酸含量高和抗病力強(qiáng)等特性，但野豬肉具有肉質(zhì)堅(jiān)硬、土腥味大等缺點(diǎn)[1-2]。東北民豬雖然具有生長(zhǎng)速度快的優(yōu)勢(shì)，但其瘦肉率和不飽和脂肪酸含量低等肉質(zhì)缺點(diǎn)已不能滿足消費(fèi)者日益增長(zhǎng)的需求[3]。因此，利用長(zhǎng)白山野豬與東北民豬雜交制備長(zhǎng)白山野雜豬正成為改良家豬生產(chǎn)性能與肉品質(zhì)的主要方法之一。長(zhǎng)白山野雜豬具有肉質(zhì)柔軟鮮嫩、纖維較細(xì)、肉色好、脂肪入口即化等特點(diǎn)，也克服了野豬肉質(zhì)堅(jiān)硬、土腥味大的特性與家豬肉中亞油酸含量低等弊端[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)白山野雜豬肉中的不飽和脂肪酸（C14:1、C16:1、C18:1T、C18:1C、C20:1N9）含量顯著高于東北民豬[4]。但關(guān)于長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬肉質(zhì)性狀差異形成的分子機(jī)理還不清楚，有待進(jìn)一步研究。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，與肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，這對(duì)動(dòng)物肉質(zhì)性狀的研究起到了巨大推動(dòng)作用，其中在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)影響肉質(zhì)性狀基因的研究，可揭示影響肉質(zhì)性狀的分子機(jī)理[5-7]。目前關(guān)于豬肉質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄組的研究已有一定進(jìn)展。如Wu 等[8]在分析金華豬和長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌的全基因表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，金華豬中與脂肪酸生物合成調(diào)節(jié)有關(guān)的基因表達(dá)水平高于長(zhǎng)白豬。Yu 等[9]對(duì)藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌中與脂肪酸組成有關(guān)的候選基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在2 個(gè)豬種之間差異表達(dá)的基因有586 個(gè)，其中在藍(lán)塘豬中高表達(dá)的基因有267個(gè)，13 個(gè)基因被確定為肌肉脂肪酸組成的候選基因。Corominas 等[10]分析了長(zhǎng)白豬×伊比利亞豬雜交豬與長(zhǎng)白豬回交豬的背部肌內(nèi)脂肪酸的組成，結(jié)果顯示，在2 個(gè)豬種之間共篩選到的候選基因有396 個(gè)，其中在高肌內(nèi)飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸群體中有247 個(gè)基因表達(dá)較高，而在高多不飽和脂肪酸群體中有149 個(gè)基因表達(dá)較高。Anna 等[11]對(duì)伊比利亞豬與長(zhǎng)白豬回交所得到豬中有極端表型群體的背最長(zhǎng)肌的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān)的差異基因有18 個(gè)。而目前關(guān)于長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬背最長(zhǎng)肌基因的mRNA轉(zhuǎn)錄組分析還未見(jiàn)報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。本研究將通過(guò)RNA-Seq 技術(shù)對(duì)長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬背最長(zhǎng)肌基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄組差異進(jìn)行分析，為揭示長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬的肉質(zhì)性狀差異機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3 頭F1代長(zhǎng)白山野雜豬和3 頭東北民豬，其中F1代雜交豬是由長(zhǎng)白山野豬和東北民豬雜交得到（野豬♂× 東北民豬♀），3 頭長(zhǎng)白山野雜豬均為同父；3 頭東北民豬為同母。所有實(shí)驗(yàn)豬均飼養(yǎng)于延邊金村長(zhǎng)野生動(dòng)物養(yǎng)殖專業(yè)農(nóng)場(chǎng)。生長(zhǎng)前期圈養(yǎng)，每日飼喂3 次，生長(zhǎng)后期放養(yǎng)，每日飼喂2 次，自由采食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)期間按照特種野豬場(chǎng)正常的免疫程序進(jìn)行免疫，分別飼喂至120 kg 左右進(jìn)行屠宰。

1.1.2 采樣 宰前將長(zhǎng)白山野雜豬和東北民豬趕入待宰圈，禁食不禁水24 h。電麻后倒掛放血、褪毛，屠宰后，取左半胴體背最長(zhǎng)肌并分割成0.5 cm3左右小組織塊裝入凍存管，立即放于液氮中，用于RNA-seq 分析。

1.1.3 試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；RNA Extraction Kits 試劑盒、RNA-seq 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Illumina 公司。

1.2 背最長(zhǎng)肌總RNA 的提取 背最長(zhǎng)肌組織中的RNA提取主要按ExRNA Extraction Kits 試劑盒步驟進(jìn)行。

1.3 mRNA 的高通量測(cè)序

1.3.1 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建 根據(jù)RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行總RNA 的反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)兩步法進(jìn)行cDNA 雙鏈的合成并進(jìn)行純化，將純化的cDNA 進(jìn)行末端修復(fù)后依次進(jìn)行末端dA 加尾和接頭連接反應(yīng)，然后進(jìn)行連接產(chǎn)物的純化，將純化的連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得cDNA 文庫(kù)，最后將獲得的cDNA 文庫(kù)通過(guò)LC 公司的Illumina 測(cè)序平臺(tái)完成mRNA 高通量測(cè)序。

1.3.2 cDNA 文庫(kù)的RNA-seq 測(cè)序與質(zhì)量控制 通過(guò)Illumina 公司的High-seq 測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)獲得的上述樣品進(jìn)行雙末端測(cè)序。測(cè)序流程為：總RNA →利用Oligo(dT)富集mRNA 和去除rRNA 富集mRNA →mRNA 打斷成200 nt →隨機(jī)引物六聚體合成cDNA →末端修復(fù)、加dA 和加接頭后PCR 擴(kuò)增→Illumina 測(cè)序。將測(cè)序得到的原始序列（raw reads）中帶有接頭的、含有poly-N 和低質(zhì)量的序列去掉，以便獲得干凈序列（clean reads）。最后用Q20 與Q30 方法分析堿基測(cè)序錯(cuò)誤率，以此來(lái)分析測(cè)序質(zhì)量的高低。

1.3.3 測(cè)序序列比對(duì)分析與表達(dá)水平確定 利用TopHat和Bowtie 軟件參照豬基因組序列對(duì)長(zhǎng)白山野雜豬和東北民豬背最長(zhǎng)肌組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)與注釋。采用 HTSeq0.5.3 軟件計(jì)算比對(duì)到基因組上轉(zhuǎn)錄本的序列（reads） 數(shù)，確定基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.4 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的鑒定 本研究利用DEGSeq R package v1.10.1 系統(tǒng)對(duì)長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。利用Cufflinks vl.3.0 程序包對(duì)來(lái)自于TopHat 的數(shù)據(jù)的己知轉(zhuǎn)錄本及新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。

1.3.5 GO 和KEGG 富集分析 利用GOseq R 軟件包對(duì)差異基因進(jìn)行GO 富集分析。利用KOBAS 軟件對(duì)差異基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法對(duì)長(zhǎng)白山野雜豬和東北民豬之間的差異表達(dá) mRNA 進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制 分析顯示，長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬的Q20 值都達(dá)到96% 以上，Q30 值都達(dá)到91% 以上。隨后對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤率分布和GC 含量分布進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，測(cè)序過(guò)程中堿基錯(cuò)誤率均低于0.5%，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量較高。通過(guò)過(guò)濾得到的干凈序列在長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬2 個(gè)文庫(kù)數(shù)據(jù)量均大于20 G，說(shuō)明獲得的干凈序列可用于隨后的轉(zhuǎn)錄組分析。

2.2 測(cè)序序列比對(duì) 將過(guò)濾后得到的干凈序列采用Tophat 軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示，在長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬中均有100% 以上的序列能完全比對(duì)到豬基因組上，而所轉(zhuǎn)錄的基因占總基因的比例在3 頭長(zhǎng)白山野雜豬中平均為59.67%（分別是58.88%、59.37%、60.75%），在3 頭東北民豬為58.73%（分別是57.88%、58.80%、59.51%），而在不同個(gè)體間SNP位點(diǎn)數(shù)達(dá)到14 299～19 671。

2.3 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平分析 分析顯示，在長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬2 個(gè)品種中共有17 171 個(gè)基因表達(dá)，東北民豬中有16 552 個(gè)基因表達(dá)，長(zhǎng)白山野雜豬中有16 461 個(gè)基因表達(dá)。其中有15 842 個(gè)基因在長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬中進(jìn)行了共表達(dá)（圖1）。其中在東北民豬中特異表達(dá)的基因有710 個(gè)，在長(zhǎng)白山野雜豬中特異表達(dá)的基因有619 個(gè)。對(duì)長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬中的基因數(shù)目進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在2 個(gè)品種豬中約有15% 的基因?yàn)楦哓S度表達(dá)；約有25% 的基因?yàn)橹胸S度表達(dá)；約55%的基因?yàn)榈拓S度表達(dá)。

2.4 差異表達(dá)基因分析 分析顯示，在長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬背最長(zhǎng)肌中一共檢測(cè)到153個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中在長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬中顯著高豐度差異表達(dá)的前10 個(gè)基因中，PDLIM3（ENSSSCG00000015796）基因在長(zhǎng)白山野雜豬和東北民豬中的豐度均為最高（圖1、圖2）。相對(duì)于東北民豬，在長(zhǎng)白山野雜豬中有55個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，98 個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因。表1 分別列出了前10 個(gè)顯著差異表達(dá)的上調(diào)及下調(diào)基因，其中一些基因與肉品質(zhì)有密切關(guān)系，如SCD 基因與機(jī)體內(nèi)不飽和脂肪酸生成有關(guān)。

圖1 長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬2 個(gè)豬種中差異表達(dá)基因散點(diǎn)圖

圖2 在長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬中高豐度表達(dá)的前10 個(gè)差異表達(dá)基因

2.5 差異表達(dá)基因的GO 分析 分析發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬背最長(zhǎng)肌中，153 個(gè)差異表達(dá)基因被注釋到了33 條GO 條目中。其中注釋到生物學(xué)過(guò)程中的有11 條，注釋到細(xì)胞組分的有11 條，注釋到分子功能中的有11 條（圖3）。

2.6 差異基因的KEGG 分析 分析顯示，153 個(gè)差異表達(dá)基因與130 條通路有關(guān)，每條通路中含有從1 到10 不等的差異基因，本文列出了富集程度排名前20 的pathway 條目（圖4）。

3 討 論

相對(duì)于傳統(tǒng)芯片技術(shù)而言，RNA-seq 測(cè)序可快速獲得某一組織細(xì)胞幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本，不需要探針的預(yù)先設(shè)計(jì)，因此對(duì)任何物種及任何細(xì)胞來(lái)源的轉(zhuǎn)錄組都可進(jìn)行檢測(cè)[12-14]，具有更精確的數(shù)字化信號(hào)、檢測(cè)通量高以及檢測(cè)范圍更廣等優(yōu)點(diǎn)[15-17]。該技術(shù)還可對(duì)未知轉(zhuǎn)錄本及稀有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序分析，因而是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強(qiáng)有力的工具[18-19]。本研究采用RNA-seq測(cè)序技術(shù)對(duì)長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬的背最長(zhǎng)肌的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，一些顯著生物通路和生物過(guò)程中（如脂肪代謝）的差異基因在長(zhǎng)白山野雜豬和東北民豬中表達(dá)差異較大，初步證明了這些差異基因可能與長(zhǎng)白山野雜豬和東北民豬背最長(zhǎng)肌肉質(zhì)性狀的差異有關(guān)。

本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為長(zhǎng)白山野雜豬和東北民豬，雖然各品種豬外界生長(zhǎng)環(huán)境一致，但為避免個(gè)體間差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，本研究對(duì)每個(gè)品種豬的3 頭豬樣本的文庫(kù)進(jìn)行了分別構(gòu)建并進(jìn)行單獨(dú)測(cè)序，以保證數(shù)據(jù)的獨(dú)特性，該方法相對(duì)于混合樣測(cè)定方法來(lái)說(shuō)準(zhǔn)確性更高[20]。本研究對(duì)長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬的轉(zhuǎn)錄組系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，2 個(gè)豬種之間基因表達(dá)數(shù)量存在差異，特別是不同個(gè)體間SNP 位點(diǎn)數(shù)達(dá)到14 299～19 671，說(shuō)明在不同個(gè)體及豬種之間基因的堿基組成上存在差異。該結(jié)果進(jìn)一步證明樣本的單獨(dú)測(cè)序分析法可靠性更高。

差異表達(dá)基因分析結(jié)果顯示，2 個(gè)品種豬存在著差異表達(dá)基因，如PDLIM3基因在長(zhǎng)白山野雜豬和東北民豬中的豐度均為最高，但該基因是否與肉質(zhì)性狀差異存在密切關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。前人研究表明，肌肉中的脂肪酸含量與肉質(zhì)性狀密切相關(guān)[8-9,21]。而本研究發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因SCD與機(jī)體內(nèi)不飽和脂肪酸生成有密切關(guān)系，但長(zhǎng)白山野雜豬和東北民豬的肉質(zhì)性狀差異是否與SCD基因調(diào)控不飽和脂肪酸含量有關(guān)還需要進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬背最長(zhǎng)肌之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO 功能分類和KEGG 通路富集分析，GO 分析結(jié)果顯示所有差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過(guò)程主要涉及有氧和活性氧代謝過(guò)程、模式分化過(guò)程和過(guò)氧化物代謝過(guò)程等；涉及的細(xì)胞組分主要有細(xì)胞頂部、MHCII 蛋白復(fù)合物等；涉及分子功能的主要有脂質(zhì)結(jié)合、維生素結(jié)合等。但這些成分中哪些與肉質(zhì)性狀相關(guān)還需要進(jìn)一步分析。而KEGG 分析結(jié)果顯示，153 個(gè)差異基因參與了130 個(gè)KEGG 基因信號(hào)通路，其中一些與脂肪代謝和骨骼肌發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)。其中在差異表達(dá)基因顯著富集的通路中，發(fā)現(xiàn)了一些與調(diào)節(jié)脂類代謝顯著相關(guān)的PPAR 信號(hào)通路和Fatty acid metabolism 途徑，根據(jù)該結(jié)果推斷在長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬的背最長(zhǎng)肌中脂類代謝的差異可能是由于PPAR信號(hào)通路和Fatty acid metabolism 通路中的一些相關(guān)基因表達(dá)水平的差異引起的，這與楊建敏的研究結(jié)果相似，即PPAR 信號(hào)通路是引起槐豬杜洛克豬脂類代謝的主要通路[22]。上述分析結(jié)果為進(jìn)一步篩選長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬肉質(zhì)性狀差異的主效功能基因提供參考。

表1 前20 位的顯著差異表達(dá)的基因（Y/H）

圖3 差異基因的GO 分析

圖4 富集程度排名前20 的pathway 條目分析

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在長(zhǎng)白山野雜豬與東北民豬背最長(zhǎng)肌中mRNA 表達(dá)存在差異，這些差異表達(dá)基因?qū)⑹菍?lái)研究2 個(gè)品種豬間肉質(zhì)差異的主要靶標(biāo)之一。