外泌體調(diào)控哺乳動物妊娠作用的研究進展

華仁武，雷明剛,2,3*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院、動物醫(yī)學院，湖北武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，湖北武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點實驗室，湖北武漢 430070）

外泌體是指細胞向胞外分泌并能介導細胞間交流的杯盤狀囊泡類小體[1-2]。最初于2006 年發(fā)現(xiàn)在女性血液中特異分離的胎盤外泌體在妊娠免疫中起重要作用[3]，于2007 年又發(fā)現(xiàn)外泌體可以攜帶生物信息（miRNA 和mRNA）來介導細胞間的交流[4]，外泌體的功能及其在妊娠過程中發(fā)揮的作用得到了初步探索。自此之后，在人[5]、鼠[6]、牛[7]、羊[8]、豬[9]中都發(fā)現(xiàn)了外泌體與妊娠相關，來源于胚胎[10]、胎盤[11]、子宮內(nèi)膜[12]等的外泌體可以介導母體-胚胎交流，并在妊娠過程中發(fā)揮著重要作用[13]。近年來，已經(jīng)有越來越多的學者開始關注外泌體在妊娠發(fā)生和發(fā)展過程中的作用及其機制。本文主要針對外泌體的特性及其在哺乳動物妊娠過程中的功能和調(diào)控機制進行綜述，提供更加全面的視角了解妊娠生理學及其病理學。

1 外泌體

1.1 特征 外泌體是細胞向胞外分泌的囊泡類小體，直徑為20～200 nm[1-2]，具有典型的脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)，密度為1.13～1.19 g/mL，有典型的“杯盤”形態(tài)[14-15]，存在于細胞培養(yǎng)上清液、血漿、血清、唾液、尿液、子宮液、羊水和惡性腹水以及其他生物體液中[16]。外泌體的功能是通過傳遞信息到其他細胞中來影響受體細胞[17]。

來源不同的外泌體有不同的結(jié)構(gòu)蛋白和脂質(zhì)并且攜帶著不同的分子貨物，最常見的外泌體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)主要包括四跨膜蛋白（如CD63、CD9 和CD81）、熱休克蛋白（如Hspa8、Hsp90）、GTP 酶（如EEF1A1、EEF2）、蛋白質(zhì)標記物（如Alix）[2]。脂質(zhì)膜是由膽固醇、甘油二酯、鞘脂、磷脂、甘油磷脂和聚甘油磷脂組成[18]。分子貨物主要包括mRNA、DNA、非編碼RNA等生物學信息[3-4,19]，其中miRNA 在對生殖軸和胚胎著床有重要影響[20]。

1.2 外泌體的釋放和吸收

1.2.1 外泌體的釋放 外泌體經(jīng)過一系列的過程從細胞內(nèi)釋放（圖1）。首先，使質(zhì)膜內(nèi)陷以形成早期內(nèi)體（Early Endosomes），其次將有效負載出芽到內(nèi)泌體膜中以形成多泡內(nèi)泌體，其中通過轉(zhuǎn)運所需內(nèi)體分選復合物（Endosomal Sorting Complexes Required For Transport，ESCRT）進行分選是分子有效負載填充至多泡內(nèi)泌體的機制[21]，晚期內(nèi)體（late endosomes）通過酸化成熟，最終其成熟后與質(zhì)膜的融合釋放外泌體[15]。

1.2.2 外泌體的吸收 外泌體作用受體細胞有融合、內(nèi)吞吸收、配體-受體反應和囊泡內(nèi)容物釋放4 種方式（圖2）[2]。

1.2.3 外泌體釋放調(diào)控 細胞受到外在刺激（如低氧、氧化應激、剪應力）會導致釋放的外泌體增加，細胞內(nèi)因子也會影響外泌體的釋放，其中包括細胞質(zhì)鈣離子的增加和細胞骨架的降解[22]。

圖1 外泌體的釋放（改編于文獻[16]）

圖2 外泌體的吸收（改編于文獻[2]）

2 外泌體對妊娠的影響

外泌體存在于人、小鼠、牛、羊、豬等哺乳動物的子宮中。在子宮內(nèi)，外泌體主要來源于子宮、胚胎和胎盤。來源不同的外泌體在哺乳動物的妊娠識別、胚胎附植、免疫調(diào)控、胚胎發(fā)育、分娩等過程發(fā)揮著不同的作用[13,16-17]。

2.1 外泌體對人妊娠的影響 在人上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜、早期胚胎、胎盤都可以釋放外泌體，進而影響妊娠過程。Ng[12]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜細胞外泌體miRNA 通路富集主要和胚胎附植相關，并且發(fā)現(xiàn)hsa-miR-200c、hsa-miR-17 和hsa-miR-106a 在外泌體中含量最高；Vilella 等[5]實驗證明，人子宮內(nèi)膜細胞釋放的外泌體包裹的Hsa-miR-30d 可以被小鼠胚胎吸收，能在胚胎附植期間影響胚胎的黏附。以上2 個實驗表明，子宮內(nèi)膜可以釋放包裹miRNA 的外泌體并被胚胎吸收進而來影響胚胎附植。另外，Giacomini 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，人胚胎體外培養(yǎng)液中的外泌體可以被母體吸收，這表明胚胎外泌體也可以傳遞到母體子宮內(nèi)膜中。

就胎盤外泌體而言，Salomon 等[23]發(fā)現(xiàn)血清中胎盤外泌體在妊娠第一期（最后經(jīng)期第1 天之后第3～12 周）、第二期（第12～24 周）和第三期（第24～40 周）濃度會逐漸升高，并且能促進內(nèi)皮細胞遷移；Hadley 等[24]發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細胞在氧化應激下可以促進外泌體的釋放，并且可以影響子宮肌層細胞和蛻膜化細胞炎癥因子分泌并激活其NFκB 通路。在妊娠中期羊水中的外泌體富含可調(diào)控免疫功能的熱休克蛋白HSC72[25]；胎盤外泌體可以調(diào)控母體免疫細胞并與免疫耐受相關[26-27]。在妊娠后期，胎盤的合體滋養(yǎng)層是外泌體的主要來源，合體滋養(yǎng)層可以釋放外泌體進入母體血液，構(gòu)建了一個重要的胎兒和母體之間的信號傳遞機制[28]。以上研究說明，胎盤外泌體在人妊娠過程中會不斷增加并與免疫調(diào)控和母體-胎兒的信息交流相關。

2.2 外泌體對小鼠妊娠的影響 已有研究運用小鼠模型進行外泌體體內(nèi)試驗來研究其在妊娠中的影響，試驗發(fā)現(xiàn)體外胚胎培養(yǎng)液的外泌體可以提高小鼠的胚胎附植率，并且增加小鼠囊胚細胞增殖能力，并減少細胞凋亡[29]；Sheller-Miller 等[30]運用小鼠模型，在小鼠妊娠16～17 d 時將熒光染色外泌體注射到子宮內(nèi)，發(fā)現(xiàn)外泌體可以被胚胎和母體吸收。該團隊將妊娠第18 天的母體血漿外泌體腹腔注射到妊娠第15 天的小鼠中可以增加小鼠早產(chǎn)率，表明外泌體可以介導與分娩相關的旁分泌信號并且誘導分娩[31]。以上體內(nèi)實驗表明外泌體在小鼠妊娠過程中可介導母體-胎兒的信息交流并調(diào)控其胚胎附植和分娩。

在體外實驗上，已經(jīng)證實胚胎可以通過外泌體與母體免疫系統(tǒng)交流[32]；細胞外囊泡中的miR-21 可以對受精卵和胚胎的發(fā)育有促進作用[33]；hnRNPC1 可以影響子宮內(nèi)膜細胞釋放外泌體中的miR-30d 的含量影響胚胎附植[6]。以上體外實驗表明外泌體可以影響鼠的免疫調(diào)控、胚胎發(fā)育和胚胎附植。

值得關注的是，Sheller-Miller 等[34]通過轉(zhuǎn)基因小鼠等技術表明來源于母體帶有熒光標記的外泌體可以穿過胎盤運送至胚胎組織并使其發(fā)生改變，且外泌體在懷孕期間可作為胎兒功能的生物標志物及藥物和其他貨物的載體，這項研究為體內(nèi)胚胎治療提供了一個新的有效途徑。

2.3 外泌體對牛妊娠的影響 在牛上，主要是通過提取子宮腔液和外周血外泌體進行測序以及進一步實驗來了解其功能和調(diào)控機制。Kusama 等[35]對妊娠17、20、22 d 的牛子宮腔液外泌體做蛋白組測序，后用其處理滋養(yǎng)層CT1 和子宮內(nèi)膜上皮細胞檢測mRNA 水平變化，發(fā)現(xiàn)外泌體處理子宮內(nèi)膜上皮細胞可以導致凋亡相關因子和黏附相關基因mRNA 表達水平發(fā)生變化；該團隊還針對妊娠15、17 d 與空懷15、17 d 蛋白組測序子宮腔液外泌體發(fā)現(xiàn)CAPG、AKR1BI 和IFNT 僅在妊娠期表達，推測該蛋白是由胚胎釋放到子宮腔液中，并推斷外泌體不僅來源于子宮內(nèi)膜同時也來源于胚胎[36]。從而可以得知，在牛妊娠早期，子宮腔液包含母體和胚胎釋放的外泌體，這些外泌體能夠影響子宮內(nèi)膜上皮細胞的mRNA 表達水平。

在外泌體調(diào)控機制的研究上，Zhao 等[7]對妊娠0 d 和60 d 的牛外周血外泌體做測序，篩選出BtamiRNA-499 在妊娠60 d 特異性高表達，它可以通過靶向Lin28B 進而調(diào)控NFκB 來影響相關炎癥因子（TNFα和IL-6 等）表達量的變化，進而影響妊娠。在牛體外研究上的結(jié)果表明，牛子宮內(nèi)膜釋放的外泌體可以增加體細胞核轉(zhuǎn)移囊胚的形成率和孵化率[37]，并且子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞在低氧應激下能促進外泌體的釋放[38]。以上表明，外在刺激可以影響外泌體的釋放，并且外泌體在牛妊娠過程中與免疫調(diào)控、胚胎發(fā)育相關。

2.4 外泌體對羊妊娠的影響 在羊上，已有研究將羊作為模型用于與外泌體相關的體內(nèi)試驗。Burns 等[39-40]發(fā)現(xiàn)，羊子宮分泌的外泌體可以在體內(nèi)被胚胎和子宮內(nèi)膜吸收；同時在體外也可以被子宮內(nèi)膜細胞和滋養(yǎng)層細胞吸收，并對妊娠14 d 和正常月經(jīng)第14 天的羊子宮腔液細胞外囊泡mRNA、miRNA 和蛋白組測序來分析早期妊娠中mRNA、miRNA 和蛋白質(zhì)表達量的變化。這些研究表明外泌體可以在胚胎-母體交流過程中傳遞mRNA、miRNA 和蛋白組等生物信息。該團隊還發(fā)現(xiàn)孕激素處理后可以提高子宮腔液中外泌體的釋放量，將孕激素處理后的子宮腔液外泌體做一個miRNA 測序，來研究孕激素對外泌體成分的影響[41]。Duckett 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，在羊妊娠中期血清中外泌體活力（用乙酰膽堿酯酶含量代表）會保持穩(wěn)定，但是在妊娠第133 天會降低。因此，外泌體的釋放可以受到孕激素的調(diào)控，并且血清中外泌體的含量在妊娠期間會發(fā)生變化。

在羊上，也發(fā)現(xiàn)外泌體與胚胎的發(fā)育相關。Cleys等[43]對血清、臍血清和胎盤外泌體樣本提取miRNA 進行測序，通路分析發(fā)現(xiàn)血清外泌體miRNA 靶向細胞生長和增殖以及器官發(fā)育通路；同時，臍血清和胎盤外泌體miRNA 靶向細胞、生物和胚胎發(fā)育信號通路。

值得關注的是，子宮內(nèi)膜釋放包含內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的外泌體，可以通過TLR 介導進而影響孕體IFNT的分泌，這是反芻動物妊娠識別的信號；同時外泌體影響滋養(yǎng)外胚層細胞的增殖[8]。這表明外泌體與早期妊娠識別信號相關。

2.5 外泌體對豬妊娠的影響 在豬上，已經(jīng)有研究分離出豬子宮腔液中的細胞外囊泡并分析其中miRNA 表達量的變化。Krawczynski 等[44]發(fā)現(xiàn)子宮腔液中細胞外囊泡中miR-125b 在妊娠14 d 和16 d 差異表達，并且miR-125b 在子宮內(nèi)膜上皮細胞中可以調(diào)控能影響胚胎發(fā)育和附植的重要基因的表達；Bidarimath 等[9]在豬母胎界面觀察到細胞外囊泡的存在，然后提取豬胚胎滋養(yǎng)層細胞和內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)液外泌體進行蛋白測序分析，并且觀察到2 類細胞可以吸收另一方釋放的外泌體。研究結(jié)果可以說明，在豬妊娠早期，外泌體可以攜帶miRNA 和蛋白質(zhì)來介導胚胎-母體的信息交流。

在體外實驗上，Bai 等[45]使用精液外泌體處理豬子宮內(nèi)膜上皮細胞，通過mRNA 測序，發(fā)現(xiàn)豬精液外泌體會誘導子宮內(nèi)膜上皮細胞免疫相關基因mRNA 水平的表達；Saadeldin 等[46]發(fā)現(xiàn)孤雌胚胎培養(yǎng)液的外泌體處理克隆胚胎會提高其發(fā)育能力。以上研究結(jié)果說明，精液外泌體可以影響子宮內(nèi)膜細胞，胚胎之間也可能通過外泌體進行信息傳導。

3 結(jié) 語

在近十幾年里，外泌體領域研究正在快速發(fā)展并在不斷探索其在生理上和病理上的功能。外泌體在妊娠過程中發(fā)揮著重要作用，在子宮內(nèi)，來源于胚胎、胎盤和母體子宮內(nèi)膜的外泌體可以通過傳遞蛋白質(zhì)、mRNA、非編碼RNA 等生物學信息給受體細胞進而影響妊娠。外泌體是一種胚胎和母體環(huán)境之間的直接和動態(tài)交流方式，它們可以釋放外泌體并能吸收另一方釋放的外泌體。但是，哪類外泌體在妊娠過程中發(fā)揮“主效作用”及其在子宮內(nèi)精確靶向機制依然有待研究。

外泌體在妊娠識別、胚胎附植、免疫調(diào)控、胚胎發(fā)育、分娩等過程中都發(fā)揮了重要的作用。在妊娠識別過程中，外泌體與早期妊娠識別信號相關，并且血清中胎盤外泌體的含量在妊娠過程中會發(fā)生變化。然而，是否可以通過精確定量檢測外泌體及其內(nèi)容物含量對家畜的早期妊娠進行判斷并運用到生產(chǎn)實踐中，依然有待研究。在胚胎附植過程中，子宮內(nèi)膜以及體外培養(yǎng)的胚胎都可釋放外泌體來促進胚胎黏附，進而來影響胚胎附植。就免疫調(diào)控而言，胎盤外泌體可以通過激活NFκB 通路來影響母體炎癥因子的表達量，并且可以調(diào)控母體免疫細胞和促進免疫耐受。在胚胎發(fā)育過程中，子宮內(nèi)膜、孤雌胚胎和胎盤可以釋放外泌體來刺激體外胚胎的發(fā)育，并且外泌體可以作為小鼠胚胎的有效藥物載體；外泌體在未來有望成為其他大型哺乳動物胚胎的藥物或者其他貨物的載體進而對胚胎進行靶向給藥以及靶向補給。就分娩而言，外泌體可以作為分娩的旁分泌的介質(zhì)進而來誘導分娩?？偠灾?，外泌體對哺乳動物妊娠過程有著重要影響，進一步的研究可以更好地明確不同來源的外泌體在妊娠過程中的作用機理。