金花茶葉皂苷提取工藝優(yōu)化及抑制脂肪酶活性研究

陳嘉慧 - 吳雪輝 -

(華南農(nóng)業(yè)大學，廣東 廣州 510000)

金花茶(CamellianitidissimaChi)是山茶科山茶屬金花茶組植物，主要分布于中國廣西、廣東和越南北部，是茶花家族中唯一花瓣為金黃色的珍稀物種[1]，2010年被批準為國家新資源食品[2]。

金花茶葉富含皂苷、黃酮、多酚、多糖、氨基酸等多種生物活性成分，具有提高免疫力、降血脂血糖、抗癌防癌等重要保健功能[3]。廣西壯族民間有飲用金花茶葉片習慣[4]，當?shù)卦S多資料亦有記載“金花茶葉為壯族民間藥，具有清熱解毒，降低膽固醇、預防腫瘤等功效”[5-6]。目前，對金花茶葉中黃酮、多酚、多糖的提取及抗氧化作用研究較多[7-9]，但未見對皂苷的提取和抑制脂肪酶的效果研究報道。據(jù)前人[10]研究報道，植物皂苷能有效抑制脂肪酶的活性，可以升高血清中高密度脂蛋白含量，降低膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白含量，對高血脂癥、心腦血管疾病以及動脈粥樣硬化的治療具有明顯效果。研究擬采用乙醇提取金花茶中的皂苷，探討其對胰脂肪酶的抑制作用，以期為金花茶葉資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

金花茶葉：摘自廣東省佛山市林業(yè)科學研究所金花茶示范林，經(jīng)佛山市林業(yè)科學研究所薛克娜教授級高級工程師鑒定為山茶科山茶屬植物金花茶的葉，選取無病蟲害，無腐爛、枯萎的金花茶葉于50 ℃烘干48 h后粉碎備用；

月桂酸4-硝基苯酯：>98.0%，上海麥克林生化科技有限公司；

人參皂苷Rg1：>98.0%，北京索萊寶科技有限公司；

豬胰脂肪酶：CAS#9001-62-1，上海源葉生物科技有限公司；

醋酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、香草醛：分析純，天津大茂化學試劑廠；

硫酸：分析純，廣州化學試劑廠；

乙醇、冰醋酸：分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

多功能粉碎機：BJ-150型，德清拜杰電器有限公司；

分析天平：CPA225D型，德國賽多利斯集團；

循環(huán)式真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州世紀雙科實驗儀器有限公司；

旋轉蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海榮亞生化儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV-5200型，上海元析儀器有限公司；

電熱鼓風干燥箱：101-2A型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金花茶葉皂苷的提取單因素試驗設計 稱取一定量的金花茶葉粉末，加入適量的乙醇溶液，在適宜的溫度下提取一定的時間，經(jīng)過濾或離心分離，收集提取液，測定其皂苷含量。

(1) 乙醇體積分數(shù)：適宜的金花茶葉粉末，分別用體積分數(shù)0%，20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液，按照料液比1∶50 (g/mL)，于70 ℃提取100 min。

(2) 料液比：在提取溫度70 ℃下，用體積分數(shù)60%的乙醇溶液分別按照料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)提取100 min。

(3) 提取溫度：金花茶葉粉末用體積分數(shù)60%的乙醇溶液，在料液比1∶40 (g/mL)下，分別于50，60，70，80，90 ℃提取100 min。

(4) 提取時間：一定量的金花茶葉粉末按照料液比1∶40 (g/mL)加入體積分數(shù)60%的乙醇溶液，在70 ℃下分別提取60，80，100，120，140 min。

1.2.2 響應面設計 在單因素試驗的基礎上，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度以及提取時間，以皂苷得率為評價指標進行四因素三水平中心組合試驗。

1.2.3 皂苷得率的測定 采用香草醛—硫酸分光光度法[11]，以人參皂苷Rg1為標樣進行測定。準確稱取0.005 4 g 人參皂苷Rg1標準品，溶解于純凈水中，配制成質量分數(shù)為0.216 mg/mL的標準溶液，精確移取0.0，0.1，0.2，0.4，0.5，0.7 mL標準溶液于比色管中，蒸干后加入8%香草醛—冰醋酸溶液0.5 mL、72%硫酸溶液5 mL，充分搖勻后于60 ℃恒溫水浴10 min，隨后立即用冰水冷卻10 min，搖勻，于540 nm處測吸光度。以人參皂苷Rg1吸光度為縱坐標(Y)，標準品質量為橫坐標(X，mg)繪制標準曲線如圖1，用最小二乘法作線性回歸，得到的方程為：Y=6.7X+0.006 2，相關系數(shù)R2=0.999。提取的金花茶葉皂苷溶液按照標準曲線的制作方法，測定吸光度，由回歸方程計算出皂苷含量，并按式(1)計算金花茶葉皂苷得率。

(1)

式中：

R——皂苷得率，%；

m——提取液中皂苷含量，mg；

M——樣品質量，g。

1.2.4 胰脂肪酶活性抑制率的測定 參照趙瑜等[12-14]的方法。取3 mL磷酸鹽緩沖溶液和0.08%月桂酸4-硝基苯酯溶液、1.0 mg/mL胰脂肪酶溶液、金花茶葉皂苷溶液各0.5 mL混合均勻，在適宜溫度下恒溫水浴一定時間后于410 nm處測吸光度為A。同時以不加皂苷溶液在410 nm處的吸光值為A1，加皂苷溶液，不加胰脂肪酶溶液在410 nm處的吸光值為A0。按式(2)計算胰脂肪酶抑制率。

(2)

式中：

C——抑制率，%；

A——樣品組吸光度值；

A1——空白組吸光度值；

A0——對照組吸光度值。

1.2.5 緩沖液pH對金花茶葉皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響 按1.2.4的方法，分別取pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0磷酸鹽緩沖溶液與1 mg/mL胰脂肪酶溶液、0.08%月桂酸4-硝基苯酯溶液和2 mg/mL金花茶葉皂苷溶液混合均勻，于37 ℃水浴30 min，測定胰脂肪酶的抑制率。

1.2.6 反應溫度對金花茶葉皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響 按1.2.4的方法，取pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液與1 mg/mL 胰脂肪酶溶液、0.08%月桂酸4-硝基苯酯溶液和2 mg/mL金花茶葉皂苷溶液混合，分別于27，32，37，42，47 ℃水浴30 min，測定胰脂肪酶的抑制率。

1.2.7 反應時間對金花茶葉皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響 按1.2.4的方法，取pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液與1 mg/mL 胰脂肪酶溶液、0.08%月桂酸4-硝基苯酯溶液和4 mg/mL金花茶葉皂苷溶液混合，分別于37 ℃水浴20，30，40，50，60 min，測定胰脂肪酶的抑制率。

1.2.8 金花茶葉皂苷濃度對胰脂肪酶抑制率的影響 按1.2.4的方法，分別取1，2，3，4，5，6 mg/mL金花茶葉皂苷溶液與pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液、1 mg/mL胰脂肪酶溶液、0.08%月桂酸4-硝基苯酯溶液混合，于37 ℃水浴30 min，測定胰脂肪酶的抑制率。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對金花茶葉皂苷得率的影響 由圖2 可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的變大，皂苷得率呈先上升后下降趨勢，當體積分數(shù)為60%時，皂苷得率最大。這是因為乙醇濃度過小時，體系中的溶劑極性較小利于親水性的蛋白質、多糖等物質溶出，直到溶劑極性與皂苷極性相似時達到最大得率，而乙醇濃度過大時，乙醇會使蛋白質變性凝固，阻止溶劑進入金花茶葉細胞內，影響皂苷的溶出[15]27-28。因此選擇60%為最佳乙醇體積分數(shù)。

圖2 乙醇體積分數(shù)對金花茶葉皂苷得率的影響

2.1.2 料液比對金花茶葉皂苷得率的影響 如圖3所示，隨著料液比的增加得率呈先上升后下降趨勢，當料液比在1∶40 (g/mL)時得率達到最大值。金花茶葉皂苷的提取屬于固液提取，濃度差是提取動力，因為隨著原料與乙醇溶液的接觸面積增大，金花茶葉粉末與溶劑充分接觸，物料與溶劑間濃度差增大，皂苷的傳質速率加快，促進皂苷的溶出，但料液比大于1∶40 (g/mL)時，溶劑的量太大，不利于溶劑與溶質之間充分循環(huán)交換[15]26-27?？紤]原料的充分利用、生產(chǎn)成本和能耗，料液比選1∶40 (g/mL)為適宜。

圖3 料液比對金花茶葉皂苷得率的影響

2.1.3 提取溫度對金花茶葉皂苷得率的影響 由圖4可知，隨著溫度的升高，得率先上升后下降，提取溫度在70 ℃時，金花茶葉皂苷得率達到最大值，因為隨著溫度升高，分子擴散運動加快，有助于皂苷的溶出。但是溫度超過70 ℃時，溫度過高，蒸氣壓上升[15]25-26，乙醇蒸發(fā)加快而冷凝不充分，導致提取瓶中乙醇濃度減少；甚至皂苷結構上含有—COOH和—OH，其在溶液中呈自然弱酸性，在溫度較高和含有醇溶液條件下會發(fā)生催化水解反應，水解后生成的皂苷元極性低，只可以溶于低極性溶劑，從而導致皂苷得率降低，這一結果與張正茂等[16]報道相似。因此70 ℃為最佳提取溫度。

圖4 取溫度對金花茶葉皂苷得率的影響

2.1.4 提取時間對金花茶葉皂苷得率的影響 由圖5可以看出，隨著時間的延長皂苷得率先增加再下降，超過120 min后皂苷得率下降。因為隨著時間的延長，皂苷的溶出率增加，但到達一定程度后，隨著提取時間的延長，雜質溶出，導致擴散系數(shù)降低，增大傳質阻力，阻止皂苷的溶出[17-18]，影響金花茶葉皂苷得率，所以選取提取時間為120 min為適宜。

圖5 提取時間對金花茶葉皂苷得率的影響

2.2 響應面優(yōu)化與分析

2.2.1 響應面優(yōu)化 以乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間為影響因素(見表1)，根據(jù)Box-Behnken原理設計四因素三水平中心組合試驗，試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計結果

表1 響應面試驗因素與水平表

采用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面試驗結果進行回歸擬合分析，從模型中刪除不顯著變量，優(yōu)化得到響應面方程為：

Y=4.61+0.17B-0.25C+0.27BC-1.03A2-0.31B2-0.18D2。

(3)

由表3可知，回歸模型顯著(P<0.000 1)，失擬項不顯著(P>0.05)，R2=0.928 6，CV=5.6%，說明置信度較好，表明該回歸模型值與試驗值擬合較好，誤差較小，能較好地反映影響因素與皂苷得率之間的關系，可解釋92.86%的響應值，因此可以用該模型對金花茶葉皂苷的得率進行分析和預測。各因素對皂苷得率的影響大小為提取溫度>料液比>乙醇體積分數(shù)>提取時間。一次項C及二次項A2、B2對皂苷得率影響極顯著(P<0.01)，一次項B、交互項BC與二次項D2對皂苷得率影響顯著(P<0.05)。

表3 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗?

2.2.2 響應面分析 各個因變量之間的交互作用對響應值——皂苷得率的響應面三維圖見圖6，其中料液比和提取溫度的交互作用響應面曲面坡度陡峭，說明對金花茶葉皂苷得率影響顯著。利用已建立的數(shù)學模型優(yōu)化出最優(yōu)條件為乙醇體積分數(shù)58.71%、料液比1∶38.69 (g/mL)、提取溫度60 ℃、提取時間123.94 min，考慮實際操作，修正工藝條件為乙醇體積分數(shù)59%、料液比1∶39 (g/mL)、提取溫度60 ℃、提取時間124 min，此條件下的金花茶葉皂苷含量為4.82%，與理論預測值4.838%相差較小，說明該模型可行，優(yōu)化結果可靠。

圖6 各因素對皂苷得率的交互作用

2.3 金花茶葉皂苷體外抑制胰脂肪酶能力

2.3.1 緩沖液pH對金花茶葉皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響 從圖7可以直觀看出，隨著pH的增大，金花茶葉皂苷對胰脂肪酶抑制率先增加后趨于平緩；在緩沖液pH為7.5時對胰脂肪酶抑制率有最佳效果，為52.44%。因為pH可以改變胰脂肪酶分子結構，在最適pH條件下，胰脂肪酶分子活性基團部位與最適底物結合，發(fā)揮出胰脂肪酶的最佳催化效果，pH偏高或偏低環(huán)境下，會改變胰脂肪酶分子的二級、三級構象，影響酶與底物結合效率，從而影響胰脂肪酶的活性，改變胰脂肪酶的抑制率[19]，所以選取pH 7.5為胰脂肪酶的最適pH。

圖7 緩沖液pH對胰脂肪酶抑制率的影響

2.3.2 反應溫度對金花茶葉皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響 由圖8可知，抑制率隨著溫度的升高先上升后下降，當溫度為37 ℃時對胰脂肪酶有最佳抑制作用，抑制率為51.28%。動物來源的酶的最適溫度一般為35～40 ℃，溫度若高于最適溫度，會破壞酶分子的構象[20]，此時酶的整體三維結構受到破壞，次級鍵崩解，酶失去活性，從而降低胰脂肪酶的抑制率。因此選取溫度37 ℃為胰脂肪酶最佳反應溫度。

圖8 反應溫度對胰脂肪酶抑制率的影響

2.3.3 反應時間對金花茶皂苷抑制胰脂肪酶能力的影響

從圖9可以看出，反應時間為20～40 min時，胰脂肪酶的抑制率隨著時間的遞增先上升后趨于平緩；40 min 后，胰脂肪酶的抑制率隨著時間的遞增呈下降趨勢。當皂苷與胰脂肪酶剛混合時，由于兩者結合不充分，抑制率較低，隨著時間的增加，二者結合逐漸充分，有效接觸增多，抑制率上升，反應時間>30 min時，金花茶葉皂苷與胰脂肪酶之間有效基團已充分接觸反應，相互作用趨于飽和，導致兩者的濃度減小，二者結合速率降低，反應時間進一步延長，胰脂肪酶的抑制率呈下降趨勢[21]，所以30 min為胰脂肪酶的最佳反應時間。

圖9 反應時間對胰脂肪酶抑制率的影響

2.3.4 金花茶葉皂苷濃度對胰脂肪酶抑制率的影響 由圖10可知，金花茶葉皂苷濃度為1～6 mg/mL時，胰脂肪酶的抑制率隨著金花茶葉皂苷濃度的增加呈兩個階段上升趨勢；1～4 mg/mL時，胰脂肪酶結合位點未飽和，胰脂肪酶的抑制率急劇升高；4～6 mg/mL時，胰脂肪酶和金花茶葉皂苷兩者充分相互接觸，結合位點達到飽和，故抑制率增加緩慢。皂苷濃度為6 mg/mL時，對胰脂肪酶的抑制率達到最大值為84.76%。

圖10 皂苷濃度對胰脂肪酶抑制率的影響

3 結論

通過單因素試驗，選擇適合的因素水平進行響應面優(yōu)化，研究了金花茶葉提取皂苷的最佳工藝條件，并對金花茶葉提取的皂苷進行抑制脂肪酶活性研究。試驗結果表明，金花茶葉皂苷最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)59%、料液比1∶39 (g/mL)、提取溫度60 ℃、提取時間124 min，此條件下的金花茶葉皂苷得率為4.82%；金花茶葉提取的皂苷對胰脂肪酶的抑制試驗表明，皂苷提取物在37 ℃、質量濃度在6 mg/mL、pH 7.5、反應30 min下，脂肪酶抑制率達到84.76%；并且金花茶葉皂苷濃度與胰脂肪酶的抑制作用呈劑量效應，濃度越高，抑制效果越佳，說明金花茶葉皂苷是一種良好的胰脂肪酶抑制劑，具有較好的降血脂應用前景。后續(xù)可以利用現(xiàn)代分析方法深入研究金花茶葉皂苷對胰脂肪酶的抑制機理。