不同濃度木瓜蛋白酶腔內(nèi)注射對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎造模成功率影響的實驗研究

胡忠申 馬曉博 敖日格勒 文振東 苗普達(dá)

(通遼市醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis,KOA)，是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡增加、軟骨細(xì)胞基質(zhì)減少、軟骨組織破壞及關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙或出現(xiàn)裂隙為特征的一種慢性、進(jìn)行性疾病[1-5]。其主要的特點是：軟骨退行性病變和骨質(zhì)增生，嚴(yán)重或累及軟骨下骨組織[6]。KOA多發(fā)于老年患者，且女性發(fā)病患者明顯多于男性[7]。臨床診斷以 X線攝片顯示關(guān)節(jié)間隙狹窄、關(guān)節(jié)疼痛，多以負(fù)重痛或者行走痛為主，患者多關(guān)節(jié)腫脹、畸形，關(guān)節(jié)腔有積液[8]。膝骨關(guān)節(jié)炎是世界范圍的一種老年多發(fā)性疾病，KOA發(fā)病率隨著人口老齡化而逐年上升，嚴(yán)重影響人類的健康。作為臨床上常見疾病，由于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展和加重的機制還未完全闡明，臨床上也缺乏相對有效的治療措施[9]。因此，通過建立有效、可靠的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎動物模型來研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制及防治具有十分重要的指導(dǎo)意義。骨關(guān)節(jié)炎動物模型的建立可以選擇不同的動物通過多種因素誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退變來實現(xiàn)或者使實驗動物自發(fā)[10-11]。本文通過木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，使用不同濃度藥物關(guān)節(jié)腔給藥，探討構(gòu)建SD大鼠KOA模型的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 用于造模的實驗動物

選用 10周齡的雌性SPF級 SD大鼠 35只，體重180～270g；許可證號：SCXK（遼）2015-0003；提供單位：遼寧長生生物技術(shù)有限公司 ；實驗室資質(zhì)編號：2016029。動物分別放于不同籠內(nèi)飼養(yǎng)，每日觀察大鼠活動是否異常并記錄體重、身長等變化。飼養(yǎng)動物所需的籠具及飲水瓶均由動物實驗中心的實驗室經(jīng)高壓滅菌后提供，飼養(yǎng)室 12 h明暗交替，溫度控制在(25±2)℃，濕度為50%～70%。所有實驗動物均為單籠飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，飼養(yǎng)及管理條件一致。本實驗方案經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)，倫理審查批準(zhǔn)編號:10/2019，所有動物實驗操作均按照內(nèi)蒙古民族大學(xué)實驗動物中心的操作指南和中華人民共和國《實驗動物管理條例》執(zhí)行。

1.2 實驗材料及試劑

戊巴比妥鈉（上海市國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；注射用生理鹽水（山西普興生化工程有限公司）；木瓜蛋白酶（P 4762美國 Sigma公司）；L-半胱氨酸（C 5360美國 Sigma公司）；10%中性緩沖福爾馬林固定液（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）；5%硝酸（上海君瑞生物技術(shù)有限公司）醫(yī)用手術(shù)套裝；無水乙醇（天津市風(fēng)船試劑科技有限公司）；二甲苯（山西普興生化工程有限公司）；蘇木精-伊紅染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；石蠟（德國 Leica公司）。

1.3 主要儀器

數(shù)字化X線成像系統(tǒng)（Digital Diagnost荷蘭PHILIPS公司）；生物組織脫水機（ASP 300 S德國 Leica公司）；生物組織包埋機（EG 1160德國Leica公司）；石蠟切片機（RM 2245德國 Leica公司）；HRS-22D組織染色機（武漢漢谷醫(yī)療科技有限公司）；OLYPUS生物顯微鏡；100μl微量注射器 （上海高鴿）；組織包埋盒（江蘇世泰實驗器材有限公司）；顯微鏡載玻片（海門市神鷹實驗器材廠）；DB066型足趾容積測量儀(北京汁鼠多寶生物科技有限公司)。

1.4 注射藥物的制備

分別稱取 2g、4g、8g的木瓜蛋白酶溶于3個盛有適量含0.03 mol/L L-半胱氨酸的緩沖液的量筒中，充分溶解后加PBS至100ml制成2%、4%、8%(w/v)木瓜蛋白酶混合溶液,靜置30min后，0.22μm濾膜過濾，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實驗動物分組及造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將大鼠隨機分為 2% 木瓜蛋白酶組10只、4% 木瓜蛋白酶組10只、8% 木瓜蛋白酶組10只和生理鹽水對照組5只。實驗開始的第1d、3d、5d分組行右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射。分組后將大鼠予濃度為 0.6% 的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為 30 mg/kg 。麻醉以后用動物剃毛器將大鼠右側(cè)后腿膝關(guān)節(jié)周圍皮膚表面毛發(fā)剔除并用聚維酮碘消毒，使用 100μl規(guī)格的注射器給每只 SD大鼠的右側(cè)膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腔注射 50μl配制藥物及生理鹽水，注射前左手拇指的指甲定位，然后讓注射器的針尖沿著自己的大拇指指甲順勢插進(jìn)指甲定位處，以腱外緣為進(jìn)針點，稍向內(nèi)下進(jìn)針，穿過關(guān)節(jié)囊后即感到有落空感，此時開始注入。注射完成以后在注射處及其周圍涂抹氯霉素軟膏，防止出現(xiàn)感染情況。建模前在大鼠后肢踝關(guān)節(jié)上方0.5cm處做出標(biāo)記，用足趾容積測量儀測量其容積，計算出其關(guān)節(jié)腫脹度，腫脹度(edema rate,ER)=(Vt-V0)/V0×100%。其中V0表示造模前的容積，Vt表示造模后的容積。造模期間持續(xù)觀察大鼠運動的改變，稱量并記錄體重，測量關(guān)節(jié)寬度有無改變。

1.6 獲取標(biāo)本并檢測

關(guān)節(jié)標(biāo)本的處理方法：所有大鼠首次注射后第10周用頸椎脫臼法處死，在造模膝關(guān)節(jié)外 0.3cm處用銳利器械切斷，整塊取出關(guān)節(jié)標(biāo)本。用 10% 甲醛固定48h，然后硝酸脫鈣液脫鈣 24h經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋制成石蠟標(biāo)本，將石蠟標(biāo)本切成5μm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟蒸餾水沖洗片刻后，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨染色、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)等軟骨成分各層分布情況。

2 實驗結(jié)果

2.1 動物一般情況及右膝關(guān)節(jié)寬度

實驗大鼠35只，建模時各濃度組分別死亡1只，最終進(jìn)入結(jié)果分析32只。造模組首次注射木瓜蛋白酶混合溶液24h后，大鼠表現(xiàn)出活動量減少，右膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，進(jìn)食和食量無明顯變化；第2次注射木瓜蛋白酶混合溶液后，大鼠活動明顯減少，出現(xiàn)跳步、跛行，但關(guān)節(jié)腫脹較第1次減輕；第3次注射木瓜蛋白酶混合溶液后，各造模組上述表現(xiàn)無明顯加重。而對照組大鼠 3次注射等量生理鹽水期間進(jìn)食和食量、活動情況、關(guān)節(jié)均未見明顯異常。

實驗結(jié)束時，使用 SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，各組體重間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。測量膝關(guān)節(jié)寬度結(jié)果表明，造模組大鼠右膝關(guān)節(jié)首次注射木瓜蛋白酶混合溶液 1周后出現(xiàn)明顯腫脹，各造模組右膝關(guān)節(jié)寬度均與對照組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；各造模組間右膝關(guān)節(jié)寬度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2 。

表1 各組實驗動物體重變化比較

表2 各組實驗動物右膝關(guān)節(jié)腫脹度比較

2.2 影像學(xué)結(jié)果

影像學(xué)常用于臨床上直觀的檢查關(guān)節(jié)病變，包括X線、MRI、關(guān)節(jié)鏡和UR等[12-13]。X線可評估關(guān)節(jié)的骨質(zhì)方面及關(guān)節(jié)間隙，是關(guān)節(jié)病變的常規(guī)檢査，但是不能區(qū)分軟組織的改變，無法提供早期的疾病影像學(xué)表現(xiàn)[14]。腹腔麻醉處死大鼠，大腿處進(jìn)行備皮，用手術(shù)剪從髖關(guān)節(jié)處剪取下大鼠兩個后肢，將大鼠左、右后肢分別以正、側(cè)位固定于紙板，用X射線機拍攝各組大鼠膝關(guān)節(jié)正、側(cè)位片。觀察膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙是否均勻一致，髕股關(guān)節(jié)間隙有無變窄；關(guān)節(jié)內(nèi)有無游離體；股骨髁、脛骨平臺關(guān)節(jié)面輪廓是否清晰、光整，有無骨質(zhì)增生、變尖，骨贅形成，骨密度是否均勻。

對照組膝關(guān)節(jié)正側(cè)位 X線攝片表現(xiàn)，見圖1A。由圖1A可見，對照組膝關(guān)節(jié)正側(cè)位片均未見明顯異常。髁間嵴有輕微增生，關(guān)節(jié)面較光滑、關(guān)節(jié)面輪廓清晰完整關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙一致，未見明顯狹窄。

實驗組膝關(guān)節(jié)正側(cè)位 X線攝片表現(xiàn)，見圖1B 。由圖1B可見，2%木瓜蛋白酶注射后，膝關(guān)節(jié)正側(cè)位片均見髁間嵴有輕微增生，關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙一致，未見明顯狹窄,骨性關(guān)節(jié)面較光滑、關(guān)節(jié)面輪廓清晰完整。圖1C 4%木瓜蛋白酶注射后，髁間嵴及脛骨內(nèi)側(cè)緣增生，關(guān)節(jié)面輪廓不光滑，關(guān)節(jié)間隙略顯變窄。圖1D 8%木瓜蛋白酶注射后，關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙不一致、有變窄，關(guān)節(jié)面不光整、髁間嵴變尖，關(guān)節(jié)軟骨高密度影。提示：關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶后，均出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。

圖1 各組膝關(guān)節(jié)X線圖片

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

在大鼠右膝關(guān)節(jié)上下 1cm處截取股骨髁和脛骨平臺，進(jìn)行大體觀察。由圖2可知，對照組圖2-A膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察未見明顯改變；圖2B 2%木瓜蛋白酶組關(guān)節(jié)軟骨光滑但有瑕疵，軟骨乳白色、透明度低；圖2C 4%木瓜蛋白酶組關(guān)節(jié)軟骨色澤變暗、不光滑，少數(shù)軟骨表面有缺失凹凸不平、呈灰白色；圖2D 8%木瓜蛋白酶組關(guān)節(jié)軟骨骨進(jìn)一步損傷，少數(shù)軟骨表面缺失、軟骨下骨外露，損傷明顯。

圖2 各組膝關(guān)節(jié)表面大體觀察

2.4 HE染色結(jié)果

正常軟骨細(xì)胞石蠟切片 HE染色，細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，粘液呈灰藍(lán)色。細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色[15-18]。

光鏡下對照組右膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，淺表層、中間層、輻射層及鈣化軟骨層4層結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞大小一致，排列規(guī)整，潮線完整（圖3A）,染色正常。2% 木瓜蛋白酶組右膝關(guān)節(jié)軟骨層明顯變薄，軟骨細(xì)胞變少，出現(xiàn)多重潮線（潮線復(fù)制），見圖 3B；4% 木瓜蛋白酶組右膝關(guān)節(jié)軟骨層厚度明顯變薄，軟骨細(xì)胞減少，體積大小不等，排列紊亂，并出現(xiàn)簇狀增生細(xì)胞團，出現(xiàn)多重潮線（圖3C）；8%木瓜蛋白酶組右膝關(guān)節(jié)軟骨四層正常結(jié)構(gòu)消失。大片軟骨層崩解、脫落及壞死，存留的軟骨細(xì)胞減少，大小不等，簇集現(xiàn)象明顯，排列紊亂，潮線模糊甚至消失（圖 3D）,圖片有明顯陷窩可見，提示軟骨細(xì)胞大量凋亡。

圖3 各組標(biāo)本HE染色結(jié)果

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎動物造?？煞譃閮纱箢怺19-20]：①自發(fā)性模型，實驗動物未經(jīng)過有意識的人為處理，在自然條件下所自發(fā)的，或者由于基因突變的異常表現(xiàn)通過遺傳育種保留下來的骨關(guān)節(jié)炎動物模型，如STRPort小鼠和Hartley豚鼠等；②誘發(fā)性模型，即通過各種實驗性的人為操作來誘導(dǎo)產(chǎn)生的動物模型如關(guān)節(jié)腔注射物質(zhì)，關(guān)節(jié)制動，關(guān)節(jié)內(nèi)、外手術(shù)或人工篩選等。采用關(guān)節(jié)腔注射物質(zhì)法制備OA模型，有實驗操作簡單、造模周期短、成功率高和造模方法適用于外用藥物治療等優(yōu)點。狗、兔、豚鼠、大鼠、小鼠等動物，膝關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶均可誘導(dǎo)成OA模型。大鼠的飼養(yǎng)條件要求簡單，實驗處理難度較低，常作為OA動物模型的首選動物。之前常見Wistar大鼠OA動物模型的報道,少有SD大鼠OA動物模型的報道，在研究有關(guān)藥物的藥理、毒理及藥效學(xué)研究中，SD大鼠模型更適用，同時結(jié)合高齡女性O(shè)A發(fā)病率高的特點，本實驗選用SD雌性大鼠，膝關(guān)節(jié)腔注射不同濃度木瓜蛋白酶和0.03mol/L的L-半胱氨酸混合液，誘導(dǎo)成不同損傷程度的OA動物模型，此模型軟骨生化指標(biāo)與OA患者一致，該模型更適用于OA治療藥物的藥理、毒理和藥效學(xué)等相關(guān)實驗研究。

有報道[21-22]稱，使用烏拉坦麻醉的動物作用時間較長，且濃度較高時動物易致死；水合氯醛和戊巴比妥鈉的麻醉時間比較符合本實驗中放射過程時長，但由于使用水合氯醛的動物麻醉時間并不穩(wěn)定，所以最終選擇 0.6%戊巴比妥鈉溶液作為輻射試驗麻醉藥，注射計量為 40 mg/kg。

木瓜蛋白酶是從木瓜乳中分離提取的凍干粉，是肽酶C1家族的一種半胱氨酸蛋白酶。其由單一多肽鏈組成，含有3個二硫鍵和1個酶活性所必需的巰基。木瓜蛋白酶可消化大部分蛋白底物，比胰蛋白酶范圍更廣。木瓜蛋白酶具有廣泛的特異性，可斷裂基礎(chǔ)氨基酸、亮氨酸或甘氨酸的肽鍵。它還能水解脂類和酰胺類化合物。木瓜蛋白酶更傾向于P2位置有大的疏水側(cè)鏈的氨基酸，它不接受P1'位置的纈氨酸[23]。

L-半胱氨酸可用于作為木瓜蛋白酶消化液的添加劑，是一種蛋白質(zhì)原性氨基酸，根據(jù)遺傳密碼與蛋白質(zhì)結(jié)合，硫分子側(cè)鏈參與細(xì)胞內(nèi)的各種氧化/還原反應(yīng)。側(cè)鏈參與β 鍵的形成，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)二級和三元結(jié)構(gòu)。半胱氨酸是細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（一種重要的抗氧化劑）的形成必不可少且有限制作用[24]，本實驗選用木瓜蛋白酶與0.03 mol/L L-半胱氨酸混合溶液以提高其活性。

4 結(jié)論

本研究通過對SD大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不同濃度木瓜蛋白酶混合溶液，觀察對比各組大鼠一般情況、膝關(guān)節(jié)寬度以及膝關(guān)節(jié)軟骨病理切片，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，得出以下結(jié)論：①膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶可構(gòu)建大鼠膝OA模型；②大鼠膝OA的病理嚴(yán)重程度隨木瓜蛋白酶的濃度加大而加重；③在大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射 2%、4%、8%(w/v)木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合溶液0.25 ml/kg可建立輕度、中度、重度的膝OA模型，周期短、可重復(fù)率高，且可用于中蒙藥大規(guī)模動物實驗，是相對理想的造模方法。