響應(yīng)面法優(yōu)化-高分辨質(zhì)譜鑒定瑪卡中蛋白

熊雅茹， 傅 紅， 楊 方

(1.福州大學生物科學與工程學院，福建福州 350108;2.福州海關(guān)技術(shù)中心，福建福州 350001;3.福建省檢驗檢疫技術(shù)研究重點實驗室，福建福州 350001 4.福州大學福建省海洋酶工程重點實驗室，福建福州 350108)

瑪卡(EpidiummeyeniiWalp)原產(chǎn)自秘魯，被稱為“秘魯人參”。2011年起成為我國的新資源食品[1]。有文獻報道，瑪卡具有抗疲勞和改善內(nèi)分泌等作用[2 - 4]，瑪卡中蛋白含量約為20%[5]，而蛋白質(zhì)是衡量食品營養(yǎng)價值的重要指標。瑪卡多肽是由瑪卡蛋白酶解后形成的片段，含有較大比例的寡肽和氨基酸，具有一定的營養(yǎng)價值和生理功能[6]，目前國內(nèi)外少有對瑪卡多肽活性與功能的研究。

目前，蛋白質(zhì)提取主要有溶液提取、酶法提取、超聲波輔助提取、雙水相萃取、反微團萃取等方法[7]。水溶液提取法是目前提取蛋白質(zhì)使用最廣的一種方法[8]，而響應(yīng)面分析法是一種非常有效的數(shù)學與統(tǒng)計方法相結(jié)合的數(shù)據(jù)分析手段。本文用堿提酸沉法提取瑪卡蛋白，先經(jīng)單因素實驗，以蛋白提取率為指標初步確定各因素的適宜水平，然后通過響應(yīng)面試驗對堿法提取工藝進行優(yōu)化，再通過多點測定蛋白等電點，最大程度提取瑪卡蛋白。胰蛋白酶、胃蛋白酶模擬消化酶解瑪卡蛋白，高分辨質(zhì)譜分析瑪卡多肽，Uniprot匹配其多肽序列與對應(yīng)生物來源、分子功能等，對進一步了解瑪卡多肽與功能的對應(yīng)關(guān)系具有積極意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DIONEX UltiMate 3000超高效液相色譜：美國Dionex公司產(chǎn)品；四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Q-Exactive)：美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；全自動定氮儀：Kjeltec 8400 Analyzer Unit；CR21N臺式冷凍離心機：日立公司產(chǎn)品；FreeZone?TriadTM2.5L冷凍干燥機：美國LABCONCO公司產(chǎn)品；UV-2700紫外-可見分光度計：日本島津儀器有限公司產(chǎn)品。

瑪卡：湖南省醫(yī)藥公司；Tris：生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶：2.5×105U/g，廈門泰京生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；三氯乙酸：分析純，國藥集團產(chǎn)品；C18固相萃取柱(500 mg/3mL)：美國Supelco公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 瑪卡蛋白含量及提取率的測定瑪卡原料的蛋白質(zhì)含量參照國家標準(GB/T 5009.5-2010)中的凱氏定氮法測定，考馬斯亮藍法測定堿液提取法上清液中蛋白質(zhì)含量。堿法提取蛋白得率為堿提上清液中蛋白質(zhì)含量與原料中蛋白質(zhì)含量的比值。

1.2.2 瑪卡中多肽的提取瑪卡原料粉粹過80目篩，按料液比1∶45(g∶mL)加入pH=10的Tris-HCl緩沖液，40 ℃水浴70 min，取出于4 ℃、18 000 r/min離心10 min，取上清液用0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)至有絮狀沉淀，再于4 ℃、18 000 r/min離心10 min，棄上清液取沉淀，-70 ℃預凍12 h后，-80 ℃真空冷凍干燥2 d，得瑪卡凍干蛋白[9]。分別取瑪卡凍干蛋白0.2 g溶于10 mL超純水中，以0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0～8.5，分別加入1.6×104U胰蛋白酶、胃蛋白酶于37 ℃、40 ℃水浴酶解4 h后，沸水浴10 min滅酶活[10]，4 ℃、18 000 r/min離心10 min，取上清液備用。C18固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化。取上清液3 mL過柱，用10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，45 ℃氮吹至近干，用1 mL 0.1%甲酸水溶液溶解，過0.45 μm濾膜，待測[11]。

1.2.3 儀器條件色譜條件：Hypersil GOLD UPLC C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈。洗脫梯度：0～50 min，10%～90%B；50～55 min，90%B；55～56 min，90%～10%B；56～60 min，10%B；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)：載氣為高純氮氣(純度>99.5%)，鞘氣流速40個單位(arb)，輔氣流速15個單位(arb)，吹掃氣流速0個單位；噴霧電壓3.2 kV；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛細管溫度320 ℃，離子透鏡電壓頻率(S-lens RF level)為60，輔氣熱源溫度350 ℃[12]。掃描模式：Full MS/dd-MS2，分析時長60 min，檢測方式：正離子，母離子掃描范圍：m/z100～1 500，一級質(zhì)譜分辨率：70 000 atm/z，AGG target:le6，一級Maximum IT:100 ms，掃描范圍數(shù):1，動態(tài)排除(Dynamic exclusion):40.0 s一次，MS2解離模式:HCD，隔離窗口:0.4m/z；二級質(zhì)譜分辨率：17 500 atm/z200，微掃描:1，二級Maximum IT:50 ms，碰撞能量:30 eV，欠填比:0.1%。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析采用MaxQuant(版1.6.1.0)進行數(shù)據(jù)分析。搜索針對包含來自Uniprot的瑪卡(uniprot-Brassicaceae.fasta)的661726種蛋白質(zhì)序列(https://www.uniprot.org，2018年10月28日下載)數(shù)據(jù)庫。蛋白FDR設(shè)置為0.01；最小氨基酸長度設(shè)置為3；可變修飾設(shè)為N-Acetyl和Oxidation(M)；固定化修飾設(shè)置為Carbamidomethyl(C)；酶的設(shè)置分別選擇非專一性和專一性，其中專一性酶分別設(shè)置為胰蛋白酶、胃蛋白酶；最大裂解丟失設(shè)置為2，所有常見的污染物和相反的命中被刪除[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件探討

實驗選取對蛋白提取率影響較為顯著的提取緩沖液濃度、提取時間、提取液的pH值、提取料液比、提取溫度5種因素進行了探討。其中，提取緩沖液濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 mol/L；提取時間分別為30、40、50、60和70 min；提取液pH值分別7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10；提取料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40和1∶45(g∶mL)；提取溫度分別為30、40、50、60和70 ℃。結(jié)果表明：一定范圍內(nèi)鹽溶液增加，蛋白質(zhì)分子表面電荷隨之增加，蛋白質(zhì)-水相互作用增強，促進蛋白溶解度增加，超出該范圍會破壞蛋白膠體性質(zhì)使其溶解度降低，故最佳提取緩沖液濃度為0.06 mol/L。隨著提取時間的增長，提取率先緩慢增加后降低，可能是蛋白質(zhì)的沉淀或分解導致的，70 min時有最大值35.96%。提取率隨時間變化的幅度非常平緩，影響不顯著，綜合考慮最優(yōu)提取時間40 min。pH=7.5～10.0內(nèi)，隨著pH增高，提取率以漸慢增長幅度隨之增大，pH=10.0時提取率達最大值35.26%，約為pH=7.5時的1.7倍，在pH=8.0后總體變化趨勢較平緩，考慮選取最佳提取pH=10.0。蛋白質(zhì)在特定溶液中溶解度一定，達到該提取料液比時，能溶解的蛋白全部溶出且剛好達到或仍未達飽和，此時增大提取液體積，提取率不再升高，反而給后續(xù)廢水處理造成麻煩[13]，故1∶40(g∶mL)為最佳提取料液比。30～40 ℃時，提取率隨溫度的升高顯著增大，之后增勢較緩，60 ℃時提取率達最大值36.64%，溫度升至70 ℃時，部分蛋白質(zhì)變性沉淀導致提取率降低，故最佳提取溫度為60 ℃。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實驗上述單因素實驗結(jié)果顯示出5個因素中對瑪卡蛋白提取率影響較為顯著的水平范圍，響應(yīng)面優(yōu)化試驗將結(jié)果突出的實驗水平重新組合，探究各因素間交互作用對結(jié)果的影響。選取對瑪卡蛋白提取影響較大的3個因素，提取液Tris-HCl濃度(A)、提取溫度(B)和提取料液比(C)3個因素建立3因素3水平的試驗，并得出瑪卡蛋白提取最佳工藝條件，響應(yīng)面試驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平

2.2.2 響應(yīng)面分析綜合單因素試驗結(jié)果，以蛋白提取率Y為響應(yīng)值，提取緩沖液濃度A，提取溫度B，提取料液比C三因素進行響應(yīng)面試驗，所得結(jié)果見表2?，斂ǖ鞍滋崛÷史秶?4.08%～45.63%，緩沖液濃度0.06 mol/L、提取溫度70 ℃、提取料液比為1∶45時所得瑪卡蛋白最多。利用Design-Expert 10數(shù)據(jù)處理軟件對表2所列瑪卡蛋白提取響應(yīng)面試驗結(jié)果進行二次效應(yīng)面回歸分析，所得擬合方程如下：

Y=34.61-0.69A+3.44B+4.66C-0.22AB+0.23AC-0.40BC+3.33A2+2.87B2-2.22C2

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸模型方差及可信度分析表

圖1反映了Tris-HCl濃度(A)、提取溫度(B)、提取料液比(C)3個因素之間的交互作用對瑪卡蛋白提取率的影響。響應(yīng)面能較直觀地體現(xiàn)其他條件固定時各交互項對提取率的影響，圖中曲線走勢越陡，該因素對提取率影響越大；走勢平滑，則影響較小。等高線的形狀反映兩因素交互作用的程度，橢圓形說明交互作用顯著，若為圓形則反之[16]。由圖1(A)可知，因素A及因素B的等高線形狀近似為圓形，表明其對蛋白提率無顯著交互作用，這與方差分析結(jié)果相一致。圖1(B)中可知因素C在相應(yīng)曲面上的坡度比因素A對應(yīng)的曲面更陡，說明對應(yīng)范圍內(nèi)的料液比對提取率的影響比Tris濃度更為顯著。而圖1(C)中在溫度高于60 ℃后，等高線越趨密集，說明隨著溫度升高，因素B對提取率的影響漸為顯著，因素B及C值增加對提率影響愈顯著。

圖1 Tris濃度(A)、提取溫度(B)和料液比(C)對瑪卡蛋白提取率的交互作用Fig.1 Interaction of Tris concentration(A),extraction temperature(B) and material-liquid ratio(C) on Maca protein extraction

2.2.3 響應(yīng)面驗證由Design-Expert根據(jù)建立的模型得到的優(yōu)化組合及單因素實驗結(jié)果可知，瑪卡蛋白最佳提取工藝條件為：Tris-HCl濃度0.04 mol/L，提取溫度70 ℃，pH=10.0，提取時間40 min，料液比1∶44.03(g∶mL)。根據(jù)實際情況調(diào)整為Tris-HCl濃度0.04 mol/L，提取溫度70 ℃，pH=10，提取時間40 min，料液比1∶45(g∶mL)，做3次平行試驗，蛋白提率為45.69%，與模型預測理論值46.49%接近。表明該回歸模型能較好的預測瑪卡蛋白提取率，得到的提取工藝參數(shù)科學可靠。

2.3 等電點測定結(jié)果

蛋白質(zhì)處于等電點狀態(tài)時會被凝集沉淀下來，此時蛋白沉淀量最高，因此多點測定堿法提取后上清液中蛋白等電點。分別取等量堿提后上清液，以0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH，沉淀后再次離心，考馬斯亮藍法測沉淀前后上清液中蛋白質(zhì)含量，上清液中蛋白質(zhì)殘留率最低時的pH值即為瑪卡蛋白等電點[17]。從表4可知，pH=2.0～3.0時，蛋白質(zhì)沉淀效果較佳。綜合數(shù)據(jù)，pH=2.5為瑪卡蛋白質(zhì)等電點。

表4 瑪卡蛋白等電點試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4 酶解條件優(yōu)化

常規(guī)的酶解反應(yīng)往往需要12 h以上，工作效率低，且易引發(fā)副反應(yīng)。從生理學上看，人體正常消化時間為4～6 h，且主要經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶作用[19]。鑒于此，本文分別考察了胰蛋白酶、胃蛋白酶的酶解條件，結(jié)果表明酶解時間為4 h時的效果較好。

2.5 肽段鑒定結(jié)果

瑪卡蛋白經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶分別酶解，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜3次重復檢測分析，Maxquant軟件處理液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)，胰蛋白酶、胃蛋白酶三次酶解后的共有肽段所得結(jié)果見表5、表6。

以胰蛋白酶酶解進行3次重復檢測獲得共鑒定14條共有肽段，其中找到生物來源的有4條。其中來源于BnaAnng34060D蛋白的LSANIDGLSR，具有脂肪酶活性，參與脂質(zhì)代謝過程；SAPIVSGVKKPHR來源于組蛋白H3，可與DNA結(jié)合，具有蛋白質(zhì)異二聚化活性。以胃蛋白酶酶解進行3次重復檢測獲得共鑒定19條共有肽段，能找到生物來源的有5條，多屬于酶類。ITLFDYYR來自于tRNA合成酶II類(D，K和N)家族蛋白，具有氨酰-tRNA連接酶活性，參與用于蛋白質(zhì)翻譯的tRNA氨?；^程；LFVSNGELK來自于谷胱甘肽水解酶2，具有催化活性，參與谷胱甘肽代謝途徑，是硫代謝的一部分；來自醛脫氫酶的VFGAVEASDLVK具有氧化還原酶活性，作用于供體的醛或氧代基團，NAD或NADP作為受體，參與細胞醛代謝過程；VGITKAAHQQR來自于生長素響應(yīng)因子，參與生長素激活信號通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物過程。

綜合數(shù)據(jù)，瑪卡多肽經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶分別酶解得到的序列不盡相同，但多肽均主要來源于油菜、甘藍等植物。所檢測的瑪卡多肽主要集中在6～13個氨基酸之間，最長的是來自Noccaeacaerulescens(高山扁豆)的SAPIVSGVKKPHR，但檢測的瑪卡多肽數(shù)量仍較少，且生物功能不顯著，后續(xù)可再進行研究探討。

表5 瑪卡胰蛋白酶3次酶解共有肽段

表6 瑪卡胃蛋白酶3次酶解共有肽段

3 結(jié)論

本文用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了瑪卡蛋白提取的最優(yōu)方案。進一步模擬消化過程，胰蛋白酶、胃蛋白酶分別單獨酶解瑪卡蛋白，UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，所得結(jié)果經(jīng)Uniprot搜庫匹配分析，共檢測出6條有明確生物來源以及分子功能的多肽，這些多肽多存在于同種屬的甘藍、擬南芥等植物中，分子功能與生物活性不一，但總體而言檢測到的多肽數(shù)量仍然較少，呈現(xiàn)的功能活性有限，推測是因為酶解瑪卡蛋白的最適酶是堿性蛋白酶而非模擬消化過程中的胰蛋白酶、胃蛋白酶。雖然瑪卡多肽曾被認為有較強的功效，但目前為止尚未有明確證據(jù)支持，而這也與我們的檢測結(jié)果相一致。目前采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究瑪卡多肽的報道較少，本文可為瑪卡多肽的研究提供新的思路和實驗基礎(chǔ)。