腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因LASS2/TMSG1全長及其截短體對人前列腺癌細胞生物功能的影響

劉浩云，裴 斐,2

前列腺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在歐美國家常年位居男性惡性腫瘤的發(fā)病率首位[1]。近年我國前列腺癌的發(fā)病率也呈明顯上升趨勢[2-3]。腫瘤轉(zhuǎn)移是多數(shù)癌癥患者死亡的最終原因。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因1(tumor metastasis suppressor gene1, TMSG1)[4-5]與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，又被稱為人源長壽保障基因2(homo sapiens longevity assurance homologue 2, LASS2)[6]以及神經(jīng)酰胺合成酶2(ceramide synthase 2, CerS2)[7]。LASS2/TMSG1定位于1q21.3，包含10個外顯子，基因全長2 029 bp。LASS2/TMSG1編碼一個含有380個氨基酸，相對分子質(zhì)量為4.5×104的蛋白。生物信息學分析LASS2/TMSG1主要由Homeobox(Hox)結(jié)構(gòu)域(71-128aa)以及TLC結(jié)構(gòu)域(131-332aa)構(gòu)成，其中Hox結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含一個核定位信號(119-128aa)。

本實驗旨在構(gòu)建LASS2/TMSG1基因全長質(zhì)粒以及3個結(jié)構(gòu)域缺失質(zhì)粒，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到人前列腺癌高轉(zhuǎn)移細胞系PC-3M-1E8中，以進一步探究LASS2/TMSG1基因中TLC結(jié)構(gòu)域、Hox結(jié)構(gòu)域以及Hox結(jié)構(gòu)域中的核定位信號序列對人前列腺癌細胞生物學功能的影響，并探討是LASS2/TMSG1基因中哪個結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浒l(fā)揮抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1 材料嘌呤霉素(Puromycin)購自美國Amresco公司；Polybrene(Hexadimethrine bromide Matrigel)購自北京普利智誠公司；DAPI染液購自北京索萊寶公司；Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG購自北京博奧森公司；Matrigel購自美國BD公司；FLAG M2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；Transwell-24膜嵌套(6.5 mm直徑，8.0 μm孔徑PC膜)購自美國Corning公司。

1.2 LASS2基因全長以及3個截短體引物設(shè)計使用GenBankΔ數(shù)據(jù)庫檢索基因cDNA序列，使用軟件Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計。

1.3 LASS2基因全長以及3個截短體質(zhì)粒構(gòu)建T1(Δ71-128)去除了Hox結(jié)構(gòu)域；T2(Δ128-332)去除TLC結(jié)構(gòu)域；T3(Δ118-128)去除了Hox結(jié)構(gòu)域中的核定位信號(圖1)。以LASS2-pcDNA3.0質(zhì)粒為模板，采用非依賴DNA聚合酶的連接方法(Exonuclease Ⅲ購自日本Takara公司)進行連接。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物回收后與載體(pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro)混合在Exonuclease Ⅲ反應(yīng)體系中4 ℃冰浴1 h，加入感受態(tài)細胞中轉(zhuǎn)化30 min，45 ℃熱激90 s，4 ℃冰浴2 min，將反應(yīng)產(chǎn)物涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃ 14～16 h，挑選單克隆并行菌液PCR檢測，檢測符合者送測序。

圖1 LASS2基因全長以及3個截短體序列示意圖

1.4 Western blot法將細胞用RIPA裂解液裂解后提取細胞總蛋白，進行12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，200 mA穩(wěn)流濕轉(zhuǎn)2 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗FLAG M2(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜；TBST洗脫3次，每次10 min；二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h；TBST洗脫3次，每次10 min；ECL發(fā)光液按照A液 ∶B液=1 ∶1的比例進行配置，化學發(fā)光儀檢測化學發(fā)光信號。

1.5 細胞免疫熒光實驗在6孔板底部放上多聚賴氨酸處理的玻片，將細胞接種于6孔板中，于孵育箱中培養(yǎng)，待細胞密度長至70%～80%時，PBS漂洗細胞2次，4%多聚甲醛室溫固定15 min；PBS洗滌細胞10 min；0.1%TritonX100室溫孵育10 min；PBS洗滌細胞3次，每次10 min；1%山羊血清室溫封閉1 h；一抗FLAG M2(1 ∶1 600)4 ℃孵育過夜；PBS洗滌細胞3次，每次10 min；二抗Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG(1 ∶500)室溫避光孵育1 h；PBS洗滌細胞3次，每次10 min；DAPI染核(1 ∶100)，室溫避光孵育10 min；PBS洗滌細胞10 min；90%甘油封片。實驗重復3次。

1.6 軟瓊脂集落形成實驗底層軟瓊脂配制：配制0.8%低熔點瓊脂糖并高壓滅菌，6孔板每孔按照體積比為：0.8%低熔點瓊脂糖 ∶2×DMEM ∶小牛血清=4.5 ∶4.5 ∶1的比例配制底層膠液體，6孔板每孔加入3 mL，每種細胞設(shè)置3個復孔，4 ℃放置30 min；上層膠用1.2%低熔點瓊脂糖，其余同底層膠。取150 μL細胞密度為1×104/mL的細胞懸液加入上層軟瓊脂液體中并混合均勻，6孔板每孔加入3 mL，4 ℃放置30 min；于孵育箱中培養(yǎng)21天；于倒置顯微鏡下進行細胞集落計數(shù)以及細胞集落直徑測量。實驗重復3次。

1.7 細胞劃痕修復實驗將細胞以每孔3×105個的數(shù)量接種于6孔板中，設(shè)置3個復孔，于孵育箱中培養(yǎng)48 h，待細胞單層生長鋪滿孔底，用10 μL無菌槍尖以直尺為標準在孔底進行劃痕，每孔等距離平行劃痕5道；PBS溶液清洗至無細胞碎片為止，每孔加入2 mL不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于孵育箱中培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察并采集每孔細胞在劃痕后0、9、18 h時的細胞圖像并計量遷移速率。實驗重復3次。

1.8 Transwell細胞侵襲實驗在Transwell小室的下室中加入30%小牛血清200 μL作為趨化因子，在Transwell小室的聚碳酸酯膜(PC膜)上加入50 μL的用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋的Matrigel(1 ∶7)，將整個24孔板放置于37 ℃培養(yǎng)箱中聚合30 min。將細胞以1×105的數(shù)量，總體積150 μL均勻地加入Transwell小室的上室，設(shè)置3個復孔，于孵育箱中培養(yǎng)48 h后吸去Transwell小室上室的多余液體，4%多聚甲醛室溫固定15 min；0.1%結(jié)晶紫溶液室溫染色15 min；PBS溶液洗去多余染液，倒置顯微鏡觀察并進行圖像采集。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LASS2基因全長以及3個截短體的人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8以LASS2/TMSG1-pcDNA3.0質(zhì)粒為模板，采用非依賴DNA連接酶的連接方法構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)，其中，T1截短體全長972 bp，T2截短體全長534 bp，T3截短體全長1 114 bp，LASS2全長1 143 bp(圖2A)。隨后，采用慢病毒感染人前列腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細胞系PC-3M-1E8(LASS2/TMSG1低表達)，并利用慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)所帶有的嘌呤霉素抗性基因進行篩選，得到穩(wěn)定細胞系后再采用Western blot法進行檢測，實驗結(jié)果顯示，LASS2/TMSG1全長蛋白分子質(zhì)量在(4.0～5.0)×104之間(實際分子質(zhì)量為4.5×104)，T1截短體蛋白分子質(zhì)量在(3.5～4.0)×104之間，T2截短體蛋白分子質(zhì)量在(1.5～2.5)×104之間，T3截短體蛋白分子質(zhì)量在(4.0～5.0)×104之間(圖2B)。與預(yù)測的分子質(zhì)量相符合：T1截短體蛋白分子質(zhì)量35.64×103，T2截短體蛋白分子質(zhì)量19.58×103，T3截短體蛋白分子質(zhì)量40.85×103。

圖2 A.菌液PCR技術(shù)檢測構(gòu)建的LASS2基因全長質(zhì)粒以及3個截短體質(zhì)粒；B.Western blot法檢測構(gòu)建的LASS2基因全長以及3個截短體質(zhì)粒所表達的蛋白

2.2 人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8中LASS2基因全長以及3個截短體蛋白的分布應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對LASS2基因全長以及3個截短體所表達的蛋白進行追蹤并利用激光共聚焦顯微鏡對結(jié)果進行觀察，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LASS2基因全長以及3個截短體的人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞中均可見蛋白大部分定位于細胞質(zhì)中(圖3)。

2.3 LASS2基因全長以及3個截短體對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8增殖能力的影響采用軟瓊脂集落形成實驗檢測LASS2基因全長以及3個截短體序列對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞非錨定依賴性生長能力的影響，結(jié)果顯示：Vector組集落數(shù)量遠大于LASS2基因全長組(P<0.001)以及T1組(P<0.001)和T3組(P<0.001)，T2組集落數(shù)量與Vector組相比差異無顯著性(圖4A、B)。Vector組集落直徑與LASS2基因全長組(P<0.001)以及T1組(P<0.001)、T2組(P<0.001)和T3組(P<0.001)組相比差異均有顯著性(圖4C)。

2.4 LASS2基因全長以及3個截短體對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞遷移能力的影響采用細胞劃痕修復實驗檢測LASS2基因全長以及3個截短體序列對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞遷移能力的影響，計算18 h后細胞的劃痕修復率，結(jié)果顯示，Vector組劃痕修復率與LASS2基因全長組(P<0.001)、T1組(P<0.001)、T2組(P<0.001)和T3組(P<0.001)組相比差異均有顯著性(圖5)。

2.5 LASS2基因全長以及3個截短體對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞侵襲能力的影響應(yīng)用Transwell細胞侵襲實驗檢測LASS2基因全長以及3個截短體序列對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，Vector組在細胞侵襲方面與LASS2基因全長組(P<0.001)、T1組(P<0.001)、T2組(P<0.001)和T3組(P<0.001)相比差異均有顯著性(圖6)。

3 討論

LASS2/TMSG1在抑制腫瘤遷移方面具有重要作用。有研究表明，LASS2/TMSG1在低轉(zhuǎn)移前列腺癌細胞系PC-3M-2B4中高表達，在高轉(zhuǎn)移前列腺癌細胞系PC-3M-1E8中低表達[8]。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)在高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞系MDA-MB-231中過表達LASS2/TMSG1可以抑制細胞增殖能力、非錨定依賴性生長能力以及細胞侵襲能力[9]。

LASS2/TMSG1是由北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學系腫瘤生物學研究室于1999年率先利用mRNA差異顯示技術(shù)首次克隆出來的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因[4-5]。生物信息學分析主要由Hox結(jié)構(gòu)域(71-128aa)以及TLC結(jié)構(gòu)域(131-332aa)構(gòu)成，其中Hox結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含一個核定位信號(119-128aa)。

現(xiàn)有研究表明神經(jīng)酰胺合成酶的催化活性位于TLC結(jié)構(gòu)域[10-11]。在所有的Lag同源體中Lag模體對于發(fā)揮酶活性是必須的[11]。

本組構(gòu)建的T2截短體就特異性的刪除了LASS2基因的TLC結(jié)構(gòu)域。根據(jù)實驗結(jié)果顯示，T2截短體對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞的影響具有雙重性。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了LASS2基因T2截短體序列的人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞的增殖、遷移、侵襲均受顯著抑制(P均<0.001)，在細胞凋亡方面以及非錨定依賴性生長方面并無明顯改變，但在錨定依賴性生長(P<0.001)方面卻顯著增強。其中涉及的具體機制可能并不只限于神經(jīng)酰胺所參與的信號通路，具體機制還有待分析。

圖3 免疫熒光技術(shù)檢測LASS2基因全長以及3個截短體基因序列所編碼的蛋白在人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8中的分布情況

圖4 A.軟瓊脂集落形成實驗檢測各穩(wěn)定細胞系非錨定依賴性生長能力；B.在軟瓊脂集落形成實驗中各穩(wěn)定細胞系形成的克隆數(shù)統(tǒng)計結(jié)果；C.在軟瓊脂集落形成實驗中各穩(wěn)定細胞系形成的克隆直徑統(tǒng)計結(jié)果；**P<0.05；***P<0.001；ns.差異無統(tǒng)計學意義

圖5 A.細胞劃痕修復實驗檢測各穩(wěn)定細胞系的細胞遷移能力；B.各穩(wěn)定細胞系18 h時的劃痕修復率；***P<0.001

圖6 A.Transwell細胞侵襲實驗檢測各穩(wěn)定細胞系的細胞侵襲能力；B.48 h細胞侵襲數(shù)；***P<0.001

本實驗構(gòu)建的T1截短體特異性的刪除LASS2基因的Hox結(jié)構(gòu)域，T3截短體特異性的刪除了LASS2基因Hox結(jié)構(gòu)域中的核定位信號。Hox結(jié)構(gòu)域在擁有Hox結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)酰胺合成酶中的確切作用還未確定，但是也沒有證據(jù)可以證明Hox結(jié)構(gòu)域在神經(jīng)酰胺合成酶家族中充當轉(zhuǎn)錄因子的作用。對于神經(jīng)酰胺合成酶中的Hox結(jié)構(gòu)域現(xiàn)有許多不同的觀點存在，但綜合這些觀點可以得知神經(jīng)酰胺合成酶中的Hox結(jié)構(gòu)域并不具備充當轉(zhuǎn)錄因子識別特異性序列的作用，而是可能擁有其他重要的作用，例如調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺合成酶的催化活性。以上論述也符合本實驗中觀察到的現(xiàn)象，在人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8以及人胚胎腎細胞HEK-293T中均可以見到LASS2基因全長序列以及3個截短體序列所編碼的蛋白質(zhì)大部分均定位于細胞質(zhì)中，并未進入細胞核中行使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。

細胞內(nèi)的微觀世界紛繁復雜，正常的各項人體生理活動涉及許多復雜且精密的代謝調(diào)控以及信號轉(zhuǎn)導，改變一個分子的表達或許涉及到許多我們還未發(fā)現(xiàn)的信號轉(zhuǎn)導通路以及代謝活動。本實驗結(jié)果顯示，LASS2基因T1截短體序列與LASS2基因全長序列相比，對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞具有更明顯的抑制作用，LASS2基因T2、T3截短體序列在對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞中則表現(xiàn)出了雙重性。這些現(xiàn)象的背后一定涉及了許多未知的調(diào)控機制，還有待我們在后續(xù)工作中進行深入探索。