NELL2a在斑馬魚(yú)神經(jīng)丘的表達(dá)及其突變模型構(gòu)建*

陳二方 邱陽(yáng) 王人鳳 劉珍珍 石力 查定軍 邱建華

NELL2(Nel -like type 2 molecule)，又稱尼爾樣2型分子，是一種神經(jīng)元特異性分泌蛋白，主要在大腦的海馬和皮層的神經(jīng)元中表達(dá)，其主要功能是促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化[1]。而在哈佛大學(xué)內(nèi)耳基因庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)NELL2在內(nèi)耳也有表達(dá)，本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)NELL2主要表達(dá)于耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[2]。此外，課題組在一個(gè)常染色體顯性遺傳性非綜合征型聽(tīng)神經(jīng)病譜系障礙(auditory neuropathy spectrum disorder，ANSD)家系中，通過(guò)全外顯子測(cè)序和基因連鎖分析，也發(fā)現(xiàn)了NELL2基因[3]，鑒定發(fā)現(xiàn)NELL2基因第45 097 607位堿基發(fā)生雜合突變，導(dǎo)致NELL2蛋白第457位氨基酸由半胱氨酸(Cys/C)突變?yōu)楸奖彼?Phe/F)。由此推測(cè)NELL2的C457F突變可能導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致NELL2保護(hù)神經(jīng)元的功能改變或喪失，最終誘導(dǎo)非綜合征型ANSD的發(fā)生。

為進(jìn)一步探討NELL2在非綜合征型ANSD發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[4]，初步嘗試構(gòu)建NELL2a基因敲除的斑馬魚(yú)模型，并比較NELL2a基因在AB野生型斑馬魚(yú)和基因敲除斑馬魚(yú)中的表型變化，為下一步闡明NELL2在聽(tīng)覺(jué)形成中的作用及ANSD的遺傳學(xué)檢測(cè)等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 AB品系野生型斑馬魚(yú)來(lái)自西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科全軍航空航天醫(yī)學(xué)內(nèi)耳研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，并在本實(shí)驗(yàn)室傳代；斑馬魚(yú)在28.5 ℃恒溫環(huán)境中生長(zhǎng)，光照時(shí)間：黑暗時(shí)間為14：10，胚胎用egg water培養(yǎng)，養(yǎng)殖方法按照《Zebrafish Book》(http://www.zfin.org)常規(guī)進(jìn)行。

1.1.2質(zhì)粒 Cas9 mRNA表達(dá)質(zhì)粒pGH-T7-zCas9[5, 6]，用來(lái)構(gòu)建gRNA表達(dá)質(zhì)粒的骨架載體gRNA-pMD19-T[7]，購(gòu)自武漢國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1整胚原位雜交 RNA探針制備：斑馬魚(yú)成魚(yú)剪尾鰭，用RNA提取試劑盒(RNeasy Micro kit,Qiagen, Cat No./ID: 74004)提取總RNA，然后用QuantiTect Rev. Transcription Kit(Qiagen，Cat No./ID: 205310)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的片段，克隆到體外轉(zhuǎn)錄載體pGEM-T Easy Vector(promega，cat.no.A1360)上。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得斑馬魚(yú)反義RNA探 針 ，用NucAwayTM Spin Column(invitrogen，AM10070)純化探針。收集斑馬魚(yú)胚胎，用4%多聚甲醛固定，雜交步驟參照文獻(xiàn)進(jìn)行[8]。

1.2.2gRNA靶位點(diǎn)引物設(shè)計(jì) 在CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)網(wǎng)站zifit(http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx)尋找符合以下要求的gRNA靶位點(diǎn)：①靶點(diǎn)位于翻譯起始密碼子ATG之后和基因編碼序列全長(zhǎng)2/3之前的區(qū)域，不要選擇5-UTR和3-UTR區(qū)域；②最好能破壞重要的結(jié)構(gòu)域或所有的轉(zhuǎn)錄本；③如果基因含有多個(gè)外顯子，可能在第一個(gè)起始密碼子的下游還存在額外的具有相同閱讀框的起始密碼子，故最好不要在第一個(gè)外顯子上選擇靶點(diǎn)，同時(shí)也要避免在最后一個(gè)外顯子上選擇靶點(diǎn)；④如果基因含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，最好在其共有外顯子區(qū)域選擇靶點(diǎn)；⑤靶點(diǎn)可設(shè)計(jì)在外顯子和內(nèi)含子的交界處，打靶破壞掉基因的剪接；⑥避免選擇含“TTTT”轉(zhuǎn)錄終止序列的靶點(diǎn)。

1.2.3gRNA模板合成 gRNA scaffold克隆到pMD 19-T vector (TakaRa; cat#D102A)(Amp-resistant)。gRNA 模板的合成通過(guò)PCR的方式獲得，設(shè)計(jì)引物如下Forward-Primer:TGTAATACGACTCACTATA-gGTCATGACTTCTGTG-GTTTTAGAGCT-AGAAATAGC，Reverse-Primer:AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACT。PCR體系(50 μl)配制如下: 5×PCR buffer 10 μl，質(zhì)粒DNA (50 ng/μl) 1 μl，F(xiàn)orward Primer (10 μM) 2 μl，Reverse-Primer (10 μM) 2 μl，Taq DNA Polymerases 1 μl，dNTP 4 μl，H2O 30 μl。PCR程序設(shè)置如下：①98 ℃ 5 mins；②98 ℃ 10，65 ℃ 15，68 ℃ 1 min，35 cycles；③72 ℃ 7 mins；④4 ℃ ∞；使用Fermentas GeneJETTMPCR Purification Kit對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.4體外轉(zhuǎn)錄合成gRNA和Cas9 mRNA ①制備gRNA: 用T7 RNA Polymerase (NEB; cat#M0251S)體外合成 gRNA；體外轉(zhuǎn)錄體系(20 μl)配制：2.5 mM NTP 4 μl，10× Reaction Buffer 2 μl，gRNA template 0.5～1 μg，T7 RNA Pol 2 μl，Nuclease-free water補(bǔ)足20 μl；37 ℃水浴孵育一個(gè)小時(shí)以上；用SigmaSpinTMSequencing Reaction Clean-Up(S5059-70EA)，對(duì)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行純化。②制備Cas9 mRNA：首先用XbaI (NEB; cat#R0145T)，對(duì)pGH-T7-zCas9質(zhì)粒進(jìn)行線性化，酶切體系如下：DNA (10 μg)，10×cutsmart，10 μl， XbaI 40 U, H2O補(bǔ)足100 μl；37 ℃，水浴放置3～5 h；然后用Fermentas GeneJETTMPCR Purification Kit，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收；體外轉(zhuǎn)錄體系(20 μl)配制：2×NTP/CAP 10 μl，10×Reaction Buffer 2 μl，linear template DNA 0.5～1 μg，Enzyme Mix 2 μl，Nuclease-free water補(bǔ)足20 μl；37 ℃水浴2～2.5 h；然后使用Ambion mMESSAGE mMACHINE kit，純化Cas 9 mRNA純化。

1.2.5顯微注射制備F0代斑馬魚(yú) 將gRNA、Cas9mRNA按照合適的濃度和10%酚紅混勻后，共同注射到單細(xì)胞期的野生型斑馬魚(yú)胚胎卵黃囊中。每顆受精卵注射量為1～2 nl，留取適量同批未注射的胚胎作為對(duì)照。

1.2.6檢測(cè)gRNA效果 待胚胎發(fā)育至24 h后，分別收集對(duì)照組和顯微注射組胚胎各20枚，用FOREGENE Zebra Fish Direct PCR Kit(Cat.No.TP-01412)提取基因組，設(shè)計(jì)引物如下Forward-Primer:5′-AGTGAAGTTTCTCCTCCTGACG-3′Reverse-Primer: 5′-CTCAACTTTGATCATCAGCTGTG-3′。PCR，擴(kuò)增靶序列，送測(cè)序(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)確認(rèn)突變。如果測(cè)序峰圖顯示在靶位點(diǎn)附近，對(duì)照組為干凈的單一峰，而顯微注射組出現(xiàn)雙峰或套峰，則能確定該gRNA有效，可以造成斑馬魚(yú)NELL2a基因突變。

1.2.7篩選有可遺傳突變的NELL2a F0代斑馬魚(yú) F0代斑馬魚(yú)飼養(yǎng)至性成熟后(約3個(gè)月)即可進(jìn)行陽(yáng)性個(gè)體的篩選和傳代，取10～15條成魚(yú)與野生型成魚(yú)側(cè)交，注意此處需一對(duì)一交配，分別收集胚胎，單獨(dú)培養(yǎng)。待胚胎發(fā)育至24 hpf后，即可每組隨機(jī)挑選10枚胚胎，低溫用研磨棒研磨，用Foregene(Zebra Fish Direct PCR Kit)提取基因組DNA，作為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，送測(cè)序。如果在靶位點(diǎn)附近測(cè)序峰圖出現(xiàn)雙峰或套峰，說(shuō)明該條魚(yú)的突變發(fā)生在原始生殖細(xì)胞，可遺傳到F1代。如果靶位點(diǎn)附近的測(cè)序峰圖為干凈的單一峰，說(shuō)明突變發(fā)生在體細(xì)胞，不能遺傳到F1代，則把該條魚(yú)淘汰。選取有可遺傳突變的F0代成魚(yú)與野生型斑馬魚(yú)側(cè)交，收集胚胎，標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)，用于篩選攜帶可遺傳突變的F1斑馬魚(yú)。

1.2.8獲得攜帶可穩(wěn)定遺傳的NELL2a雜合突變斑馬魚(yú)品系 將獲得的F1代斑馬魚(yú)飼養(yǎng)到1～2月齡，對(duì)每條魚(yú)分別剪尾鰭后，提取基因組DNA，作為模板，利用鑒定引物PCR擴(kuò)增后，送測(cè)序。剪尾鰭后的每條魚(yú)獨(dú)立養(yǎng)殖；如果在靶位點(diǎn)附近出現(xiàn)雙峰，說(shuō)明該條魚(yú)為NELL2a雜合突變。隨后可以將雜合突變的PCR產(chǎn)物，做TA克隆，確定每條魚(yú)的具體突變類型。選取可造成NELL2a基因移碼突變的F1代雜合(NELL2a+/-)成魚(yú)，與野生型斑馬魚(yú)側(cè)交，后代經(jīng)過(guò)剪尾鰭，測(cè)序篩選，獲得批量可穩(wěn)定遺傳的F2代NELL2a+/-斑馬魚(yú)。待F2代NELL2a+/-斑馬魚(yú)性成熟后，將雌魚(yú)與雄魚(yú)自交，獲得NELL2a純合突變斑馬魚(yú)(NELL2a-/-)。

1.2.9NELL2a-/-斑馬魚(yú)的聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位(AEP)檢測(cè) 采用斑馬魚(yú)AEP檢測(cè)水箱，應(yīng)用美國(guó)TDT公司RZ6儀器檢測(cè)和記錄15條4月齡斑馬魚(yú)的AEP，將斑馬魚(yú)分為2組：野生型(WT)斑馬魚(yú)，6條； NELL2a-/-斑馬魚(yú)9條。因?yàn)榘唏R魚(yú)聽(tīng)力最佳范圍在600～1 000 Hz[9]，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)頻率為600、800、1 000和2 000 Hz。

2 結(jié)果

2.1NELL2a基因在斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘表達(dá) 探針設(shè)計(jì)如下：NELL2a-ISH-up:CTTCAGTGCGAACGGAGAGT，NELL2a-ISH-down：CCGTGTTCGTCTATGCAGGT。原位雜交結(jié)果示NELL2a基因在斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘有表達(dá)(圖1)。

圖1 整胚原位雜交技術(shù)顯示NELL2a在側(cè)線神經(jīng)丘表達(dá) 圖中紅色箭頭所示

2.2gRNA靶位點(diǎn)選擇 根據(jù)gRNA設(shè)計(jì)要求，從候選序列中選擇第12Exon設(shè)計(jì)了gRNA的靶點(diǎn)，序列為5′-gGTCATGACTTCTGTG-3′。gRNA突變鑒定引物，F(xiàn)orward-Primer:(Nell2a-PF2)5′-AGTGAAGTTTCTCCTCCTGACG-3′，Reverse-Primer:(Nell2a-PR2)5′-CTCAACTTTGATCATCAGCTGTG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為473 bp，可通過(guò)PCR產(chǎn)物，送測(cè)序，檢測(cè)斑馬魚(yú)突變。

2.3gRNA效果檢測(cè) 分別收集F0代斑馬魚(yú)及對(duì)照組斑馬魚(yú)胚胎，提取基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，送測(cè)序發(fā)現(xiàn)gRNA有效(圖2)；同時(shí)收集足夠數(shù)量的胚胎，飼養(yǎng)用于篩選有可遺傳突變的F0代斑馬魚(yú)。

圖2 根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的gRNA設(shè)計(jì)有效

2.4獲得穩(wěn)定遺傳的NELL2a+/-斑馬魚(yú) F1代斑馬魚(yú)經(jīng)TA克隆，篩選出三種可遺傳的NELL2a基因突變類型，分別為基因組缺失4個(gè)堿基(Δ4)的一種和2種基因組缺失2個(gè)堿基(Δ2)的NELL2a+/-突變(圖3)。Δ4缺失4個(gè)堿基，導(dǎo)致后面的閱讀框移碼，并使得第17號(hào)外顯子上編碼纈氨酸的密碼子突變成終止密碼子，造成整個(gè)蛋白質(zhì)翻譯提前終止，原有蛋白功能喪失，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除的目的(圖3a)。Δ2缺失2個(gè)堿基，導(dǎo)致后面的閱讀框移碼，并使得第18號(hào)外顯子上編碼異亮氨酸的密碼子突變成終止密碼子，造成整個(gè)蛋白質(zhì)翻譯提前終止，原有蛋白功能喪失，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除的目的(圖3b、3c)。

圖3 通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)獲得3種基因突變雜合子 a. ΔTGCG4堿基缺失雜合子; b. ΔGC 2堿基缺失雜合子; c. ΔCG2堿基缺失雜合子

2.5獲得穩(wěn)定遺傳的NELL2a-/-斑馬魚(yú) 將獲得的NELL2a+/-(ΔGC)的斑馬魚(yú)自交，胚胎養(yǎng)至≥2月，剪尾鰭，提取基因組DNA，送測(cè)序，獲得NELL2a-/-純合突變斑馬魚(yú)(圖4)。NELL2a-/-成魚(yú)與野生型斑馬魚(yú)側(cè)交得到的NELL2a+/-(ΔGC)、NELL2a-/-成魚(yú)自交獲得NELL2a-/-(ΔGC)表型均和野生型無(wú)異(圖5)。

圖4 剪尾鰭測(cè)序 提示獲得NELL2a-/-純合突變斑馬魚(yú)

圖5 2dpf斑馬魚(yú)內(nèi)耳發(fā)育 a. AB品系; b. NELL2a+/-(ΔGC); c. NELL2a-/-(ΔGC)

將獲得的NELL2a+/-(ΔTGCG)的斑馬魚(yú)自交，胚胎在24 hpf內(nèi)和野生型表型無(wú)明顯差異，24 hpf后后代出現(xiàn)畸形，包括體軸彎曲、心肌包水及耳石異常(圖6、7)，胚胎發(fā)育至3 dpf開(kāi)始死亡，7 dpf幾乎完全死亡，因此無(wú)法獲得NELL2a-/-(ΔTGCG)純合子。

圖6 野生型及NELL2a+/-(ΔTGCG)斑馬魚(yú)的發(fā)育過(guò)程 左圖示野生型斑馬魚(yú)發(fā)育過(guò)程;右圖示NELL2a+/-(ΔTGCG)斑馬魚(yú)發(fā)育,可見(jiàn)從48 hpf開(kāi)始出現(xiàn)畸形

圖7 NELL2a+/-(ΔTGCG)斑馬魚(yú)胚胎畸形 a.尾巴嚴(yán)重畸形,心肌嚴(yán)重包水,2個(gè)耳石; b.心肌包水,3個(gè)耳石; c.心肌正常,2個(gè)耳石; d.心肌輕度包水,3個(gè)耳石; e.心肌嚴(yán)重包水,3個(gè)耳石; f.心肌嚴(yán)重包水,1個(gè)耳石(圖中紅色箭頭示心肌異常部位,藍(lán)色箭頭示耳石異常部位)

2.6斑馬魚(yú)的AEP檢測(cè)結(jié)果 NELL2a-/-斑馬魚(yú)在600、800、1 000和2 000 Hz聲刺激頻率，其AEP的閾值均顯著高于野生型斑馬魚(yú)(表1)。

表1 不同品系斑馬魚(yú)各頻率AEP閾值

3 討論

聽(tīng)神經(jīng)病的病因很廣泛，致病機(jī)理尚不明確，可以有先天或后天的原因，可能包括早產(chǎn)、高膽紅素血癥、缺氧、先天性腦異常、耳毒性藥物暴露和遺傳因素等[10]，亟待建立動(dòng)物模型，進(jìn)行進(jìn)一步研究。有研究對(duì)ANSD家系患者進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)NELL2基因的45 097 607位堿基發(fā)生雜合突變，同時(shí)基因庫(kù)的數(shù)據(jù)也顯示內(nèi)耳存在NELL的表達(dá)。NELL2是一種特異性的分泌型的糖蛋白，由神經(jīng)元分泌，在神經(jīng)元的分化中起到重要作用；已有的研究證實(shí)NELL2在谷氨酸神經(jīng)元上表達(dá)較多，谷氨酸神經(jīng)元通過(guò)谷氨酸受體發(fā)揮作用，這種調(diào)節(jié)機(jī)制也存在于聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)中[11]。對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)NELL2在耳蝸結(jié)構(gòu)成熟與發(fā)育過(guò)程中起到重要作用，隨著發(fā)育的進(jìn)行，Corti器上的NELL2蛋白逐漸積累[12]。上述研究結(jié)果表明NELL2在內(nèi)耳及聽(tīng)力發(fā)育過(guò)程及生理功能中起重要作用，因此建立NELL2a的基因突變模型對(duì)研究其在聽(tīng)力發(fā)育及障礙中的作用至關(guān)重要。

斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)(lateral line system，LL)是由皮膚衍生的機(jī)械感受器官，具有感覺(jué)周圍環(huán)境中的水流、強(qiáng)度以及方向等功能，便于探測(cè)到身體不同區(qū)域水流的差異[13]。側(cè)線系統(tǒng)以神經(jīng)丘為基本單位，分為前部側(cè)線系統(tǒng)和后部側(cè)線系統(tǒng)，成熟的神經(jīng)丘包括位于中間的功能性毛細(xì)胞和周圍的支持細(xì)胞及mentle 細(xì)胞構(gòu)成[14, 15]，側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞幾乎相同，都是通過(guò)立體纖毛的偏轉(zhuǎn)來(lái)感知運(yùn)動(dòng)[16]，是研究毛細(xì)胞發(fā)育、凋亡及再生的重要模型。NELL2 mRNA在大鼠胚胎期主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，出生后主要表達(dá)在腦組織的神經(jīng)元內(nèi)，與粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相伴存在[17]，其功能可以參與神經(jīng)生長(zhǎng)與分化，參與突觸的形成和囊泡釋放以及下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的分泌[18]。

本研究通過(guò)整胚原位雜交技術(shù)，證明了NELL2基因在斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘有表達(dá)；通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，獲得了2種2 bp缺失(ΔGC、ΔCG)，1種4 bp缺失(ΔTGCG)，3種均導(dǎo)致基因移碼突變，使翻譯提前終止，蛋白喪失原有的功能。然而2 bp缺失斑馬魚(yú)仔魚(yú)內(nèi)耳發(fā)育正常，4 bp缺失斑馬魚(yú)則出現(xiàn)體軸彎曲、心肌包水及耳石異常等畸形，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步探討。