高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法分析海鱸肌肉磷脂組成

王 霞，林婉玲，李來好，吳燕燕，楊少玲，黃 卉, 楊賢慶，林 織

(1.中國水產科學研究院 南海水產研究所，國家水產品加工技術研發(fā)中心，農業(yè)農村部水產品加工重點實驗室，廣州 510300； 2.廣東藥科大學 公共衛(wèi)生學院，廣州 510006； 3.廣東順欣海洋漁業(yè)集團有限公司，廣東 陽江 529800)

海鱸(Lateolabraxjaponicus)又稱鱸魚、花寨和板鱸，分布于渤海至南海近岸及通海的江河水域，生長周期快、適應性廣，是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類[1]。海鱸肉質鮮美、清香，含有豐富的蛋白質和微量元素[2-3]，此外還含有豐富的磷脂。磷脂是生物膜的重要組成部分，作為膜的結構物質和功能單位，以規(guī)律的結構保證細胞的正常形態(tài)和功能，還是脂類依賴性酶類起催化作用時不可缺少的物質。衰老和多種結構的改變也與膜磷脂的改變有關。磷脂的補充在抗衰老，防治動脈粥樣硬化、肝硬化、皮膚病、血液病，調節(jié)血糖，促進骨折愈合，調節(jié)神經功能及開發(fā)智力等方面均有較強的作用[4-5]。目前，有關海鱸的研究主要集中在產品加工工藝[6-7]、理化特性[8]、飼料喂養(yǎng)[9-10]、副產品加工[11]和基本營養(yǎng)成分[12-13]等方面。而對于海鱸磷脂方面的研究較少，缺少海鱸磷脂組成檢測方法的研究，不利于海鱸的進一步開發(fā)利用。

目前，關于磷脂檢測的常用方法有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和核磁共振法(NMR)[14]。TLC適用于不同類別間磷脂的分離，簡便、直觀，但預處理比較煩瑣、耗時，對準確度影響較大。HPLC可以用于磷脂類別間和類別內的分離，有利于復雜樣本的定性和定量分析[15]。NMR可以定性定量分析，具有快速、準確性高的優(yōu)點，但是樣本用量較大[16]。目前，HPLC是磷脂定性定量研究的主要方法。由于磷脂結構中包含1個極性的磷酸頭部基團和1～2個非極性脂肪?；膊炕鶊F，且根據極性頭部基團的差異，磷脂呈現不同種類[17]，等度洗脫難以完全分離，梯度洗脫較適合于磷脂分離，會獲得較好的峰形和分離度，紫外和示差折光檢測器不適合梯度洗脫，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)能消除因梯度洗脫和流動相給分析檢測帶來的影響[14]。常用的流動相有正己烷-異丙醇-乙酸和氯仿-甲醇-水/氨水兩種體系，其中氯仿-甲醇-水/氨水體系噪聲信號較高，不適合ELSD檢測，應選擇正己烷-異丙醇-乙酸體系[18]。因此，本實驗以海鱸為研究對象，選擇高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法，采用正己烷-異丙醇-乙酸體系，梯度洗脫，對海水魚海鱸肌肉磷脂組成進行分析測定，以期為海鱸的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

海鱸(1.8 kg)，廣州市南沙市場；溶血磷脂酰乙醇胺(LPE，純度>99%)、磷脂酰乙醇胺(PE，純度>98%)、磷脂酰絲氨酸(PS，純度>98%)、磷脂酰肌醇(PI，純度>98%)、磷脂酰膽堿(PC，純度>98%)、鞘磷脂(SM，純度≥98%)、溶血磷脂酰膽堿(LPC，純度>98%)，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，美國Sigma公司；正己烷、異丙醇均為色譜純，廣州華嶼欣實驗器材有限公司；氯仿、甲醇、丙酮均為分析純，東莞市宏都化工有限公司。

1.1.2 儀器與設備

LC-20AD高效液相色譜儀、ELSD-LTⅡ蒸發(fā)光散射檢測器、QP2010 plus氣相色譜-質譜(GC-MS)聯(lián)用儀，日本島津公司；BS 224S電子天平，德國Sartorius公司；TDZ5-WS臺式低速離心機，中國湖南湘儀離心機公司；氮吹儀，美國Organmation公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海鱸肌肉脂類物質的提取

取新鮮海鱸的可食用部分肌肉，去皮后用生理鹽水沖洗，均質機打碎后待處理。按照Folch等[19]的方法，使用氯仿-甲醇法提取脂質。精密稱取絞碎魚肉放入50 mL離心管中，加入15 mL氯仿-甲醇(體積比2∶1)溶液(含0.01%BHT)，在冰浴條件下用均質機均質2次(10 000 r/min，2×15 s，間隔30 s)，再加入15 mL氯仿-甲醇溶液，然后靜置1 h后過濾，將全部濾液移到已知質量的離心管中，加入0.2倍體積的0.85%生理鹽水，然后用離心機進行離心(3 000 r/min，15 min)，將分離的下層脂質溶液通過氮吹進行濃縮，冷卻至恒重稱量，得到海鱸肌肉脂類物質，計算其粗脂肪含量。

1.2.2 海鱸肌肉磷脂的純化

使用氯仿-甲醇法提取的脂類物質，一般為結合態(tài)脂類，除含有磷脂外，還有糖脂、膽固醇及膽固醇酯等物質，會干擾磷脂檢測，所以樣品在進行分析前需要純化。因為磷脂難溶于丙酮，因此將丙酮(4℃)加入脂類物質中，離心(4 000 r/min，7 min)除去上清液，反復多次，直至上清液無色，然后氮氣吹干后得到海鱸肌肉磷脂，于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 海鱸肌肉磷脂脂肪酸組成分析

將三氟化硼-甲醇溶液加入海鱸肌肉磷脂進行甲酯化后，根據GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》，測定樣品磷脂脂肪酸組成。

1.2.4 海鱸肌肉磷脂組成測定

1.2.4.1 標準曲線的繪制

PE、PI、PS、PC、SM、LPC和LPE 7種標準品配制前儲存在-20℃，配制(PI和LPE用氯仿溶解，其他用甲醇溶解)后放在4℃保存。將PE、LPE、PS、PI、PC、LPC和SM標準溶液分別單獨進樣進行HPLC-ELSD分析，記錄各個標準品的出峰時間，依據保留時間對磷脂標準品進行定性。稀釋不同質量濃度的混合標準品，從低質量濃度到高質量濃度進樣，每個樣品重復進樣3次，以各個標準品質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4.2 HPLC-ELSD分析條件

HPLC條件：Chromolith?Performance-Si 型正相硅膠色譜柱(100 mm×4.6 mm)；流動相A為正己烷(0.04%的三乙胺)，流動相B為異丙醇，流動相C為13%的乙酸溶液；柱溫箱溫度30℃；進樣量20 μL[18]；采用三元梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1[20]。

表1 梯度洗脫程序

ELSD條件：霧化氣體為氮氣，氣體壓強320 kPa，漂移管溫度70℃。

1.2.4.3 樣品測定

取適量海鱸肌肉磷脂樣品，溶解于甲醇，經 0.22 μm有機相濾膜過濾進樣品瓶，按1.2.4.2進行HPLC-ELSD分析。以保留時間定性，將各峰面積代入標準曲線方程中，計算海鱸肌肉磷脂各組成含量。

1.2.5 數據處理

每個樣品有3個平行，結果均表示為“平均值±標準差”，并用Excel軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 海鱸肌肉粗脂肪含量與磷脂脂肪酸組成

采用氯仿-甲醇法提取脂質，得到海鱸肌肉粗脂肪含量為(10.86±0.73)%。海鱸肌肉磷脂脂肪酸組成及相對含量見表2。

表2 海鱸肌肉磷脂脂肪酸組成及相對含量

由表2可知，海鱸肌肉磷脂中含有10種脂肪酸，主要有棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸(DHA)，其中二十碳五烯酸(EPA)和DHA總含量占總脂肪酸的30.86%。EPA和DHA能夠降低心血管疾病發(fā)生的概率，可改善視力，能夠有效降低重度抑郁癥和躁郁癥的發(fā)病率[21]。海鱸肌肉磷脂中含有大量的不飽和脂肪酸，占總脂肪酸的62.59%。不飽和脂肪酸能夠對心血管系統(tǒng)起到積極作用，如緩解血栓，且能夠增強記憶力以及預防阿爾茨海默病，還可以提高免疫力等[22-24]。海鱸肌肉磷脂脂肪酸能夠滿足人體營養(yǎng)需求，有較高的營養(yǎng)價值。

2.2 海鱸肌肉磷脂組成

2.2.1 磷脂標準曲線

7種磷脂混合標準品的HPLC-ELSD圖譜見圖1，海鱸肌肉磷脂的HPLC-ELSD圖譜見圖2。

由圖1及圖2可知，在本實驗的洗脫條件下，磷脂混合標準樣品和海鱸肌肉磷脂樣品均能達到基線分離，峰形良好，且海鱸肌肉磷脂中未檢出SM。按照1.2.4.1，繪制標準曲線，各磷脂標準曲線方程、線性范圍及相關系數見表3。

圖1 7種磷脂混合標準品的 HPLC-ELSD 圖譜

圖2 海鱸肌肉磷脂HPLC-ELSD圖譜

表3 磷脂標準曲線方程、線性范圍及相關系數(R2)

由表3可知，磷脂各組分質量濃度與峰面積線性關系良好，相關系數大于0.99。PE、LPE、PI的線性范圍分別為0.4～2.0 mg/mL、0.3～1.5 mg/mL和0.08～0.4 mg/mL。PS、PC、SM、LPC的線性范圍均為0.1～0.5 mg/mL。

2.2.2 精密度實驗

磷脂混合標準品重復進樣3次，得出各磷脂組分相應峰面積的平均值和變異系數，結果見表4。

表4 磷脂標準品峰面積的精密度

由表4可知，磷脂標準品各組分峰面積變異系數均小于3%,重現性好。

2.2.3 回收率實驗

稱取相同質量的海鱸肌肉4份，每份3 g。其中3份加入已知質量的磷脂標準品，1份不加，渦旋處理，配成新樣品，根據1.2.1和1.2.2方法制備海鱸肌肉磷脂樣品，按1.2.4.3進行測定，每份樣品平行測定3次，計算磷脂加標回收率，結果見表5。

表5 磷脂的加標回收率

從表5可以看出，7種磷脂加標回收率范圍在86.00%～105.00%，相對標準偏差(RSD)小于3.50%，有較好的準確度。

2.3 海鱸肌肉磷脂組成(見表6)

從表6可以看出，海鱸肌肉包含6種磷脂組分，其含量高低順序為PE>PC>PI>LPE>LPC>PS，SM未檢出。PE具有抗氧化作用，可用于美容、保護心血管等；PC是重要的膜結構成分，具有特有的生物活性和生理功能，能夠促進和改善大腦組織和神經系統(tǒng)的功能，提高記憶力，防治老年癡呆，治療潰瘍性結腸炎等[25-26]。

3 結 論

通過高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定海鱸肌肉磷脂組成，選擇流動相正己烷-異丙醇-乙酸體系得到的峰形良好，能夠完全分離，且精密度和加標回收率滿足實驗要求，其中精密度高，變異系數均小于3%，加標回收率為86.00%～105.00%，相對標準偏差小于3.50%，能夠快速、高效檢測磷脂組成。本實驗方法對于海水魚磷脂測定，分離效果良好，可運用于其他海水魚磷脂組分測定。

海鱸肌肉磷脂不飽和脂肪酸含量為62.59%，EPA和DHA總含量達30.86%，海鱸肌肉中共檢出6種磷脂組分，其中PE、PC和PI含量較高，可對人體健康起到積極作用，利于人體均衡膳食攝入。