新疆打瓜籽油中亞油酸的尿素包合純化工藝研究

胡 力，王芳梅，王 偉，艾合買提江，王 亮

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046； 2.江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210007)

打瓜(Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum. et Nakai)，又名籽瓜，為葫蘆科一年生草本植物，是西瓜的一個(gè)栽培變種[1]，主產(chǎn)于新疆、甘肅，吉林和內(nèi)蒙古等地也有種植[2]，因含籽多而得名。打瓜籽含油率可達(dá)到50%，油中富含不飽和脂肪酸亞油酸[3]。亞油酸具有多種生理活性，并在降血脂、降血壓等方面有獨(dú)特的藥理活性。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于打瓜籽油的研究主要集中在提取工藝及功效研究等方面[3-9]，對(duì)于打瓜籽油中不飽和脂肪酸的純化工藝研究鮮有報(bào)道。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)多不飽和脂肪酸進(jìn)行分離的方法有超臨界流體萃取法[10]、分子蒸餾法[11-12]、低溫結(jié)晶法[13]、色譜法[14-15]、尿素包合法[16-19]等。其中，尿素包合法是混合脂肪酸純化較常用的方法，因具有操作簡(jiǎn)單、溶劑可回收、純化成本低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。

本文采用尿素包合法純化打瓜籽油中的亞油酸，制備高純度亞油酸，有利于提高打瓜籽油產(chǎn)品的附加值，延長(zhǎng)打瓜籽油產(chǎn)業(yè)鏈，可為新疆打瓜籽的深入開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

打瓜籽油，由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)超聲波輔助溶劑提取所得。

95%乙醇、氫氧化鈉、石油醚、濃鹽酸、尿素、氯化鈉、環(huán)己烷、冰乙酸、韋氏試劑、碘化鉀、可溶性淀粉、五水硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、無水硫酸鈉，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FA1004電子天平；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；MJX-250B-Z型霉菌培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；安捷倫7890A氣相色譜儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 混合脂肪酸的制備

參照李開雄等[20]的方法，略作調(diào)整。精確稱取25 g打瓜籽油，加入100 mL 4%氫氧化鈉乙醇溶液，85℃水浴回流皂化1 h，冷卻至室溫，加一定量的蒸餾水使皂化物完全溶解，加入石油醚萃取。取下層，再加入適量石油醚進(jìn)行萃取，除去不皂化物，分液，棄去石油醚層。下層加入10%鹽酸調(diào)pH至2～3，待可明顯看見油層和水層，置于分液漏斗中分層，棄水層，油層用蒸餾水洗至中性，加無水硫酸鈉干燥脫水，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到混合脂肪酸。

1.2.2 尿素包合法富集打瓜籽油中亞油酸

參考趙萍等[21]的方法，略作調(diào)整。將95%乙醇與尿素按一定體積質(zhì)量比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)混合后，高溫回流，使得尿素全部溶解，加入一定量的混合脂肪酸(尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比為1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1)，80℃下水浴回流30 min，冷卻至室溫。在一定溫度(-20、4、20、30、40℃)下包合一定時(shí)間(6、12、18、24、30 h)后，抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氯化鈉溶液水洗至下層溶液澄清透明無尿素，加無水硫酸鈉干燥脫水，即得亞油酸。按下式計(jì)算亞油酸得率。

得率=產(chǎn)物質(zhì)量/混合脂肪酸質(zhì)量×100%

產(chǎn)物碘值采用 GB/T 5532—2008測(cè)定，作為亞油酸純度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù) 3 次，結(jié)果用“平均值 ± 偏差”表示。運(yùn)用 Graphpad Prism 5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞油酸富集單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇與尿素體積質(zhì)量比對(duì)亞油酸富集的影響

在尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比1.5∶1、包合溫度20℃、包合時(shí)間12 h條件下,考察乙醇與尿素體積質(zhì)量比對(duì)亞油酸碘值及得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇與尿素體積質(zhì)量比對(duì)亞油酸碘值及得率的影響

由圖1可知，隨著乙醇與尿素體積質(zhì)量比的增加，尿素在乙醇中的溶解度增加，尿素與脂肪酸有更多的接觸機(jī)會(huì)，從而提高了尿素包合的程度。因此，更多的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸被包合，從而得到更高純度的亞油酸，碘值上升。但是當(dāng)乙醇增加到一定量后,碘值有所下降，其原因可能是因?yàn)槿軇┝窟^大，尿素包合反應(yīng)向逆反應(yīng)方向進(jìn)行，對(duì)飽和、單不飽和脂肪酸的包合程度下降，導(dǎo)致碘值下降[22]。隨著乙醇與尿素體積質(zhì)量比的增加，亞油酸更容易溶解在乙醇中，而被分散系中黏稠絡(luò)合物非選擇性包合的可能性減小，因此亞油酸得率顯著升高后趨于穩(wěn)定[23]。綜合考慮，選取乙醇與尿素體積質(zhì)量比3∶1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比對(duì)亞油酸富集的影響

在乙醇與尿素體積質(zhì)量比3∶1、包合溫度20℃、包合時(shí)間12 h條件下,考察尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比對(duì)亞油酸碘值及得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比對(duì)亞油酸碘值及得率的影響

由圖2可知，隨著尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比的增加，尿素比例升高，反應(yīng)中尿素的包合程度增大，從而使得亞油酸純度升高，碘值上升。亞油酸得率隨尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比增大先增加后降低。隨著尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比逐漸升高，整個(gè)反應(yīng)體系中乙醇與脂肪酸的比例也在不斷擴(kuò)大，亞油酸更容易溶解在乙醇中，而被分散系中黏稠絡(luò)合物非選擇性包合的可能性減小，因此亞油酸得率呈逐漸上升趨勢(shì)，但是隨著尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比進(jìn)一步升高，尿素非特異性包合程度增大，即部分亞油酸也被包合，導(dǎo)致得率降低[24]。綜合考慮，選取尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比2.5∶1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 包合溫度對(duì)亞油酸富集的影響

在尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比2.5∶1、乙醇與尿素體積質(zhì)量比3∶1、包合時(shí)間12 h條件下,考察包合溫度對(duì)亞油酸碘值及得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 包合溫度對(duì)亞油酸碘值及得率的影響

由圖3可知，隨包合溫度升高，碘值和得率先升高后降低。包合溫度過低，尿素形成包合物晶體速度過快，反應(yīng)不充分，導(dǎo)致亞油酸純度即碘值較低，同時(shí)由于溫度過低使得混合反應(yīng)物變得濃稠，使抽濾困難，增加濾液中混合脂肪酸的損失，得率也不高。隨著包合溫度的升高，反應(yīng)逐漸充分，碘值和得率逐漸升高，包合溫度為20℃時(shí)碘值、得率均達(dá)到最大； 隨著包合溫度進(jìn)一步升高，碘值明顯降低，得率略有降低。尿素包合物的形成是一個(gè)放熱過程，在一定范圍內(nèi)，溫度降低時(shí)反應(yīng)向生成尿素包合物的方向進(jìn)行，有利于生成包合物，而溫度過高，非選擇性包合增加，導(dǎo)致碘值、得率降低。綜合考慮，選取包合溫度20℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 包合時(shí)間對(duì)亞油酸富集的影響

在尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比2.5∶1、乙醇與尿素體積質(zhì)量比3∶1、包合溫度20℃條件下，考察包合時(shí)間對(duì)亞油酸碘值及得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 包合時(shí)間對(duì)亞油酸碘值及得率的影響

由圖4可知，亞油酸的碘值隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在包合時(shí)間18 h時(shí)達(dá)到最大，原因是由于在短時(shí)間內(nèi)尿素包合物沒有充分形成，不能完全包合飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸，碘值較低，當(dāng)包合時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，包合效果越來越好，碘值逐漸增大，但隨著包合時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，包合反應(yīng)達(dá)到平衡，有一部分不飽和脂肪酸也會(huì)被帶入到包合相，造成碘值下降。隨著反應(yīng)時(shí)間的適當(dāng)延長(zhǎng)，包合產(chǎn)物發(fā)生一定程度的沉降，有利于與亞油酸的分離，得率升高；但反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，由于尿素包合的選擇性變差，部分亞油酸被包合，得率降低。綜合考慮，選取包合時(shí)間15 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 亞油酸富集響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以包合溫度、包合時(shí)間、乙醇與尿素體積質(zhì)量比、尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比為考察因素，以樣品的綜合評(píng)分(綜合評(píng)分=該方案亞油酸得率/所有方案中最高的亞油酸得率×50+該方案樣品碘值/所有方案中最高碘值×50)為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)分析。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到樣品的碘值和得率綜合評(píng)分(Y)對(duì)各因素的二次多元回歸方程:

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 回歸方程模型方差分析

Y=94.06+1.90A+2.03B+10.12C+3.70D+0.51AB-2.59AC+0.72AD-4.04BC-0.58BD-1.15CD-0.88A2-1.25B2-7.48C2-5.09D2

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)模型進(jìn)行計(jì)算，得到最優(yōu)的純化工藝條件為：包合時(shí)間13.3 h，包合溫度4.24℃，乙醇與尿素體積質(zhì)量比4∶1，尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比2.63∶1。在最優(yōu)工藝條件下，尿素包合法純化打瓜籽油亞油酸產(chǎn)品的綜合評(píng)分為98.21。

為試驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性，將最優(yōu)工藝修正為：包合時(shí)間13 h，包合溫度4℃，乙醇與尿素體積質(zhì)量比4∶1，尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比3∶1。在修正條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到尿素包合法純化打瓜籽油亞油酸產(chǎn)品的綜合評(píng)分為96.33，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為1.91%，此時(shí)產(chǎn)物的碘值(I)為146.14 g/100 g，得率為46.55%。

2.3 尿素包合前后主要脂肪酸組成(見表4)

表4 尿素包合前后主要脂肪酸組成 %

由表4可看出，經(jīng)過尿素包合后，絕大多數(shù)的飽和脂肪酸被除去，亞油酸含量由72.910%升高至97.249%，亞油酸含量顯著提高。

3 結(jié) 論

本文采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)尿素包合法純化打瓜籽亞油酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到的尿素包合法富集打瓜籽油亞油酸最優(yōu)工藝條件為：包合時(shí)間13 h，包合溫度4℃，95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比4∶1，尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比3∶1。在最優(yōu)工藝條件下，亞油酸產(chǎn)物的碘值(I)為146.14 g/100 g，得率為 46.55%。氣相色譜分析表明，經(jīng)尿素包合后，產(chǎn)物中主要脂肪酸為油酸和亞油酸，含量分別為1.362%、97.249%，亞油酸含量較打瓜籽油(72.910%)明顯升高。