非洲豬瘟病毒CP204L基因的生物信息學(xué)分析、載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)

魯中爽，許會會，蔡維北，武 悅，楊蓮花，王澤宇，王 楠，徐一鳴

（1.吉林和元生物工程技術(shù)創(chuàng)新研究開發(fā)有限公司，吉林 長春 130102；2.吉林元和元生物工程有限公司，吉林 長春 130102；3.吉林省動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長春 130102；4.吉林省畜牧獸醫(yī)工作總站，吉林 長春 130102）

【研究意義】非洲豬瘟?。ˋfrican swine fever，ASF）是一種由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）導(dǎo)致的，能引起豬高度致死（死亡率可達(dá)100%）的急性傳染?。?-2］。我國是全球豬肉消費大國，養(yǎng)殖生豬總量占世界的50%，但我國養(yǎng)豬條件存在許多生物安全問題［3］。ASF由俄羅斯蔓延到我國，2018年8月我國首次報告ASF疫情［4-6］，之后ASF在我國多地迅速傳播，疫情形勢嚴(yán)峻復(fù)雜，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重打擊。由于ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜且容易變異［7-10］，至今還未有有效的ASF疫苗，因此掌握精確的ASF診斷方法顯得尤為重要。

【前人研究進(jìn)展】ASFV是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒，也是唯一的蟲媒DNA病毒［11］。研究證實，ASFV擁有龐大的基因組，基因組長約160～190 kb，含有約150個開放閱讀框，編碼160多種蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白50多種，如編碼病毒抗原表位的常見結(jié)構(gòu)蛋白P72（B646L）、P30（CP204L）、P54（E183L） 等［11-13］。ASFV 是通過細(xì)胞內(nèi)化作用進(jìn)入自然感染的細(xì)胞中的，P30抗原蛋白也可能參與了病毒的內(nèi)化作用而進(jìn)入細(xì)胞中。P30蛋白是由CP204L調(diào)控基因編碼的磷酸蛋白［13］，該蛋白在病毒感染早期，氨基末端絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化后被包進(jìn)病毒粒子中。由于P30蛋白有良好的免疫原性，在動物體中容易產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生含量較高的抗體［14-16］，因此P30蛋白常被用做血清學(xué)診斷。

【本研究切入點】目前診斷和監(jiān)測ASFV感染豬群的重要方法是血清學(xué)檢測法。由于ASFV基因組較龐大，通過針對保守性、特異性好的蛋白進(jìn)行血清學(xué)檢測，才能更快、更有效、更準(zhǔn)確地實現(xiàn)診斷和監(jiān)測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】P30蛋白為穩(wěn)定蛋白，前人研究表明該蛋白是膜相關(guān)抗原蛋白，參與病毒內(nèi)化，具有較好的診斷抗原性。本研究以P30抗原蛋白作為血清學(xué)診斷試劑的主要研究蛋白，為后期ASFV感染后提供血清學(xué)檢驗基礎(chǔ)。以編碼P30蛋白的CP204L保守基因作為研究對象，并通過生物信息學(xué)分析，構(gòu)建表達(dá)重組載體及誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，為P30蛋白的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ASFV基因組由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良實驗室惠贈。pET-32a（+）、pEASY-T5 Zero Cloing Kit、2×Rapid Taq Master Mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司；E. coliDH5α、Rosetta（DE3）、xHoⅠ、EcoRⅠ、T4DNA Ligase、Maker購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒試劑盒、膠回收試劑盒購于康寧生命科學(xué)有限公司。

1.2 基因克隆

根據(jù)NCBI中CP204L基因序列（登錄號：MN172368.1）設(shè)計特異性引物（CP204L-F：CCGGAATTC ATGGATTTTATTTTAAATATATCC，CP204L-R：CCGCTCGAG TTATTTTTTTTTTAAAA GTTTAAT），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司長春分公司合成。以ASFV基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL Mix，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，6 μL ddH2O，2 μL模板；PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性 15 s、58 ℃退火 15 s、72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)；72℃后延伸5 min。

1.3 克隆載體構(gòu)建與鑒定

對PCR擴(kuò)增出來的目的條帶進(jìn)行切膠，并用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，將回收的PCR產(chǎn)物片段連接pEASY-T5克隆載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)中并涂布在含有卡那抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8～10 h后對挑取單菌落搖菌，并進(jìn)行菌液PCR驗證，將驗證成功的菌液進(jìn)行測序比對。

1.4 生物信息學(xué)分析

采用TExpasy方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測；分別采用Tmpred、HMM方法對蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測；采用SignalP方法進(jìn)行信號肽預(yù)測；采用PSIPRED方法進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；采用SWISS-MODEL方法進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.5 重組表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

用xHoⅠ和EcoRⅠ將pET-32a（+）表達(dá)載體和pEASY-T5-CP204L克隆載體分別進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠，pET-32a（+）載體大片段和目的基因片段用凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物用T4DNA Ligase在16 ℃下過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，在含卡那抗性的LB培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)，進(jìn)行抗性篩選，挑取單菌落進(jìn)行搖菌提質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗證、雙酶切驗證及測序比對驗證。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的重組載體pET-32a（+）-CP204L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，次日挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，次日取200 μL菌液接種于20 mL含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，加入1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8 h，收集菌液。

1.7 重組蛋白的SDS-PAGE電泳鑒定

將收集的菌液在12 000 r/min條件下離心1 min，收集菌體，用PBS沖洗2次后進(jìn)行超聲破碎10 min，期間超聲破碎10 s、間歇10 s，重復(fù)進(jìn)行，電壓220 V，10 000 r/min離心后分別取上清和沉淀，將沉淀用PBS重懸后重新稀釋，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因擴(kuò)增

利用特異性引物進(jìn)行CP204L基因擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在585 bp處有明亮的條帶（圖1），結(jié)果與預(yù)期相符。

圖1 CP204L基因克隆結(jié)果Fig. 1 Cloning result of CP204L gene

2.2 克隆載體構(gòu)建及鑒定

圖2 菌液PCR驗證Fig. 2 PCR verification of bacterial solution

將目的基因PCR產(chǎn)物用DNA產(chǎn)物凝膠回收試劑盒回收，將目的基因片段與pEASY-T5載體連接并轉(zhuǎn)化，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR驗證，將圖2目的條帶的菌液送往上海生工有限公司測序。使用DNAMAN軟件對測序結(jié)果與CP204L基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示測序結(jié)果與CP204L基因序列同源性為100%，證明CP204L基因與克隆載體連接成功。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 蛋白理化性質(zhì) TExpasy在線預(yù)測分析結(jié)果顯示，CP204L基因編碼195個氨基酸，序列如下：

MDFILNISMK MEVIFKTDLR

SSSQVVFHAG SLYNWFSVEI

INSGRIVTTA IKTLLSTVKY

DIVKSARIYA GQGYTEHQAQ

EEWNMILHVL FEEETESSAS

SENIHEKNDN ETNECTSSFE

TLFEQEPSSE VPKDSKLYML

AQKTVQHIEQ YGKAPDFNKV

IRAHNFIQTI YGTPLKEEEK

EVVRLMVIKL LKKK*

P30蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為34.12，為穩(wěn)定蛋白；總親水性平均值為0.739，為親水蛋白。

2.3.2 蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測 基于對Tmbase數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計分析預(yù)測P30蛋白的跨膜區(qū)和跨膜方向，用Tmpred法分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)，結(jié)果（圖3）顯示，P30蛋白TM-螺旋長度都在17～33之間；基于HMM方法預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)，圖4顯示TMH數(shù)量為0，P30蛋白為非跨膜蛋白。

2.3.3 蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測 采用SignalP在線軟件對P30蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果（圖5）顯示，基因編碼的P30蛋白在編碼區(qū)內(nèi)均無有信號肽信號，說明該蛋白不是分泌性蛋白。

圖3 Tmpred法蛋白跨膜域分析Fig. 3 Transmembrane domain analysis of protein by Tmpred method

圖4 HMM法蛋白跨膜域分析Fig. 4 Transmembrane domain analysis of protein by TMM method

圖5 P30蛋白信號肽分析Fig. 5 Analysis of protein signal peptide

2.3.4 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 PSIPRED法在線預(yù)測分析P30蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖6）顯示，該蛋白主要結(jié)構(gòu)由無規(guī)卷曲、α螺旋和β折疊組成。

2.3.5 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過SWISSMODEL在線預(yù)測P30蛋白質(zhì)同源建模結(jié)構(gòu)（圖7），無規(guī)則卷曲、α螺旋和β折疊是三級結(jié)構(gòu)的主要成分，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。

2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

用EcoRⅠ、xHoⅠ酶同時將構(gòu)建好的克隆載體和表達(dá)載體pET-32a（+）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖8、圖9）顯示，酶切產(chǎn)物可獲得目的基因片段和載體片段，將基因片段和線性載體大片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。

圖6 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析Fig. 6 Analysis of the secondary structure of protein

圖7 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig. 7 Prediction result of the tertiary structure of protein

用T4連接酶連接目的基因CP204L與pET-32a（+）載體大片段構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a（+）-CP204L并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，對轉(zhuǎn)化后的單菌落進(jìn)行菌液PCR驗證，對驗證成功的提取pET-32a（+）-CP204L質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果與目的基因序列一致，證明重組表達(dá)載體pET-32a（+）-CP204L構(gòu)建成功（圖10、圖11）。

2.5 P30蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測

圖8 CP204L基因克隆載體質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig. 8 Cloning vector plasmid of CP204L gene verified by double digestion

重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）-CP204L轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體超聲破碎，上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。由圖12可知，pET-32a（+）-CP204L以可溶形式在宿主菌中未表達(dá)，以質(zhì)溶形式在沉淀中有表達(dá)。蛋白分子質(zhì)量約為23.4 ku，與理論值相符。

圖9 pET-32a（+）表達(dá)載體質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig. 9 Identification of expression vector plasmid pET-32a（+）by double digestion

圖10 菌液PCR驗證Fig. 10 PCR verification of bacterial solution

圖11 pET-32a（+）-CP204L重組表達(dá)載體示意圖Fig. 11 Schematic diagram of pET-32a（+）-CP204L recombinant expression vector

圖12 P30蛋白SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig. 12 SDS-PAGE detection results of P30 protein

3 討論

ASF是一類發(fā)病機(jī)理和臨床癥狀極為復(fù)雜的傳染病，如不能及早發(fā)現(xiàn)和實施嚴(yán)格控制措施會迅速蔓延和持續(xù)傳播，將對社會造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［17-18,22］。ASF可根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理特點作出初步判斷，但最終需根據(jù)實驗室診斷結(jié)果進(jìn)行確診。雖然目前市場上沒有有效的疫苗，國內(nèi)外的研究人員也從未停止對非洲豬瘟的研究。吳競等［19］通過P30蛋白的原核表達(dá)建立了間接ELISA檢測方法；Alexandra等［20］對P30基因進(jìn)行CRISPR/Cas9靶向編輯后，有效抑制了ASFV病毒的復(fù)制；李杰等［5］將ASFV的P30-54融合蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，該重組蛋白可以與多克隆抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)；楊莎莎等［22］制備了非洲豬瘟pET-28a-P30單克隆抗體，為ASFV的診斷和致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

前人諸多研究表明，P30蛋白是ASFV中的關(guān)鍵蛋白，具有良好的反應(yīng)原性，吳競等［19］建立的ELISA檢測方法表明，克隆和表達(dá)P30蛋白可以用來監(jiān)測ASF疫情；Alexandra等［20］對P30蛋白重新編輯之后，抑制了ASFV蛋白的表達(dá)，因此可以通過調(diào)控P30蛋白來控制ASFV病毒的致病性；楊莎莎等［21］選用Georgia2007/1毒株基因組也成功構(gòu)建了單克隆抗體，更能判定P30蛋白的表達(dá)在建立間接ELISA方法應(yīng)用于監(jiān)測疫情是可行的，而且非常重要。前人的研究缺少在生物信息學(xué)方面進(jìn)行蛋白的分析，結(jié)合蛋白層面的分析能夠更好地了解蛋白及分析蛋白功能，這些對后期研究具有重要意義。本試驗對ASFV調(diào)控蛋白P30進(jìn)行了研究，在生物信息學(xué)層面對CAS19-01株病毒中的CP204L基因組進(jìn)行剖析，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建表達(dá)載體并誘導(dǎo)其成功表達(dá)P30蛋白，為制備檢測試劑盒做好準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

ASFV基因組可編碼的蛋白非常多，而且ASFV的免疫逃避機(jī)制復(fù)雜，使得非洲豬瘟疫苗的研發(fā)工作受阻。未來需要繼續(xù)深入研究ASFV的病原學(xué)、致病機(jī)理和免疫機(jī)制，才能更好地應(yīng)對疫情發(fā)生。目前非洲豬瘟疫苗開始進(jìn)入臨床階段，對疫病的抗體檢測迫在眉睫，為了加快自主研發(fā)的步伐，盡快研制出高效且靈敏的抗體檢測試劑盒尤為關(guān)鍵。本研究根據(jù)CAS19-01株病毒基因組成功克隆了在ASFV中穩(wěn)定存在、保守的CP204L基因，并成功構(gòu)建其表達(dá)載體pET-32a（+）-CP204L，通過用IPTG誘導(dǎo)8 h后成功表達(dá)蛋白，為制備ASF的抗體檢測試劑提供技術(shù)基礎(chǔ)。